Diese Arbeit wurde vom NIH CA113734 verliehen F Yull und dem Department of Veterans Affairs (TS Blackwell) finanziert.

Alle Tierversuche wurden von der Vanderbilt University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. Ein. Herstellung transgener Mäuse <ol><li> Weibliche Mäuse, positiv für die NGL (N F-KB-G FP-L uciferase) Reporter-Transgen (zuvor beschriebene 1) sind für dieses Verfahren verwendet. Wenn Weibchen mindestens 6 Wochen alt sind, paaren sie mit einem FVB Wildtyp männlich. Harem Zucht verwendet werden (bis zu 4 Weibchen in einem Käfig mit 1 Mann) werden. (Achtung: FVB Stamm-Mäuse wurden für die vorliegende Studie verwendet Dunkler Stamm-Mäuse wie C57Bl6 können ebenfalls verwendet werden, aber diese Mäuse müssen vor der Bebilderung rasiert werden.). </li><li> Ab 15 Tage post-Paarung, überprüfen Sie die Weibchen regelmäßig auf Anzeichen einer Schwangerschaft (große, hervorstehende Umfang). Jede Frau muss getrennt einmal schwanger werden und das Männchen aus der Zucht Käfig entfernt werden, sobald das letzte Weibchen schwanger wird. </li><li> Sehen Sie sich die getrennten Weibchen eind beachten Sie das Datum der Geburt, wenn ein Wurf erscheint. Ein Wurf von mindestens 6 Welpen ist für eine angemessene Stillzeit erforderlich. Acht Tage nach der Geburt des Wurfes, mit dem Protokoll (siehe Abbildung 1 für eine Zeitachse schematisch) fortzufahren. </li></ol> 2. Vorbereitung zur Injektion <ol><li> Lösen Sie die E. coli LPS in PBS auf eine Endkonzentration von 0,1 ug / ul. 50 ul dieser Lösung oder insgesamt 5 ug, wird in die Brustdrüse injiziert werden. Vorbereiten einer zweiten Röhre von PBS allein für die Steuerung Injektion verwendet werden. </li><li> Set-up ein Binokular und Isofluran Anästhesiegeräten. Ein Nasenkegel Vorrichtung sollte der Stufe des Binokular wo die Maus gestellt werden gesichert werden. Eine gute Lichtquelle sollte, ob aus dem Anwendungsbereich selbst oder von zusätzlichen Scheinwerfern ebenfalls hergestellt werden. </li><li> Sobald das Set-up abgeschlossen ist, starten Sie die Isofluran-Maschine und Luftströmung. </li></ol> 3. Intraduktalen Injektion von LPS <ol><li> Legen Sie die kurze Nadel Spritze mit 50 ul der LPS-Lösung. Setzen Sie diese beiseite. </li><li> Anesthetize der Maus, indem zuerst die Weibchen in einer Isofluran gefüllten Kasten und dann noch einmal Atmung verlangsamt injiziert werden, verschieben sie auf die Bühne und platzieren ihre Nase in der Nase-Membran. Verwenden Sie einen Zeh Prise zu bestätigen, dass die Maus ist vollständig betäubt. Überwachen der Maus die Atmung während des gesamten Verfahrens und stellen Sie die Isofluran entsprechend an. Der Käfig mit dem Wurf von Welpen, dass die Weibchen aus getroffen wurde sorgfältig eingestellt werden beiseite, bis der Damm nach der Prozedur zurückgegeben werden können. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Tropfen von 70% Ethanol, um das Fell flach und zu visualisieren die Brustwarze an der rechten # 4 inguinal Milchdrüse auf die Maus Unterbauch. </li><li> Fokussieren Sie das Sezieren Spielraum für eine optimale Sicht auf die Brustwarze. Vorsichtig verwenden eine Reihe von feinen Pinzette weiter ziehen die Brustwarze von der Haut weg, aber nicht gewaltsam öffnen oder zu verletzen die Brustwarze in keiner Weise. DieZange sollte niemals straff gespannt werden gemeinsam beim Manipulieren des Gewebes, sondern verwendet einen leichten Halt, die die minimale Menge von Stress erfordert auf der Brustwarze. </li><li> Verwenden Sie die Zange in der linken Hand sanft halten die Brustwarze in Kraft. Langsam bringen die vorinstallierte Spritze in das Sichtfeld mit der rechten Hand. Die Spritze ist so gehalten, daß keine Neupositionierung zu treten, um den Inhalt zu injizieren aufweist. </li><li> Sobald die Spritze ist in Sicht, sorgfältig zielen auf die kleinen duktalen Öffnung im Zentrum der Brustwarze, und legen Sie die Spritze. </li><li> Ohne Neupositionierung der Hand, spritzen den Inhalt der Spritze und entfernen Sie die Nadel aus der Brustwarze. </li><li> Legen Sie eine zweite Spritze mit 50 ul PBS zur Kontrolle Injektion. Positionieren Sie die Maus auf der Bühne und für die beste Ansicht der linken # 4 inguinal Brustdrüse Nippel auf der anderen Seite der Maus Unterbauch. Wiederholen Sie die Schritte von 3,4 bis 3,7 mit der PBS-geladenen Spritze. </li><li> Sobald beide Injektionen sind komplete, einzustellen Anästhesie und bewegen Sie die Maus auf eine Erholung Käfig. Überwachen Sie den weiblichen um sicherzustellen, dass sie mobilen innerhalb von 5 min wird. Lassen Sie die Maus, um bei der Verwertung Käfig für 1 Stunde bleiben. Nach 1 Stunde der Erholung, legen Sie die Frauen zurück in den Käfig mit ihrem Wurf von Welpen. Mäuse sollten in regelmäßigen Abständen für 6 Stunden nach der Injektion überwacht werden, bevor die Bildgebung. In unserer Erfahrung, wurden keine nachteiligen Folgen in beiden die weibliche oder die Welpen in der Zeit zwischen Injektion und Bildgebung festgestellt. Allerdings, wenn Anzeichen von Leiden in der weiblichen eingehalten werden (z. B. gekrümmte Haltung, Beißen oder Bewachung der Injektionsstelle, allgemeine Lethargie) oder den Welpen (keine Bewegung, bläuliche Farbe der Haut) sollte das Experiment abgebrochen werden. </li></ol> 4. Bioluminescent Imaging zu visualisieren NF-kappaB Aktivität <ol><li> Sobald Mäusen haben die Bildgebung Anlage transportiert wurde, beginnen die bildgebenden Verfahren, indem Sie die Software und die Initialisierung der Maschine. Schalten Sie den istoflurane Maschine und Luftstrom, so dass die Narkose wird sowohl an der Box und der Abbildungskammer fließt. </li><li> Legen Sie die Maus unter Isofluran-Narkose in der klaren Anästhesie-Box. Sobald Atmung verlangsamt hat, verwenden Sie einen Zeh Prise zu bestätigen, dass die Maus ist vollständig betäubt. Dann injizieren 100 ul Luciferinsubstrat in der Maus durch retro-orbitale Einspritzung 5 mit einer sterilen Spritze. </li><li> Sofortüberweisung die Maus an die Bildgebung Kammer und legen ihre Nase unter der Isofluran Nasenkegel dort angesiedelt. Die Maus sollte in Rückenlage. Sichern Sie jeden Fuß auf die Bühne mit Klebeband. </li><li> Eingang die entsprechenden Einstellungen der Software, um sowohl IVIS ein weißes Licht fotografischen Bild und ein Bild der biolumineszenten Aktivität. Die Belichtungszeit sollte 10 sec sein. Erwerben Sie das Bild. </li><li> Nachdem die Bilder erworben wurden, ermöglichen die Maus zu erholen und dann legen Sie sie zurück in den Käfig mit ihren Welpen und überwachen regelmäßig. </li><li> Die fotografische und lumineszierendeBilder werden automatisch überlagert und angezeigt auf dem Bildschirm, wie in 2. Analysieren der erfassten Bilder, indem Region von Interesse oder &quot;ROI&quot; Kreisen gleicher Größe über jede Seite der Mäuse Unterleib (eine über das PBS-injiziert Drüse und eine über der LPS-Injektion Drüse). Stellen Sie das Auslesen Photonen. Eine Reihe sollte angezeigt, die den Lumineszenz innerhalb jeder ROI nachgewiesen (siehe Abbildung 2B). Verwenden Sie diese Nummer in der statistischen Analyse. </li><li> Um die optimale Bild anzuzeigen, weiter anpassen die Schwelle von Signal angezeigt. Dies ändert nicht die gesamte Lumineszenz Auslesen, sondern ermöglicht es Ihnen, Hintergrund-Signal zu entfernen und zu visualisieren die Unterschiede zwischen der Kontroll-und LPS-behandelten Drüse. Verringern der Menge der Lumineszenz angezeigt, bis der PBS-injiziert Drüse frei von Hintergrund-Signal ist. Dies sollte nun die erhöhte Signal in der LPS-behandelten Verschraubung noch erkennbar in dem Bild, wie in 2 gesehen. </li><li> Additional Analyse, einschließlich Protein-und RNA-Assays, mit Brustgewebe aus dem weiblichen post-mortem 6 gesammelt abgeschlossen sein. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Auf interpretierbare Ergebnisse dieser Methoden erhalten, muss LPS (oder PBS) nur in die Milchgänge infundiert werden, so dass das angrenzende Gewebe ungestört. Injektion in das subkutane Gewebe um die Brustwarze wird bei Entzündungen aufgrund einer Verletzung statt der simulierten Infektion führen. Injektion von Trypanblau-Farbstoff in PBS verdünnt ist hilfreich, wenn das Erlernen der Technik. 3A zeigt einen erfolgreich injiziert Verschraubung mit 100 ul Trypanblau in PBS infundiert. Wie gezeigt, sollte nur der duktalen Baum mit der injizierten Lösung gefüllt werden, und es sollte keine Bolus sein an der Injektionsstelle. A &quot;Bolus&quot; in diesem Zusammenhang ist ein Aufbau der injizierten Flüssigkeit an der Brustwarze oder in dem Gewebe um die Brustwarze ohne Infusion in den duktalen Baum. Dies ist sheigenen in 3B. Bitte beachten Sie, dass die Praxis Injektionen in 3 gezeigt in einem weiblichen wurden am Tag 21 der Laktation abgeschlossen. Auf dem Höhepunkt der Stillzeit (Tag 8-10, in welchem ​​Stadium LPS injiziert unter Verwendung der aktuellen Protokoll) ist Milch reichlich vorhanden und es ist schwierig, die Kanäle zu visualisieren und zu bestimmen, ob die Injektion korrekt beendet wurde. Daher sind späteren Zeitpunkten in der Laktation besser für die Praxis Injektionen. Erfolgreiche Injektion von LPS in die Milchgänge führt zu einer erhöhten NF-kappaB Aktivität innerhalb der Drüse. Dies sollte in der Reportersonde Maus auf IVIS Bildgebung ersichtlich, und der LPS-Injektion Drüse sollte wesentlich höhere Luciferaseaktivität (gemessen durch Photonenzählung) als der PBS-injizierten Drüse haben, wie in 2 gezeigt (im Durchschnitt, liest der LPS Drüse 200% des PBS-Steuerungs-Signal). Ein statistisch signifikanter Anstieg der Lumineszenz innerhalb der LPS-behandelten Drüsen Layoutared zur kontralateralen Kontrolle wurde zwar der Fertigstellung einer Gruppe von 4 Mäusen 4 erreicht. Eine weitere Studie hat auch intraduktalen Mamma Injektion von E. genutzt coli oder LPS in NF-kappaB-Reporter transgenics. Ähnlich wie bei unserer eigenen Arbeit, sah diese Autoren eine signifikante Erhöhung der Reporter-Aktivität 6 Stunden nach E. coli-Injektion 2. Bitte beachten Sie, aufgrund konstitutive NF-KB-Aktivität im Gehirn und anderen abdominellen Organen, die Köpfe und Bäuche unserer Reportermäuse zeigen durchwegs ein Signal, wenn abgebildet, auch an der Basislinie vor jeglicher Manipulation. Somit sollte dieses Signal im Hinblick auf diesem Experiment ignoriert. Eine offensichtliche Signal sollte innerhalb der LPS-Injektion Brustdrüse, nachdem das Bild ausgelesen wird eingestellt, um Hintergrundlumineszenz im PBS Drüse minimieren bleiben. 2 zeigt Bilder mit der Hintergrund vermindert. Erfolglose Injektion der Drüse wirdhöchstwahrscheinlich zu Schäden an der Brustwarze. Dies führt dazu, spitz, Haut-Level-Entzündung, die offensichtlich sein wird bei der Bildgebung. Diese Art der Verwundung Signal wird sehr stark sein und beschränkt sich auf die Brustwarze, wo der Schaden eingetreten ist, nicht ausgehen in der Drüse, als nach einem erfolgreichen LPS-Injektion in die Kanäle zu sehen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Vorgehensweise. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus IVIS biolumineszierenden Bildgebung. (A) aufgenommenen Bildes mit Hintergrund verringert und enthüllt erhöhte Luciferaseaktivität in der LPS-injizierten Drüse. (B) Bild von A mit region of interest Quantifizierungen hinzugefügt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt = &quot;Abbildung 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3 Praxis Injektion:.. Brustdrüse mit Farbstoff über intraduktalen eingespritzt Um die Genauigkeit der Zustellung über den Nippel zu testen, eine Maus am Tag 21 der Laktation wurde mit 100 ul Trypanblau-Farbstoff injiziert, verdünnt in PBS. Nach Opfers, wurde die Drüse zur Visualisierung ausgesetzt. (A) Injektion erfolgreich und (B) Farbstoff-Bolus an der Brustwarze.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hier eine transgene NF-KB-Reporter Maus und ein optimiertes Modell zu Injektionstechnik Mastitis nutzen, Entzündung des Brustgewebes am häufigsten durch bakterielle Infektion verursacht. Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist die intraduktalen Injektion selbst. In der Praxis ist es in der Regel zeigen, ob der intraduktalen Injektion erfolgreich war. Die Injektion der Substanzen (LPS oder PBS) sollen sich Fluid und es sollte wenig bis keinen Widerstand als die Spritze geleert wird. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Lipopolysaccharid aus Escherichia coli (LPS) </td><td> Sigma </td><td> L 2880 </td><td> Serotyp 055: B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> 31 Gauge Insulinspritze </td><td> Becton Dickinson </td><td> 328438 </td><td> Kurze Nadel </td></tr><tr><td> Zange </td><td> World Precision Instruments </td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td> Binokular </td><td> Leica </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> Terrell Isofluran, USP </td><td> MINRAD Inc. für Rx Elite </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 Imaging-System &lt;/ Td&gt; <td> Caliper (ehemals Xenogen) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Spritze zur Injektion Luciferin </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309597 </td><td> 1cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-Luciferin Firefly, Natriumsalz Monohydrat (Luciferin-Substrat) </td><td> Biosynth Chemie und Biologie </td><td> L-8240 </td><td> Verdünnt auf 10 mg / ml </td></tr></tbody></table>

intraductal injection of lps as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an nf-&kappa;b reporter transgenic

Tiermodelle von Krankheiten sind, um konsequent zu studieren Stadien der Krankheitsprogression und die damit verbundenen Mechanismen, und schließlich, als prä-klinischen Modellen Interventionen zu testen notwendig. Bei diesen Verfahren beschreiben wir eine Technik, bei der Lipopolysaccharid (LPS) in der laktierenden Milchdrüse der Maus über den Nippel, effektiv Mastitis Modellierung oder Entzündung, der Drüse eingespritzt wird. Diese simulierte Infektion führt zu einer erhöhten nuclear factor kappa B (NF-kappaB) Signalisierung, wie visualisiert durch Biolumineszenz Bildgebung eines NF-kappaB Luciferase-Reporter Maus 1. Unser oberstes Ziel bei der Entwicklung dieser Methoden war, um die Entzündung mit Mastitis in der laktierenden Drüse, die oft auch Rötungen, Schwellungen und Immunzellen Infiltration 2,3 assoziiert zu studieren. Daher konnten wir sehr bewusst, dass Einschnitt oder jede Art von verwundeten der Haut, den Nippel oder die Drüse, um die LPS konnte einzuführennicht in unserem Verfahren verwendet werden, da der Ansatz eher verwirren würden die Ausleseschaltung von Entzündungen. Wir wollten eine straight-forward-Methode, die nicht verlangen, speziell angefertigten handgezeichneten Pipetten oder den Einsatz von Mikromanipulatoren diese spezielle Werkzeuge in Position zu halten. Somit haben wir festgestellt, einen handelsüblichen Insulin-Spritze zu verwenden und die Mittel in den Kanal mammary eines intakten Nippel injizieren. Diese Methode war erfolgreich und erlaubte uns, die Entzündung mit LPS-Injektion verbundenen ohne zusätzliche Effekte durch den Prozess der Injektion überlagert studieren. Zusätzlich hat dieses Verfahren auch eine NF-kappaB-Luciferase Reporter transgene Maus und biolumineszierende Bildgebungstechnologie verwendet werden, um visuell anzuzeigen und quantitativ erhöht NF-KB Signalisierung innerhalb des LPS-injizierten Verschraubung 4. Diese Methoden sind von Interesse für Wissenschaftler aus vielen Disziplinen, die wollen Modell Krankheit innerhalb der laktierenden Brustdrüse, wie letztlich die Technikhier beschriebenen könnten zur Injektion einer Reihe von Stoffen genutzt werden, und ist nicht nur auf LPS begrenzt.

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Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Hier beschrieben ist ein Verfahren, bei dem Lipopolysaccharid in der laktierenden Milchdrüse der Maus über den Nippel, um Mastitis zu simulieren, ein Zustand, üblicherweise durch bakterielle Infektion verursacht wird injiziert. Lipopolysaccharide Injektion führt zu einer erhöhten nuclear factor kappa B (NF-kappaB) Signaltechnik, visualisiert durch Biolumineszenz Bildgebung eines NF-kappaB Luciferase-Reporter-Maus.

Intraduktale Injektion von LPS als Maus-Modell der Mastitis: Signaling Visualisierte über einen NF-kappaB Reporter Transgene

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

intraductal-injection-lps-as-mouse-model-mastitis-signaling

Research

JoVE Journal

Medicine

19.1K Aufrufe.  Vanderbilt University Medical Center. Hier beschrieben ist ein Verfahren, bei dem Lipopolysaccharid in der laktierenden Milchdrüse der Maus über den Nippel, um Mastitis zu simulieren, ein Zustand, üblicherweise durch bakterielle Infektion verursacht wird injiziert. Lipopolysaccharide Injektion führt zu einer erhöhten nuclear factor kappa B (NF-kappaB) Signaltechnik, visualisiert durch Biolumineszenz Bildgebung eines NF-kappaB Luciferase-Reporter-Maus.

Serie: Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-κB Reporter Transgenic

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

Maus Blasenwand Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

Forschung

Medizin

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von<em&gt; Wnt5a</em&gt; Ursachen Zysten in Zebrafisch-Nieren

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Induktion und Mikro-CT-Bildgebung des zerebralen höhlenartigen Fehlbildungen im Mausmodell

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Punktion-induzierte Iris Neovaskularisation als einem Mausmodell der Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Ölsäure-Injektion bei Schweinen als Modell für Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Präzisionsgeschnittene Leberscheiben als Ex-Vivo-Modell der Leberbiologie

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Ein Mausmodell für chronische Pankreatitis mittels Gallengangs-TNBS-Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

Intraduktale Injektion von LPS als Maus-Modell der Mastitis: Signaling Visualisierte über einen NF-kappaB Reporter Transgene

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