Questo lavoro è stato sostenuto dalla DFG-Cluster of Excellence &quot;Infiammazione al Interfaces&quot; (RA-Se, RA-D). Siamo grati per l&#39;assistenza tecnica di ottima Kristin Wischnat.

1. Preparazione del magazzino Chlamydia trachomatis serovar D <ol><li> Infect confluenti 175 centimetri 2 pallone di coltura cellulare contenente cellule HeLa-229 con 4 ml C. D trachomatis in SPG tampone. </li><li> Incubare per un&#39;ora a 37 ° C durante agitazione costante. </li><li> Aggiungere 20 ml di DMEM con 10% FCS e 240 cicloeximide pl. </li><li> Incubare in un incubatore umidificato per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Aggiungere 5 palline di vetro sterili ml, si stringono forte per staccare e distruggere C. trachomatis ospitare 229 cellule HeLa-. </li><li> Raccogliere il surnatante e aggiungere un altro 5 ml di perline di vetro sterili. </li><li> Roccia tre volte per 1 min a distruggere tutte le cellule HeLa-229 e il rilascio C. trachomatis. </li><li> Centrifugare per 5 min a 1000 RPMI e 4 ° C per eliminare i detriti cellulari. </li><li> Raccogliere il surnatante per l&#39;infezione da 8 a 10 175 cm 2 di coltura cellulare palloni g confluentirown con 229 cellule HeLa. </li><li> Incubare ogni pallone con 4 ml di tampone SPG e 4 ml di surnatante dal precedente infezione per un&#39;ora a 37 ° C con costante agitazione. </li><li> Dopo un&#39;ora aggiungere 15 ml di DMEM con 10% FCS e 230 pl cicloeximide seguita da 48 ore di incubazione a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Aggiungere 5 ml di perline di vetro sterili, agitare per rimuovere e distruggere C. trachomatis ospitare 229 cellule HeLa-. </li><li> Raccogliere il surnatante e aggiungere un altro 5 ml di perline di vetro sterili. </li><li> Roccia tre volte per 1 min a distruggere tutte le cellule HeLa-229 e il rilascio C. trachomatis. </li><li> Centrifugare per 5 min a 1000 RPMI a 4 ° C per sbarazzarsi di detriti cellulari. </li><li> Raccogliere il surnatante. </li><li> Riempire 40 ml di surnatante in provette da 50 ml Falcon, centrifugare per 99 min con 11.000 RPMI. </li><li> Dopo la centrifugazione scartare il surnatante e lavare il pellet con 1 ml SPG buffer. </li><li> Omogeneizzare lapellet in 1 ml e SPG aliquota 20 pl in uno, 1 5 ml tubo Eppendorf, conservare a -70 ° C fino all&#39;uso. Attività biologica dello stock preparato è stato confermato in uno stabilito HeLa-229 modello di infezione delle cellule. </li></ol> 2. Preparazione dei diritti dell&#39;uomo e delle tube di Falloppio <ol><li> Conservare i tubi di Falloppio umani (HFT) da donne sottoposte a isterectomia subito dopo l&#39;intervento chirurgico in RPMI contenente 5% FCS senza antibiotici in 4 ° C fino alla preparazione. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico dell&#39;Università di Lubecca (09-153). Le donne inclusi nello studio (età 34 fino al 53) non avevano una storia di precedenti C. trachomatis infezione. Tessuti delle tube di Falloppio sono stati raccolti presso la sterilizzazione peripartum su richiesta materna durante il parto cesareo o durante l&#39;isterectomia a causa di fibromi uterini sintomatici nella fase luteale. Tutti HFT sono risultati negativi per C. trachomatis da PCR. </li><li> Sezionare il HFT in una capsula di Petri contenente RPMI con5% FCS senza antibiotici. Durante l&#39;intera lavorazione del tessuto deve essere immersa in media per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Tagliare ed eliminare il tessuto connettivo e tessuto distrutto durante l&#39;intervento. </li><li> Dopo la dissezione aprire il HFT con cura con un piccolo bisturi. </li><li> Per ulteriori esperimenti di preparare pezzi di tessuto nella dimensione di 0,5 cm x 0,5 cm fino a 1 cm x 1 cm. </li><li> Per i campioni HFT negozio di infezione in 1 ml RPMI contenente il 5% FCS senza antibiotici. I campioni sono stati infettati con HFT 5.5x10 5 IFU (unità formanti inclusione) di C. trachomatis. </li><li> Incubare campione HFT in 37 ° C, 5% CO 2 e 21% O 2, così come in 37 ° C, 5% di CO 2 e 2% O 2 per 24 h. </li><li> Dopo il tempo di incubazione prelevare il campione e conservarlo in fissativo Monti per almeno tre giorni a 4 ° C fino al SEM / TEM preparazione. </li></ol> 3. Preparazione del campione HFT per TEM <ol><li> PerTEM rimuovere dal campione fissativo Monti e tagliare 2 x 2 mm a 4 mm x 5 pezzi. Il tessuto rimanente può essere utilizzato per SEM. </li><li> Lavare pezzi con tampone sodio cacodilato, pH 7,35 per 1 h. </li><li> Incubare in 1% (w / v) tetrossido di osmio in aqua dest. durante la notte. </li><li> Rimuovere tetrossido di osmio in eccesso tramite lavaggio 6x5 min in tampone sodio cacodilato, pH 7,35. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua incubando in concentrazioni crescenti di etanolo in acqua (v / v) (30% per 2 h, 40% per 2 h, 50% per 2 h, 60% per 2 h, 70% durante la notte, 80% per 2 h, 90% per 1 h, 95% per 1 h, 100% per 1 h. </li><li> Lavare etanolo per 2 x 15 min in ossido di propilene e successivamente trasferire ad una miscela di 50% (v / v) Araldite preparata di fresco (inclusi tutti i componenti) in propilene e incubare durante la notte. </li><li> Trasferimento Araldite preparata (inclusi tutti i componenti) per almeno 1 h. </li><li> Trasferimento a formelle piatto e riempire con Araldite. </li><li> Lasciare indurire per Aralditealmeno 48 ore a 60 ° C </li><li> Dopo il taglio del campione incorporato taglio semi sezioni sottili (700 nm) su un ultramicrotomo utilizzando coltelli di vetro o un coltello isto diamanti e macchia con macchia di Richardson. </li><li> Tagliare ultra-sottili sezioni (circa 70 nm) con un coltello di diamante e il trasferimento alle reti in rame (ad esempio 150 maglie quadrate). </li><li> Stain ultra-sottili sezioni con acetato di uranile 0,5% (w / v) in aqua dest. seguita da 3% (w / v) citrato di piombo in acqua distillata. in sezione di coloratori automatico. In alternativa, le sezioni possono essere colorate manualmente lasciando griglie 15 min in una soluzione satura di acetato di uranile centrifugato in aqua dest. seguita da citrato di piombo 0,3% (w / v) in aqua dest. </li></ol> 4. Preparazione del campione HFT per SEM <ol><li> Per rimuovere SEM campione dal fissativo Monti, orientare con epitelio rivolto verso l&#39;alto su un foglio di 1 x 1.5 centimetri di sughero e stabilire la posizione utilizzando aghi di insetti. </li><li> Trasferimento campione sul sughero cestelli metallici adatti elavare per 30 min in tampone sodio cacodilato, pH 7,35. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua incubando campione in crescente concentrazione di acetone / acqua (v / v) 30% per 6 h, 40% per 6 h, 60% per 8 h, 70% durante la notte, 80% per 2 h, 90% per 2% e 100 h per tutta la notte (essere estremamente cauti per mantenere campione continuamente sommerso). </li><li> Trasferimento a fresco acetone 100% e campione secco mediante essiccazione punto critico (temperatura 40 ° C, pressione 80 bar). </li><li> Rimuovere aghi, sughero e di campioni di colla con l&#39;epitelio rivolto verso l&#39;alto sul monte campione SEM dotati di una scheda di carbonio conduttivo con cemento conduttivo di carbonio. Utilizzare liquido argento conduttiva per migliorare la conducibilità tra il monte e la scheda di carbonio conduttivo. </li><li> Preparare un rivestimento conduttivo platino, oro o palladio del campione con una polverizzazione spalmatrice. </li></ol> 5. La colorazione di sezioni sottili con Semi Stain Richardson <ol><li> Lasciate semi sezioni sottili a secco sul vetrino. </li><li> Colorazione con sezioni soluzione colorante a 60 ° C per 1-2 min. </li><li> Lavare in acqua distillata. </li><li> Sezioni a secco e applicare il coprioggetto. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi All&#39;interno del modello umano Falloppio infezione tubo siamo stati in grado di visualizzare differenze nella morfologia epiteliale tra i controlli non infetti (Figura 1) e il C. trachomatis - Tubi infetti (Figura 2), in condizioni normossica. Caratteristici differenze morfologiche implicita patogeni indotta gonfiore e lisi delle cellule epiteliali del tubo di Falloppio che non potevano essere rilevati in non-infetti controlli. Uso semi sezioni sottili e microscopia elettronica a trasmissione siamo stati in grado di dimostrare intracellulare C. inclusione formazione trachomatis in ex vivo infettato tessuto umano Falloppio tubo (Figura 3, 5) ma non in non-infette controlli (Figura 4). Come concentrazione di ossigenozioni del tratto genitale femminile sono già bassi in condizioni fisiologiche 11, e diminuire ulteriormente nel corso di un processo infiammatorio abbiamo indagato anche il nostro modello in condizioni di ipossia. I risultati preliminari indicano il modello è utile per analizzare la crescita Chlamydia e la progenie in varie concentrazioni di ossigeno. Chlamydia danno indotto cellule epiteliali deve essere separato da artefatti che sono mediati attraverso incauto preparazione e la manipolazione delle tube di Falloppio prima dell&#39;infezione (Figura 6). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Microscopio elettronico a scansione (SEM) di un non-umano infetto Falloppio dopo un giorno di incubazione in un mezzo di controllo (freccia verde mostrano delle cellule ciliate, freccia blu mostrano non-cellule ciliate). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Elettronico a scansione micros<html> copia (SEM) di un ex vivo C. trachomatis infezione umana tube di Falloppio uno dopo l&#39;infezione giorno (freccia bianca inclusione segno di rottura). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Semi sezioni sottili mostrano tipiche inclusioni intracellulari (frecce bianche) 1g dopo l&#39;infezione delle tube di Falloppio umana con C. trachomatis ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di un non-umano infetto tube di Falloppio dopo un giorno di incubazione in mezzo di controllo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di un ex vivo C. trachomatis infezione umana tube di Falloppio uno dopo l&#39;infezione giorno (frecce bianche segnano inclusioni clamidia). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Microscopio elettronico a scansione (SEM) di epitelio tube di Falloppio danneggiate attraverso la preparazione e la gestione incauta del campione (bianco frecce marchio distrutto tessuto epiteliale).

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	<li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping.">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li><li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility.">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li><li>Peipert, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Genital+chlamydial+infections.">Clinical practice. Genital chlamydial infections.</a> N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).</li><li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubal+factor+infertility,+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis.">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li><li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells.">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55 (2006).</li><li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells.">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li><li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection.">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li><li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo.">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li><li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin.">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li><li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring.">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Visualizzazione dei patogeni indotta da un danno al tessuto infetto è arduo e spesso limitata alle procedure sperimentali nei topi. Abbiamo stabilito un ex modello di infezione in vivo umani tube di Falloppio per analizzare C. trachomatis infezioni del tratto superiore dell&#39;apparato genitale femminile. Con l&#39;uso di questo metodo, siamo stati in grado di visualizzare C. trachomatis - danni per la salute umana indotta epitelio tube di Falloppio entro un giorno dopo l&#39;infezione. Rigonfiamento cellulare e lisi erano tipiche alterazioni morfologiche che sono stati osservati in C. trachomatis - infetti tube di Falloppio, ma non in non-infetti controlli. Le analisi hanno rivelato che TEM clamidie implementare un tipico ciclo di sviluppo intracellulare nei tessuti infetti, che mostra le inclusioni di grandi dimensioni con corpi elementari re-differenziati, ma anche piccole inclusioni con corpi reticolati allargata che potrebbero indicare la persistenza. Tuttavia, il quadro morfologico da sola non è sufficiente per discriminare tra replinfezioni icating e persistente, che sono caratterizzati da un ridotto metabolismo e una maggiore resistenza agli antibiotici 10. Distruzione dell&#39;epitelio in infetti tube di Falloppio o è dovuto alla rottura di C. trachomatis - infettate le cellule epiteliali dopo il completamento del ciclo di sviluppo e il rilascio intracellulare di malattie infettive corpi elementari o il rilascio di citochine pro-infiammatorie 8. Patogeni indotta danni ai tessuti e le reazioni immunitarie host-indotti contro C. trachomatis dovrebbero essere i principali fattori che portano alla perdita della funzione delle cellule epiteliali, fibroblasti e rimodellamento infertilità tubarica, infine in vivo 8,11. Uno dei limiti principali di questo modello è l&#39;assenza di cellule infiammatorie che ostacola l&#39;analisi degli effetti secondari al iniziale C. infezione da trachomatis dell&#39;epitelio tuba di Falloppio. Tuttavia, il modello è appropriate per indagare diverse condizioni ambientali (ad esempio il contenuto di ossigeno) e l&#39;iniziale host-risposta immunitaria acuta in C. infezioni trachomatis 8,9. Ulteriori progetti sono da stabilire un modello per i test degli antimicrobici nei confronti di C. trachomatis in interi tubi di Falloppio umani e di caratterizzare gli stati metaboliche dei diversi stadi di sviluppo osservate nell&#39;epitelio delle tube di 2 fotoni microscopia laser scanning.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloeximide </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG Buffer </td><td> vario </td><td></td><td> vedi ricetta qui sotto </td></tr><tr><td> Fissativo Monti </td><td> vario </td><td></td><td> vedi ricetta qui sotto </td></tr><tr><td> di sodio cacodilato tampone </td><td> vario </td><td></td><td> vedi ricetta qui sotto </td></tr><tr><td> Richardson di macchia </td><td> vario </td><td></td><td> vedi ricetta qui sotto </td></tr></tbody></table> Ricette: 1. SPG Buffer <ol><li> Aggiungere 75 g di saccarosio. </li><li> Aggiungere 2,47 g di fosfato disodico. </li><li> Aggiungere 0,36 g di fosfato monosodico. </li><li> Aggiungere 0,72 g di acido glutammico. </li><li> Riempire a 1 l con acqua distillata. </li><li> Regolare il pH a 7,3. </li></ol> 2. 0,1 M tampone cacodilato di sodio, pH 7,35. <ol><li> Aggiungere 42,80 g di sale di sodio dell&#39;acido dimethylarsenic. </li><li> Aggiungere 68,46 g di saccarosio. </li><li> Riempire a 1 l con acqua distillata. per ottenere di sodio 0,2 M tampone cacodilato. </li><li> Prima di usare la soluzione diluita con acqua distillata. a concentrazione desiderata e regolare il pH a 7,35 se necessario. </li></ol> 3. Fissativo Monti <ol><li> Aggiungere 156 ml di 0,12 M tampone sodio cacodilato. 3,2 Aggiungere 25 ml 25% di glutaraldeide in aqua dest. </li><li> Aggiungere 19 ml10% paraformaldeide in aqua dest. </li><li> Aggiungere 3 ml 3% CaCl 2 in aqua dest. </li><li> Regolare il pH a 7,35 e riempire con acqua distillata. 312 ml di soluzione finale. </li></ol> 4. Richardson macchia <ol><li> Mescolare parti uguali di blu di metilene 1% in 1% di soluzione acquosa di borace e l&#39;1% Azur II in aqua dest. </li></ol>

a human fallopian tube model for investigation of c. trachomatis infections

Infezioni del tratto genitale con Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) sono le più frequenti malattie sessualmente trasmesse nelle donne in tutto il mondo. Gioco inefficiente o persistenza dei patogeni può portare a salire infezioni del tratto superiore dell&#39;apparato genitale e si suppone di provocare danni cronica infiammatoria a 1,2 tessuti infetti. Di conseguenza, gravi sequele cliniche come la malattia infiammatoria pelvica (PID), occlusione tubarica e infertilità può verificarsi 3,4. La maggior parte della ricerca con C. trachomatis è stata condotta in linee cellulari epiteliali (ad esempio HEp-2 e cellule HeLa-229) o nei topi. Tuttavia, come coltura cellulare i modelli base, essi non riflettono la fisiologia del tessuto nativo, né la fisiopatologia della C. trachomatis infezioni del tratto genitale in vivo 5. Ulteriori limitazioni sono dati dal fatto che centrali cascata di segnalazione (per es IFN-γ mediated JAK / STAT pathway di segnalazione) che controllano la crescita intracellulare da Chlamydia sono fondamentalmente diverse tra i topi e gli esseri umani 6,7. Noi e gli altri quindi istituito un intero modello di tuba di Falloppio organo di indagare le interazioni dirette tra C. trachomatis e umano di Falloppio tubo di cellule ex vivo 8,9. Per questo scopo, umani tube da donne sottoposte a isterectomia sono stati raccolti e infettati con C. trachomatis sierotipo D. Entro 24 ore dopo l&#39;infezione, dove campioni analizzati mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per rilevare Chlamydia trachomatis mediato danno epiteliale e C. trachomatis formazione di inserimento nel tessuto di Falloppio.

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A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Si descrivono un<em&gt; Ex vivo infezione</em&gt; Modello per la visualizzazione delle interazioni dirette da agenti patogeni batterici con cellule umane tuba di Falloppio. L&#39;intero modello di tessuto organo è stato istituito per indagare<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Patologia indotta al tubo di Falloppio femminile in &quot;vita-come&quot; condizioni.

Un modello umano tube di Falloppio per le Indagini su<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infezioni

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient ...

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Research

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A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

12.8K Views.  University of Lübeck. Si descrivono un Ex vivo infezione Modello per la visualizzazione delle interazioni dirette da agenti patogeni batterici con cellule umane tuba di Falloppio. L'intero modello di tessuto organo è stato istituito per indagare C. trachomatis Patologia indotta al tubo di Falloppio femminile in "vita-come" condizioni.

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Ricerca

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modello murino di guarigione delle ferite

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induzione di aterosclerosi accelerata nei topi: il modello "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to the lack of markers or tools for the ovarian cancer identification, the early detection of HGSC remains challenging. Direct sampling of the fallopian tube can enhance sensitivity for detection of neoplastic cells when the tumor is not grossly visible. We developed a procedure to collect fallopian tube cells directly from freshly received surgical specimens, which has shown excellent correlation with histological findings. This approach lays a foundation for the future utility of minimally invasive laparoscopic screening in high-risk patient populations.

We explored a tubal cytologic method by sampling the fallopian tube directly post-surgical excision as a tool of ovarian cancer early detection. Here, we present a protocol to collect fallopian tube cells from freshly received surgical specimens.

Tubal Cytologia del Tubo Fallopiano come strumento promettente per il rilevamento precoce del cancro ovarico

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

Un metodo non invasivo per generare il modello di lesione cartilaginea intra-articolare indotta dal carico ciclico del ginocchio di ratto

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...