Este trabajo fue financiado por el NIH subvención CA113734 adjudicado a F Yull y el Departamento de Asuntos de Veteranos (TS Blackwell).

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Cuidado de Animales institucional la Universidad de Vanderbilt y el empleo. 1. Preparación de ratones transgénicos <ol><li> Los ratones hembra, positivos para el transgén reportero NGL (N F-kappa B-G FP-L uciferase) (descrito anteriormente 1) se utilizan para este procedimiento. Cuando las hembras son por lo menos de 6 semanas de edad, los aparearse con un macho de tipo salvaje FVB. Harem reproducción pueden ser utilizados (hasta 4 hembras en una jaula con 1 macho). (Nota: ratones FVB cepa se utilizaron para el estudio actual más oscuros tales como ratones de la cepa C57BL6 también se pueden usar, pero estos ratones debe ser afeitado antes de la imagen.). </li><li> Comenzando a los 15 días post-apareamiento, las hembras comprobar regularmente para detectar signos de embarazo (circunferencia grande que sobresale). Cada mujer debe separarse una vez embarazada y el hombre retirado de la jaula de cría una vez que la última mujer queda embarazada. </li><li> Mira las hembras separadas unad anotar la fecha de nacimiento cuando una camada aparece. Una camada de al menos 6 cachorros se requiere para una lactancia adecuada. Ocho días después del nacimiento de la camada, proceder con el protocolo (ver Figura 1 para un esquema de línea de tiempo). </li></ol> 2. Preparación para inyección <ol><li> Disolver la E. coli LPS en PBS a una concentración final de 0,1 mg / l. 50 l de esta solución, o un total de 5 g, se inyecta en la glándula mamaria. Preparar un segundo tubo de PBS solo para ser utilizado para la inyección control. </li><li> Establecer un microscopio de disección y aparatos de anestesia con isoflurano. Un aparato de nariz de cono debe ser asegurado a la etapa del alcance de disección en la que se coloca el ratón. Una buena fuente de luz, ya sea desde el propio ámbito o de focos adicionales también deben estar preparados. </li><li> Una vez que la configuración se ha completado, en marcha la máquina isoflurano y flujo de aire. </li></ol> 3. Inyección intraductal de LPS <ol><li> Cargue la jeringa con aguja corta con 50 l de la solución de LPS. Establezca este lado. </li><li> Se anestesia el ratón para inyectar colocando primero la hembra en una caja llena de isoflurano y luego una vez la respiración se hace más lenta, trasladarla al escenario y colocar la nariz dentro de la nariz de cono. Utilice una pizca dedo para confirmar que el ratón es completamente anestesiado. Controlar la respiración del ratón durante todo el procedimiento y ajustar el nivel de isoflurano en consecuencia. La caja que contiene la camada de cachorros que la hembra ha sido tomado de debe ser cuidadosamente a un lado hasta que la presa puede ser devuelto después del procedimiento. </li><li> Utilice una pequeña gota de etanol al 70% para hacer la capa en posición plana y para ayudar a visualizar el pezón unido a la derecha # 4 de glándula mamaria inguinal en el abdomen inferior del ratón. </li><li> Enfocar el microscopio de disección para una visión óptima del pezón. Cuidadosamente utilizar un conjunto de pinzas finas para extraer aún más el pezón de la piel, pero no perfore ni lesionar el pezón de ninguna manera. Lafórceps nunca deben estar bien sujetos entre sí cuando la manipulación del tejido, sino que se utiliza con una bodega luz que requiere la mínima cantidad de tensión en el pezón. </li><li> Utilice las pinzas en la mano izquierda para sostener suavemente el pezón en su lugar. Poco a poco llevar la jeringa precargada en el campo visual usando la mano derecha. La jeringa debe mantener de manera que no tiene que ocurrir reposicionamiento con el fin de inyectar el contenido. </li><li> Una vez que la jeringa está a la vista, apuntar con cuidado a la pequeña abertura ductal en el centro de la boquilla, e insertar la jeringa. </li><li> Sin tener que reposicionar la mano, inyectar el contenido de la jeringa y retirar la aguja de la boquilla. </li><li> Cargar una segunda jeringa con 50 l de PBS para el control de la inyección. Vuelva a colocar el ratón sobre el escenario y la mejor vista de la izquierda # 4 pezón inguinal glándula mamaria en el otro lado de la parte baja del abdomen del ratón. Repita los pasos 3,4 a 3,7 utilizando la jeringa cargada con PBS. </li><li> Una vez que ambas inyecciones son complete, deje de anestesia y mover el ratón en una jaula de recuperación. Monitorear la hembra para asegurar que se hace móvil dentro de 5 min. Permitir el ratón para permanecer en la jaula de recuperación de 1 hr. Después de 1 hora de recuperación, coloque la hembra en la jaula con su camada de cachorros. Los ratones deben controlarse periódicamente durante 6 horas después de la inyección antes de proceder a la creación de imágenes. En nuestra experiencia, sin consecuencias adversas se observaron tanto en la hembra o las crías durante el período entre la inyección y formación de imágenes. Sin embargo, si se presentan signos de angustia se observan en las mujeres (por ejemplo, postura encorvada, morder o vigilancia de la zona de inyección, letargo general) o las crías (sin movimiento, color azulado de la piel), el experimento debe ser interrumpido. </li></ol> 4. Bioluminiscente de imágenes para Visualice la actividad NF-kB <ol><li> Una vez que los ratones han sido transportados a la facilidad de formación de imágenes, comenzar el procedimiento de formación de imágenes por abrir el software y la inicialización de la máquina. Encienda el esoflurane máquina y de flujo de aire, asegurando que la anestesia está fluyendo a través del cuadro y la cámara de formación de imágenes. </li><li> Coloque el ratón bajo anestesia isoflurano en el cuadro de anestesia claro. Una vez que la respiración se ha desacelerado, utilice una pizca dedo para confirmar que el ratón es completamente anestesiado. A continuación, se inyectan 100 l de sustrato de luciferina en el ratón por retro-orbital de inyección 5 utilizando una jeringa estéril. </li><li> Transferir inmediatamente el ratón a la imagen de la cámara y coloque la nariz bajo el isoflurano nariz de cono se encuentra allí. El ratón debe estar en decúbito supino. Asegure cada pie a los escenarios con una cinta. </li><li> De entrada de los ajustes adecuados en el software IVIS a tomar tanto una imagen en blanco luz fotográfica y una imagen de la actividad bioluminiscente. El tiempo de exposición debe ser de 10 seg. Adquirir la imagen. </li><li> Una vez que las imágenes han sido adquiridas, permitir el ratón para recuperarse y luego colocar la espalda en la jaula con sus cachorros y supervisar periódicamente. </li><li> La fotografía y luminiscentelas imágenes se superpone automáticamente y se visualiza en la pantalla, como en la Figura 2. Analizar las imágenes adquiridas mediante la colocación de la región de interés o &quot;ROI&quot; círculos de igual tamaño sobre cada lado de la parte inferior del abdomen del ratón (una sobre la glándula PBS-inyectado y una sobre la glándula inyectó LPS). Ajuste la lectura a los fotones. Un número se debe mostrar indicando la luminiscencia detectada dentro de cada ROI (ver Figura 2B). Utilice este número en el análisis estadístico. </li><li> Para mostrar la imagen óptima, además ajustar el umbral de la señal mostrada. Esto no va a alterar la luminosidad total de lectura, pero le permitirá eliminar la señal de fondo y visualizar las diferencias entre el control y la glándula tratado con LPS. Disminuir la cantidad de luminiscencia se muestra, hasta la glándula PBS-inyectado está libre de la señal de fondo. Esto debería dejar el aumento de la señal en la glándula tratado con LPS todavía aparente en la imagen, como se ve en la Figura 2. </li><li> Se dispone del análisis, incluyendo proteínas y los ensayos de ARN, se puede completar con tejido mamario obtenida de la mujer post-mortem 6. </li></ol> 5. Los resultados representativos Para obtener resultados interpretables de estos métodos, LPS (o PBS) debe ser infundida sólo en los conductos mamarios, dejando el tejido adyacente intacto. La inyección en el tejido subcutáneo que rodea el pezón dará lugar a inflamación debido a una lesión en lugar de la infección simulada. La inyección de colorante azul de tripano diluido en PBS es útil cuando el aprendizaje de la técnica. Figura 3A muestra una glándula con éxito inyecta infundido con 100 l de azul de tripano en PBS. Como se muestra, sólo el árbol ductal debe ser llenado con la solución inyectada, y no debería haber ningún bolo en el sitio de inyección. Un &quot;bolo&quot; en este contexto es una acumulación del líquido inyectado en el pezón o en el tejido que rodea el pezón sin infusión en el árbol ductal. Esto es SHpropio en la Figura 3B. Tenga en cuenta que las inyecciones de prácticas que se muestran en la Figura 3 se completaron en una hembra en el día 21 de lactancia. Durante la altura de la lactancia (días 8-10, la etapa en la que se inyecta LPS utilizando el protocolo de corriente), la leche es abundante y es difícil de visualizar los conductos y determinar si la inyección se ha completado correctamente. Por lo tanto, los puntos de tiempo después de la lactancia son mejores para las inyecciones de práctica. El éxito de la inyección de LPS en los resultados de los conductos mamarios en mayor actividad NF-kB dentro de la glándula. Esto debería ser evidente en el ratón reportero sobre IVIS formación de imágenes, y la glándula LPS-inyectado debe tener una actividad sustancialmente mayor de luciferasa (medida por conteo de fotones) que la glándula PBS inyectado, tal como se muestra en la Figura 2 (en promedio, la glándula LPS lee 200% de la señal de control de PBS). Un aumento estadísticamente significativo en la luminiscencia dentro de las glándulas tratadas con LPS como borradorared al control contralateral se logra a través de la finalización de un grupo de 4 ratones 4. Un estudio adicional se ha utilizado también la inyección intraductal de mama de cualquiera de E. coli o LPS a NF-kB reportero transgénicos. Al igual que en nuestro propio trabajo, estos autores observaron un aumento significativo en la actividad de reportero 6 horas después de que E. coli inyección 2. Tenga en cuenta que debido a la constitutiva NF-kB actividad en el cerebro y otros órganos abdominales, los jefes y abdomen de ratones nuestro reportero muestran consistentemente una señal cuando fotografiado, incluso al inicio del estudio antes de cualquier manipulación. Por lo tanto, esta señal debe ser ignorado con respecto a este experimento. Una señal obvia debe permanecer dentro de la glándula mamaria inyectó LPS después de la lectura de imagen de salida se ajusta para minimizar la luminiscencia de fondo en la glándula PBS. Figura 2 muestra imágenes con el fondo reducido. Inyección incorrecta de la glándula semás probable resultado daños en el pezón. Esto hará que señaló, la piel a nivel de la inflamación que será evidente en formación de imágenes. Este tipo de señal de herida será muy fuerte y se limita a la zona del pezón, donde se produjo el daño, al no proceder en toda la glándula, como se ve después de una exitosa inyección de LPS en los conductos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de Procedimiento. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> Figura 2. Los resultados representativos de IVIS bioluminiscente de imágenes. (A) Adquirida imagen con fondo reducido, revelando aumento de la actividad de la luciferasa en la glándula inyectadas con LPS. (B) Imagen de una región con cuantificaciones de interés añadido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3 Práctica de inyección:.. Glándula mamaria inyectado con tinte a través de inyección intraductal Para comprobar la precisión de la entrega a través del pezón, un ratón en el día 21 de lactancia fue inyectado con 100 l de colorante azul de tripano diluido en PBS. Tras el sacrificio, la glándula se expuso para la visualización. (A) inyección exitosa y (B) en bolo de medio de contraste en el pezón.

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No hay conflictos de interés declarado.

Aquí utilizamos un transgénico NF-kB ratón periodista y una técnica de inyección optimizado para mastitis modelo, la inflamación del tejido mamario más comúnmente causada por una infección bacteriana. El paso más crítico en este procedimiento es la inyección intraductal sí mismo. En la práctica, por lo general es evidente si la inyección intraductal ha tenido éxito. La inyección de los agentes (LPS o PBS) debe sentirse fluido y no debería haber poca o ninguna resistencia co...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Lipopolisacárido de Escherichia coli (LPS) </td><td> Sigma </td><td> L 2880 </td><td> serotipo 055: B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 46-013 CM- </td><td></td></tr><tr><td> 31 Gauge jeringa de insulina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 328438 </td><td> Aguja corta </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> World Precision Instruments </td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td> Disección de alcance </td><td> Leica </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> Terrell Isoflurano, USP </td><td> MINRAD INC para Rx Elite </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 imágenes de sistema &lt;/ Td&gt; <td> Caliper (antes Xenogen) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Jeringa para inyección luciferina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309597 </td><td> 1cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-luciferina Firefly, monohidrato de sal de sodio (Sustrato de luciferina) </td><td> Biosynth Química y Biología </td><td> L-8240 </td><td> Diluir a 10 mg / ml </td></tr></tbody></table>

intraductal injection of lps as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an nf-&kappa;b reporter transgenic

Los modelos animales de enfermedad humana son necesarios con el fin de estudiar rigurosamente las etapas de progresión de la enfermedad y los mecanismos asociados, y en última instancia, como modelos pre-clínicos para probar intervenciones. En estos métodos, se describe una técnica en la que el lipopolisacárido (LPS) se inyecta en la glándula mamaria lactante ratón a través del pezón, mastitis efectivamente modelado, o la inflamación, de la glándula. Esto resulta en un aumento de infección simulada del factor nuclear kappa B (NF-kB) de señalización, como se visualiza a través de formación de imágenes bioluminiscentes de un ratón reportero NF-kB de luciferasa 1. Nuestro último objetivo en el desarrollo de estos métodos fue estudiar la inflamación asociada con la mastitis en la glándula lactantes, que a menudo incluye enrojecimiento, hinchazón, y la infiltración de células inmunes 2,3. Por lo tanto, hemos sido muy conscientes de que la incisión o cualquier tipo de heridas de la piel, el pezón o la glándula con el fin de introducir los LPS podríano ser utilizada en nuestros métodos desde el enfoque probablemente confundir la lectura de salida de la inflamación. También se desea un método straight-forward que no requería especialmente hechos a mano de pipetas o el uso de micromanipuladores para sostener estas herramientas especializadas en su lugar. Por lo tanto, se determinó que usar una jeringa de insulina comercialmente disponible y para inyectar el agente en el conducto mamario de un pezón intacto. Este método fue exitoso y nos permitió estudiar la inflamación asociada con la inyección de LPS, sin efectos adicionales superpuestos por el proceso de inyección. Además, este método también se utiliza un NF-kappa B luciferasa de ratones transgénicos y la tecnología bioluminiscente de imágenes para mostrar visualmente y cuantitativamente aumentado NF-kB de señalización dentro de la glándula inyectadas con LPS 4. Estos métodos son de interés para los investigadores de muchas disciplinas que deseen modelo de enfermedad en la glándula mamaria, en última instancia, la técnicadescrito aquí podría ser utilizado para la inyección de un número de sustancias, y no se limita a LPS solamente.

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Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&amp;kappa;B Reporter Transgenic

A continuación se describe una técnica en la que lipopolisacárido se inyecta en la glándula mamaria lactante ratón mediante la boquilla para simular la mastitis, una condición comúnmente causada por una infección bacteriana. Resultados lipopolisacárido de inyección en el aumento del factor nuclear kappa B (NF-kB) de señalización, visualizado a través de imágenes bioluminiscentes de un ratón reportero luciferasa NF-kB.

Inyección intraductal de LPS como un modelo de ratón de Mastitis: Señalización Visualizada a través de un transgénico NF-kB Reportero

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

intraductal-injection-lps-as-mouse-model-mastitis-signaling

Research

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Medicine

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

19.1K vistas.  Vanderbilt University Medical Center. A continuación se describe una técnica en la que lipopolisacárido se inyecta en la glándula mamaria lactante ratón mediante la boquilla para simular la mastitis, una condición comúnmente causada por una infección bacteriana. Resultados lipopolisacárido de inyección en el aumento del factor nuclear kappa B (NF-kB) de señalización, visualizado a través de imágenes bioluminiscentes de un ratón reportero luciferasa NF-kB.

Video: Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

Vejiga ratón pared de inyección

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

Investigación

Medicina

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Desarrollo de un modelo basado en la rata alfa-sinucleína para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáctica de un vector viral adeno-asociado recombinante

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Inducción y Micro-CT en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Neovascularization del diafragma como un modelo de ratón de iridis del rubeosis inducida por la punción

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Inyección de ácido oleico en cerdos como modelo de síndrome de dificultad respiratoria aguda

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Rebanadas de hígado cortadas con precisión de la murino como modelo Ex Vivo de biología hepática

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Un modelo de ratón para la pancreatitis crónica a través de la infusión de TNBS del conducto biliar

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...