Este trabajo fue apoyado por la DFG-Cluster de Excelencia &quot;La inflamación en las interfaces&quot; (AR-Si, RA-D). Estamos muy agradecidos por la excelente asistencia técnica de Kristin Wischnat.

1. Preparación de Chlamydia trachomatis serovar D de archivo <ol><li> Infect confluente 175 cm 2 frasco de cultivo celular que contiene células HeLa-229 con 4 ml C. trachomatis D en el SPG de amortiguamiento. </li><li> Incubar durante una hora a 37 ° C durante agitación constante. </li><li> Añadir 20 ml de DMEM con 10% de FCS y 240 l cicloheximida. </li><li> Incubar en una incubadora humidificada durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Añadir 5 ml de perlas de vidrio estériles y agitar fuerte para separar y destruir a C. trachomatis albergar HeLa-229 células. </li><li> Recoger el sobrenadante y añadir otros 5 ml de perlas de vidrio estériles. </li><li> Roca tres veces durante 1 min para destruir todas las células HeLa-229 y suelte C. trachomatis. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI y 4 ° C para deshacerse de los desechos celulares. </li><li> Recoger el sobrenadante para la infección de 8 a 10 175 cm cultivo celular 2 matraces g confluenteRowN con HeLa 229 células. </li><li> Incubar cada matraz con 4 ml de tampón SPG y 4 ml de sobrenadante de la infección anterior durante una hora a 37 ° C con agitación constante. </li><li> Después de una hora añadir 15 ml de DMEM con 10% de FCS y 230 l cicloheximida seguido de 48 h de incubación a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Añadir 5 ml de perlas de vidrio estériles, agitar para separar y destruir a C. trachomatis albergar HeLa-229 células. </li><li> Recoger el sobrenadante y añadir otros 5 ml de perlas de vidrio estériles. </li><li> Roca tres veces durante 1 min para destruir todas las células HeLa-229 y suelte C. trachomatis. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI a 4 ° C para deshacerse de los desechos celulares. </li><li> Recoger el sobrenadante. </li><li> Llena 40 ml de sobrenadante en tubos Falcon de 50 ml y centrifugar durante 99 minutos con 11.000 RPMI. </li><li> Después de la centrifugación descartar el sobrenadante y lavar el precipitado con 1 ml de tampón SPG. </li><li> Homogeneizar elpellet en 1 ml y SPG l alícuota de 20 en un 1, 5 ml tubo Eppendorf, almacenar a -70 ° C hasta su uso. La actividad biológica de la población preparada se confirmó en una establecida HeLa-229 modelo de infección celular. </li></ol> 2. Preparación de las trompas de Falopio Humanos <ol><li> Tienda de trompas de Falopio humanas (HFT) de las mujeres sometidas a histerectomía inmediatamente después de la cirugía en RPMI que contiene 5% de FCS sin antibióticos en la 4 ° C hasta la preparación. El protocolo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Lübeck (09-153). Las mujeres incluidas en el estudio (edad 34 hasta 53) no tenían antecedentes de antes de C. trachomatis infección. Tejido de las trompas de Falopio se recogió en la esterilización periparto previa solicitud materna durante la cesárea o durante una histerectomía debido a fibromas uterinos sintomáticos en la fase lútea. Todos se pusieron a prueba HFT negativos para C. trachomatis por PCR. </li><li> Diseccionar el HFT en una placa de Petri que contiene RPMI con5% de FCS sin antibióticos. Durante el procesamiento de todo el tejido debe ser sumergido en un medio para prevenir el secado. </li><li> Corte y deseche el tejido conjuntivo y tejido destruido durante la cirugía. </li><li> Después de la disección abrir el HFT cuidadosamente con un pequeño bisturí. </li><li> Para más experimentos preparar piezas de tejido en el tamaño de 0,5 cm x 0,5 cm hasta 1 cm x 1 cm. </li><li> Para el modelo HFT infección almacén en 1 ml de RPMI que contiene 5% de FCS sin antibióticos. Las muestras fueron infectadas con el HFT 5.5x10 5 IFU (unidades formadoras de inclusión) de C. trachomatis. </li><li> Incubar espécimen HFT en 37 ° C, 5% de CO 2 y el 21% de O 2, así como en 37 ° C, 5% de CO 2 y 2% de O 2 durante 24 h. </li><li> Después de recolectar la muestra el tiempo de incubación y la tienda en fijador Monti por lo menos tres días a 4 ° C hasta su SEM / TEM preparación. </li></ol> 3. Preparación de la pieza HFT para TEM <ol><li> ParaTEM quitar muestra de fijador de Monti y corte de 2 x 2 mm a 4 x trozos de 5 mm. El tejido restante se puede utilizar para SEM. </li><li> Lavar las piezas con tampón de cacodilato de sodio, pH 7,35 durante 1 h. </li><li> Incubar en 1% (w / v) de tetróxido de osmio en agua destilada. durante la noche. </li><li> Eliminar el exceso de tetróxido de osmio por lavado min 6x5 en tampón de cacodilato de sodio, pH 7,35. </li><li> Eliminar el agua mediante la incubación en concentraciones crecientes de etanol en agua (v / v) (30% durante 2 h, 40% durante 2 h, 50% durante 2 h, 60% durante 2 h, 70% durante la noche, el 80% de 2 h, 90% durante 1 h, 95% durante 1 h, 100% durante 1 h. </li><li> Lavar etanol para 2 x 15 min en óxido de propileno y, posteriormente, transferir a una mezcla de 50% (v / v) Araldite recién preparada (incluyendo todos los componentes) en propileno y se incuba durante la noche. </li><li> Transferir a Araldite recién preparada (incluyendo todos los componentes) durante al menos 1 hora. </li><li> Traslado a la incrustación de moldes planos y se llenan de Araldite. </li><li> Vamos a endurecer durante aralditepor lo menos 48 horas a 60 ° C </li><li> Tras el recorte de la muestra integrada corte semi-secciones delgadas (700 nm) en un ultramicrotomo utilizar cuchillos de vidrio o un cuchillo de diamante histo y se tiñen con tinción de Richardson. </li><li> Corte secciones ultrafinas (aprox. 70 nm), utilizando un cuchillo de diamante y la transferencia a las redes de cobre (por ejemplo, 150 mallas cuadradas). </li><li> Mancha de ultra-delgadas secciones con acetato de uranilo 0,5% (w / v) en agua destilada. seguido por 3% (w / v) de citrato de plomo en agua destilada. en un teñidor sección automática. Alternativamente, las secciones se pueden teñir manualmente dejando rejillas 15 minutos en una solución saturada de acetato de uranilo centrifugada en agua destilada. seguido por citrato de plomo 0,3% (w / v) en agua destilada. </li></ol> 4. Preparación de la muestra HFT para SEM <ol><li> Para eliminar el SEM muestra de fijador de Monti, oriente con el epitelio hacia arriba en una hoja de 1,5 x 1 cm de corcho y de fijar la posición con agujas de insectos. </li><li> Transferir la muestra en el corcho a las cestas de metal adecuados ylavar durante 30 minutos en tampón de cacodilato de sodio, pH 7,35. </li><li> Eliminar el agua mediante la incubación de la muestra en la creciente concentración de las mezclas de acetona / agua (v / v) 30% durante 6 h, 40% durante 6 h, 60% durante 8 h, 70% durante la noche, el 80% durante 2 h, 90% para 2 horas y 100% durante la noche (ser extremadamente cuidadoso para mantener la muestra continuamente sumergido). </li><li> Transferir a la acetona fresca 100% y la muestra seca mediante secado por punto crítico (temperatura 40 ° C, presión 80 bar). </li><li> Eliminar las agujas, de corcho y de muestras de pegamento con el epitelio hacia arriba en el monte de la muestra SEM equipado con una ficha de carbón conductor con un cemento de carbono conductor. Utilice conductora de plata líquida para mejorar la conductividad entre el monte y la ficha de carbono conductor. </li><li> Preparar un recubrimiento conductor de platino, oro o paladio de la muestra utilizando un recubridor de pulverización catódica. </li></ol> 5. La tinción de Semi Secciones finas con manchas de Richardson <ol><li> Que semi seco en secciones delgadas de diapositivas. </li><li> Mancha de secciones con la solución de tinción a 60 ° C durante 1-2 min. </li><li> Lavar con agua destilada. </li><li> Secciones secas y cubreobjetos. </li></ol> 6. Los resultados representativos Dentro del modelo de Falopio humana infección tubo hemos sido capaces de visualizar las diferencias en la morfología epitelial entre los controles no infectados (Figura 1) y la C. trachomatis - tubos infectados (Figura 2) bajo condiciones normoxic. Características morfológicas diferencias implícitos patógenos inducida por la inflamación y la lisis de las células epiteliales del tubo de Falopio que no podían ser detectadas en los controles no infectados. Uso semi secciones delgadas y microscopía electrónica de transmisión que fueron capaces de demostrar intracelular C. formación trachomatis inclusión en la ex vivo tejido humano infectado trompa de Falopio (Figura 3, 5), pero no en los controles no infectados (Figura 4). Como las concentraciones de oxígenociones en el tracto genital de la mujer ya son bajos en condiciones fisiológicas 11, y una disminución aún más durante un proceso inflamatorio que también investigó el modelo bajo condiciones hipóxicas. Los resultados preliminares indican que el modelo es útil para analizar el crecimiento de clamidia y descendientes en las diferentes concentraciones de oxígeno. Chlamydia inducida por el daño de las células epiteliales tiene que ser separado de los artefactos que están mediadas a través de la preparación y la manipulación imprudente de las trompas de Falopio antes de la infección (Figura 6). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Microscopía electrónica de barrido (SEM) de una de Falopio humana no infectados después de la incubación de un día en medio de control (flecha verde muestran células ciliadas flecha azul muestra de células no ciliadas). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Electrónica de barrido micros<html> copia (SEM) de una ex vivo trachomatis C infecta el tubo de Falopio humana un día después de la infección (flecha blanca marca de ruptura de la inclusión). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Secciones delgadas semi muestran típicas inclusiones intracelulares (flechas blancas) 1d después de la infección de las trompas de Falopio humana con C. trachomatis ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de un no-humano infectado tubo de Falopio días después de la incubación en un medio de control. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de un C. ex vivo trachomatis infecta el tubo de Falopio humana un día después de la infección (flechas blancas marcan las inclusiones clamidias). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Microscopía electrónica de barrido (SEM) de las trompas de Falopio epitelio dañado mediante la preparación y manipulación imprudente de espécimen (blanco flechas marca destruido tejido epitelial).

<ol>
	<li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping.">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li><li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility.">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li><li>Peipert, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Genital+chlamydial+infections.">Clinical practice. Genital chlamydial infections.</a> N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).</li><li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubal+factor+infertility,+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis.">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li><li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells.">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55 (2006).</li><li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells.">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li><li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection.">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li><li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo.">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li><li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin.">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li><li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring.">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Visualización de patógenos inducida por el daño al tejido infectado es arduo y, a menudo limitada a los procedimientos experimentales en ratones. Hemos establecido un modelo in vivo en humanos la infección ex trompas de Falopio para analizar C. trachomatis de la parte superior del tracto genital femenino. Mediante el uso de este método, hemos sido capaces de visualizar C. trachomatis - inducida por los daños al epitelio de las trompas de Falopio humana dentro de un día después de la infección. Inflamación celular y la lisis eran típicos los cambios morfológicos que se observaron en C. trachomatis - infectados trompas de Falopio, pero no en los controles no infectados. TEM análisis reveló que las clamidias poner en práctica un típico ciclo de desarrollo intracelular en los tejidos infectados, que muestra grandes inclusiones con la re-diferenciados cuerpos elementales, sino también pequeñas inclusiones con cuerpos reticulados agrandados que pudieran indicar la persistencia. Sin embargo, la imagen morfológica por sí sola no es suficiente para discriminar entre REPLinfecciones icating y persistente, que se caracterizan por una disminución del metabolismo y aumento de la resistencia a los antimicrobianos 10. La destrucción del epitelio en las trompas de Falopio infectadas es o bien debido a la interrupción de C. trachomatis - las células epiteliales infectadas después de la finalización del ciclo de desarrollo intracelular y la liberación de los cuerpos elementales infecciosos o la liberación de citoquinas pro-inflamatorias 8. Patógenos inducida por daño tisular e indujo host reacciones inmunes contra C. trachomatis se supone que son los principales factores que conducen a la pérdida de la función de las células epiteliales, fibroblastos y la remodelación de la infertilidad tubárica en vivo, finalmente 8,11. Una de las principales limitaciones de este modelo es la ausencia de células inflamatorias que dificulta el análisis de los efectos secundarios a la inicial C. trachomatis infección del epitelio de las trompas de Falopio. Sin embargo, el modelo es APpropriate para investigar diferentes condiciones ambientales (por ejemplo, contenido de oxígeno) y el primer host de la respuesta inmune en la C aguda trachomatis 8,9. Otros planes son establecer un modelo para la prueba de los antimicrobianos en contra de C. trachomatis en las trompas de Falopio humanos enteros y caracterizar los estados metabólicos de las diferentes etapas evolutivas observadas en el epitelio de las trompas de 2-fotones microscopía de escaneo láser.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloheximida </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG de búfer </td><td> diversos </td><td></td><td> ver receta a continuación </td></tr><tr><td> Fijador de Monti </td><td> diversos </td><td></td><td> ver receta a continuación </td></tr><tr><td> tampón de cacodilato de sodio </td><td> diversos </td><td></td><td> ver receta a continuación </td></tr><tr><td> Richardson la mancha </td><td> diversos </td><td></td><td> ver receta a continuación </td></tr></tbody></table> Recetas: 1. SPG de búfer <ol><li> Añadir 75 g de sacarosa. </li><li> Añadir 2,47 g de fosfato disódico. </li><li> Añadir 0,36 g de fosfato monosódico. </li><li> Añadir 0,72 g de ácido glutámico. </li><li> Llene hasta 1 litro con agua destilada. </li><li> Ajustar el pH a 7.3. </li></ol> 2. Cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,35. <ol><li> Añadir 42,80 g de ácido dimetilarsénico sal de sodio. </li><li> Añadir 68,46 g de sacarosa. </li><li> Llene hasta 1 litro con agua destilada. para obtener 0,2 M tampón de cacodilato de sodio. </li><li> Antes de utilizar la solución diluida con agua destilada. a deseada concentración y ajustar el pH a 7,35, si es necesario. </li></ol> 3. Fijador de Monti <ol><li> Añadir 156 ml de 0,12 M tampón de cacodilato de sodio. 3.2 Añadir 25 ml de 25% glutaraldehído en agua destilada. </li><li> Añadir 19 ml10% de paraformaldehído en agua destilada. </li><li> Añadir 3 ml 3% de CaCl2 en agua destilada. </li><li> Ajustar el pH a 7,35 y rellenar con agua destilada. a 312 ml de solución final. </li></ol> 4. Richardson mancha <ol><li> Mezcle partes iguales de azul de metileno al 1% en solución acuosa al 1% de bórax y el 1% II Azul en agua destilada. </li></ol>

a human fallopian tube model for investigation of c. trachomatis infections

Infecciones del tracto genital por Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) son las más frecuentes enfermedades de transmisión sexual en las mujeres de todo el mundo. Aclaramiento de ineficaz o la persistencia de los patógenos puede dar lugar a infecciones ascendentes del tracto genital superior y se supone para causar daño inflamatorio crónico de 1,2 tejidos infectados. Como consecuencia, graves secuelas clínicas como la enfermedad inflamatoria pélvica (EIP), oclusión de las trompas e infertilidad puede ocurrir 3,4. La mayor parte de la investigación con C. trachomatis se ha realizado en líneas de células epiteliales (por ejemplo, células HEp-2 y HeLa 229-) o en ratones. Sin embargo, como con modelos de cultivo a base de células, que no reflejan ni la fisiología del tejido nativo ni la fisiopatología de C. trachomatis del tracto genital en vivo 5. Otras limitaciones están dadas por el hecho de que centrales cascadas de señalización (por ejemplo, el IFN-γ MEDIATed JAK / STAT vía de señalización) que controlan el crecimiento intracelular Chlamydia difieren fundamentalmente entre los ratones y los seres humanos 6,7. Nosotros y otros por lo tanto, estableció un modelo de órgano en su totalidad las trompas de Falopio para investigar las interacciones directas entre C. trachomatis y las trompas de Falopio humana ex vivo las células 8,9. Para este propósito, las trompas de Falopio humanos de las mujeres sometidas a histerectomía se recogieron y se infectan con C. trachomatis serovar D. Dentro de las 24 h después de la infección, la muestra donde se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) para detectar la Chlamydia trachomatis mediado daño epitelial, así como C. trachomatis formación inclusión en el tejido de Falopio.

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A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Se describe un<em&gt; Ex vivo infección</em&gt; Modelo para la visualización de las interacciones directas de los patógenos bacterianos con células humanas de la trompa de Falopio. El modelo de todo el tejido del órgano se creó para investigar<em&gt; C. trachomatis</em&gt; La patología inducida por la trompa de Falopio en las mujeres &quot;como&quot; condiciones de vida.

Un modelo humano las trompas de Falopio para la Investigación de<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infecciones

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient ...

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A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

12.8K vistas.  University of Lübeck. Se describe un Ex vivo infección Modelo para la visualización de las interacciones directas de los patógenos bacterianos con células humanas de la trompa de Falopio. El modelo de todo el tejido del órgano se creó para investigar C. trachomatis La patología inducida por la trompa de Falopio en las mujeres "como" condiciones de vida.

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Procesamiento de mamoplastia de reducción y tejidos humanos Mastectomía para el cultivo celular

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Investigación

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modelo murino de Curación de Heridas

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Inducción de la Aterosclerosis Acelerada en Ratones: El Modelo de "Lesiones por Alambre"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir<em&gt; En Vivo</em&gt; Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to the lack of markers or tools for the ovarian cancer identification, the early detection of HGSC remains challenging. Direct sampling of the fallopian tube can enhance sensitivity for detection of neoplastic cells when the tumor is not grossly visible. We developed a procedure to collect fallopian tube cells directly from freshly received surgical specimens, which has shown excellent correlation with histological findings. This approach lays a foundation for the future utility of minimally invasive laparoscopic screening in high-risk patient populations.

We explored a tubal cytologic method by sampling the fallopian tube directly post-surgical excision as a tool of ovarian cancer early detection. Here, we present a protocol to collect fallopian tube cells from freshly received surgical specimens.

La citología tubárica del tubo de Falopio como herramienta prometedora para la detección temprana del cáncer de ovario

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo la detección de la mitofagia en células humanas, C. Elegansy los ratones

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

Un método no invasivo para generar el modelo de lesión de cartílago intraarticular inducida por carga cíclica de la rodilla de rata

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...