Agradecemos a los profesores, becarios, residentes y médicos asistentes del Hospital Brigham y de Mujeres, Departamento de Patología para la fabricación de tejido disponible para estos estudios. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación del Instituto de NIH / Nacional del Cáncer (P50 CA105009, K08 CA108748, CA152990 U01), el cáncer de ovario Fondo de Investigación, la Fundación de mayo de Kay, Novartis Pharmaceuticals, Robert y Deborah primer Fondo, Randi y Joel Cutler cáncer de ovario Fondo de Investigación, Marsha Rivkin Fundación - Premio Académico Científico, AACR - Jorge y Patricia Sehl de Becas para la Investigación de Genética del Cáncer y la Comunidad Médico Estadounidense de Medicina en Israel - Claire y Emmanuel G. Rosenblatt beca de la Fundación.

1. Preparación de colágeno y de revestimiento de filtro. <ol><li> Para preparar el colágeno de placenta humana, pinzas de 30 mg de colágeno de placenta humana y poner encima de 50 ml de agua destilada (dH 2 O) en un vaso de 500 ml con barra de agitación. </li><li> Añadir 100 μls de ácido acético glacial directamente en el colágeno para que sea más fácil de disolver. Calentar a 37 ° C y se remueve para disolver el colágeno. Se debe disolver en 20-30 minutos. Si fibras de colágeno permanecen en solución, la esterilización de filtro será difícil. </li><li> Diluir el stock de 50 ml con 450 ml de dH 2 O y el filtro a esterilizar con una membrana de 0,2 micras. Esta es la solución final de trabajo. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar membranas Transwell filtro por recubrimiento con colágeno (50-100 l) durante la noche. Colágeno refrigerados debe ser calentado a temperatura ambiente y luego añadió que el compartimiento superior para cubrir la membrana durante la noche y a temperatura ambiente. De las placas, la disociada de tubos primarios de Falopio (FT) epitelio (ver más abajo) en los filtros Transwell, lavar los filtros tres veces en 1X fosfato (PBS) al menos 1 hora antes de su uso para eliminar el exceso de colágeno. </li></ol> 2. Colección de tejidos y disociación. <ol><li> Las trompas de Falopio fresca (FT) fimbria se deben recoger en PBS estéril 1X en un tubo de centrífuga de 50 ml y se mantuvieron en hielo antes de la rápida transformación en una campana de cultivo de tejido estéril. </li><li> Lavar la muestra de tejido, una vez en 20 ml de PBS 1X frío (si la muestra ha sido recogida en otro tipo de medios de comunicación o se lava con sangre por lo menos 3 veces para deshacerse de tanta sangre y los medios de comunicación extranjeros como sea posible ya que esto podría interferir con la eficiencia de plaqueo). </li><li> Utilizando M estéril pinzas para la transferencia de una placa de cultivo de 10 cm de tejido con un poco de PBS y, utilizando un bisturí estéril y pinzas estériles, cortados longitudinalmente para maximizar la exposición de las células epiteliales. Abre la fimbria de modo que ya no es un tubo, pero una hoja casi plana de tejido. Luego se corta en trozos más pequeños, pero todavía recuperables (alrededor de 3 mm de diámetro). </li><li> Transferencia de las piezas a 45 ml de helado de medios de disociación (MEM que contiene 1,4 mg / ml y 0,1 Pronasa DNAsa mg / ml) en un tubo de 50 ml. </li><li> Roca suavemente a 4 ° C durante 24 a 72 horas. (A partir de la experiencia, las 48 horas es óptimo). Para comprobar la cantidad de disociación, poner una gota de disociación multimedia en una diapositiva y comprobar la cantidad de aglutinación y la viabilidad del tejido (superando a las células ciliadas). ¿Quieres ver tanto las células individuales y algunos pequeños grupos. </li></ol> 3. Revestimiento de las trompas de Falopio. <ol><li> Cuando el importe de la disociación de las células epiteliales es óptimo, inactivar los medios de comunicación mediante la adición de 10% en volumen de FBS. Invertir varias veces para desalojar a la suspensión de células en pequeños agregados. </li><li> Permita que los grupos grandes de tejidos (tejido estromal) para instalarse en la parte inferior del tubo. Eliminar los medios de comunicación que contiene las células epiteliales en un tubo de 50 ml segundo. </li><li> Añadir 50 ml de MEM fría (no FBS) en el tubo original de 50 ml. Invertir para recoger las células adicionales. Recoger los medios de comunicación en un tercer tubo de 50 ml (si la muestra es muy grande y un gran número de células se espera, este paso se puede repetir para maximizar la recolección de las células). Los grandes pedazos de tejido estromal / extracelular pueden ahora ser descartadas. Ahora tiene dos tubos de 50 ml de suspensión celular. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 minutos y los medios de comunicación aspirado disociación de gránulos de las células. </li><li> Resuspender en unos 5-10 ml de gobierno de Estados Unidos los medios de comunicación (DMEM: F12 suplementado con 2% y 1% de USG pluma estreptocócica) calentado a 37 ° C. Pipeta suavemente. Tenga cuidado de no pipetear con demasiada fuerza ya que podría dañar las células epiteliales y reducir la calidad de las culturas. No debe haber células individuales y pequeños grupos (Figura 1). </li><li> Transferencia en placas de cultivo Primaria e incubar por un mínimo de 1 hora o hasta 3 horas. Fibroblastos y las células rojas de la sangre se adhiere a la plástica, pero las células epiteliales de FT no. Echa un vistazo a la placa después de una hora para ver si hay algo que se pegue. La presencia de células ciliadas se puede ver observando el latido de los cilios. </li><li> Durante la incubación, los filtros de colágeno recubiertas pueden ser lavadas y listas para la siembra de células (véase el paso 1.4) </li><li> Después de 1-3 horas de incubación en las placas de Primaria, la transferencia de la suspensión de células a un tubo de 15 ml y enjuagar la placa de Primaria con 5 ml de medio USG, la transferencia de este medio en el tubo para hacer un volumen final de 15 ml. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 minutos. </li><li> Con cuidado aspirar los medios de comunicación y de no perturbar el sedimento celular. A juzgar por el tamaño de las pastillas, resuspender en la cantidad adecuada de gobierno de Estados Unidos los medios de comunicación. (Generalmente entre 1-3 ml) Menos es mejor en el inicio para que pueda diluir aún más si es necesario. Resuspender suavemente. </li><li> Añadir 10 l de las células se resuspendieron en un hemocitómetro y determinar la densidad celular. Sugerencias: Usted está en busca de células epiteliales que tienen una membrana celular claramente oscura y no en columnas. También puede contar con las células ciliadas que son definitivamente en movimiento. Células más pequeñas que tienen un halo de appearance son los glóbulos rojos y no deben ser contados. Habrá algo de aglomeración, por lo que necesita para estimar que en el recuento de células que. El objetivo de la siembra es de 1,65 x10 5 células / membrana, o por lo menos 75% de cobertura del filtro (Figura 1). Si las células son colocadas demasiado poco, las células no será capaz de formar una capa epitelial completa. </li><li> Añadir 500 l de los medios de comunicación gobierno de Estados Unidos a la parte inferior del pozo de una placa y 24 e insertar Transwell. El volumen requerido de la suspensión celular FT (ver arriba) se puede añadir a cada membrana, esto es normalmente 100 microlitros. </li><li> Incubar y crecer durante 1-2 días, sin molestar arriba de la membrana. Puede cambiar los medios de comunicación en la parte basal durante esos días si es necesario. Después de 1-2 días, usted puede enjuagar cuidadosamente la parte superior con el gobierno de Estados Unidos los medios de comunicación y agregar una pequeña cantidad (50 a 100 l) de los medios de comunicación en la parte superior de la membrana. Es más fácil determinar la confluencia de los cultivos celulares, si los medios de comunicación se retira de la parte apical de los filtros antes de microscopía. El compartimento inferior debe contener siempre los medios de comunicación. Una vez que las culturas son totalmente confluente (normalmente dentro de los 5 días), la cantidad de medios de comunicación que viaja a través de los filtros de la basal al lado apical debería ser insignificante. </li><li> Cambiar el medio basal una vez cada dos días durante los primeros 10 días. El compartimento inferior siempre debe tener los medios para mantener las células vivas. Una vez que las células han formado una capa apretada epitelial (Figuras 1 y 2) pueden ser utilizados en otros estudios, como la inmunofluorescencia (IF) o inmunohistoquímica (IHC). </li></ol> 4. Procesamiento de la membrana. <ol><li> Procesamiento de la membrana depende del tipo de estudio que se llevará a cabo, pero por lo general consiste en la extracción del filtro de los insertos Transwell. </li><li> Los filtros suelen ser lavadas 3 veces en 200 l de 1X PBS antes de la extracción. </li><li> Aspirar PBS de un lado apical y basal de los filtros. Esto se debe hacer un bien a la vez para evitar que las membranas de la desecación. </li><li> Extraiga la tapa de la placa, dar la vuelta al revés y el uso de un bisturí estéril para cortar alrededor de la membrana. Trate de eliminar la membrana de una sola pieza mediante cortes rectos en todo el borde de la membrana, en lugar de arrastrar el bisturí en el borde. </li><li> Utilizar pinzas para quitar el filtro de la inserción, el seguimiento de qué lado se encuentran en las células. El filtro puede ser procesada por IF, IHC, etc, según corresponda. </li><li> Ejemplo: Si los estudios para el filtro (después de la fijación, la permeabilización, el bloqueo y la incubación con los anticuerpos adecuados, según la norma SI procedimientos) se debe colocar en una diapositiva, las células hacia arriba, Vectashield con DAPI se deja caer sobre el filtro y la cubierta con una vidrio cubreobjetos. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Los filtros Transwell puede ser fácilmente removido para examinar el epitelio ex vivo tanto por inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF). Utilizando marcadores específicos del linaje, se puede cuantificar la imagen y la secreción (PAX8 positivo) y ciliados (Sall2 positivo) compartimentos celulares en estas culturas (Figura 3). Además, el uso de estos marcadores, se puede controlar cómo cada tipo de célula responde a diferentes señales fisiológicas 10. Este sistema se ha utilizado para caracterizar los cambios en la phosphoproteome secretoma e intracelular del epitelio de FT en respuesta a diversos estímulos. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ilustración que muestra cómo las culturas ex vivo se generan a partir de tejido humano primario trompa de Falopio. Tejido del tubo de Falopio fimbrial se obtiene de la sala de operaciones y picado para generar fragmentos pequeños de una que se lavan y se incuban con la disociación medios de comunicación durante 24-72 horas 2. Después de la disociación es completa, los fragmentos de tejido se asientan en el fondo del tubo de incubación y los medios de comunicación que contiene las células epiteliales disociada se cosecha 3. La eficiencia de la disociación se puede controlar mediante el examen bajo un microscopio de 4 de contraste de fase. Las células epiteliales se disocia entonces cultivadas en placas de Primaria para ayudar a eliminar los fibroblastos y las células hematopoyéticas que, invariablemente, mezclado con las células epiteliales 5. Una vez que las células epiteliales no son eliminadas adecuadamente, las células epiteliales se siembran en Transwell filtros que están recubiertas de colágeno de placenta humana 5. Los medios de comunicación es proporcionado por la difusión a través de la Transwell desde abajo. Los cultivos se incuban durante 24-48 horas y luego los medios de comunicación apical es removido. Los cultivos ex vivo luego se dejan crecer durante 5-8 días para formar un césped lleno, completo en los filtros Transwell. Los cultivos ex vivo se puede mantener de manera viable en este estado durante un máximo de 4 semanas. La caricatura 5 muestra una representación de la cultura vivo totalmente crecido ex con un ejemplo de un filtro elimina de la inserción y teñidas con hematoxylin y eosina (H &amp; E) para demostrar la polaridad y la arquitectura del epitelio ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Microscopía de campo claro de FT culturas ex vivo. Inserciones Transwell están cubiertas con la placenta humana poros colágeno 0.4μm son visibles (a). Células epiteliales de FT se cultivan en los insertos de colágeno recubiertas (b), donde forman una capa epitelial (c). Algunos escombros se observa normalmente adherirse a las células epiteliales en la cultura (indicado por las flechas), con más frecuencia a las células ciliadas. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. FT ex vivo la cultura de inmunofluorescencia (IF). Ejemplos de si las imágenes de las culturas ex vivo fijadas y teñidas con anticuerpos contra (a) secreción (PAX8) y (d) los marcadores de células ciliadas (Sall2). DAPI se utiliza como un control para la localización de los núcleos de las células (azul) (B y E) y el anticuerpo fusionado y DAPI también se muestra (C y F). El número de las células depende de la cantidad de tiempo que las células están en la cultura (PAX8 tinción, los 7 días; Sall2 manchas, 3 días).

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Dr. Drapkin es consultor de Novartis Pharmaceuticals. No hay otros autores declaren cualquier conflicto de interés potencial.

La identificación de la FT como un sitio candidato de origen para el SOC ofrece la oportunidad de la investigación básica y translacional orientada a descifrar los mecanismos que vinculan factores de riesgo conocidos y el actual proceso carcinogénico serosa. Crítico de esto es el desarrollo de sistemas modelo manejable que nos permitirá comenzar a probar la hipótesis de que la FTSEC es una célula de origen de la pelvis carcinomas serosos. El modelo in vivo la cultura ex descritos en este documento es un novedoso sistema que permite el aislamiento y la co-cultura de la secreción FT primario y las células ciliadas de una manera que preserva la morfología y la biología del epitelio FT nativo. El uso de este sistema, caracterizado recientemente secretoma de este epitelio y la forma en que el epitelio responde a daños mecánicos y genotóxico 10. La ovulación, un factor de riesgo más importantes asociados con la tumorigénesis de ovario, se caracteriza por una combinación de lesión de los tejidos, los mediadores inflamatorios, factores de crecimiento y hormonas 11. Este sistema podría ser utilizado para estudiar el efecto de un medio de ovulación en la respuesta y la viabilidad de las células ciliadas y secretoras. Además, el impacto de otros tipos de células (es decir, células inflamatorias) podría ser examinado para permitir una mejor comprensión de los acontecimientos que conducen a la celda de tipo de diferenciación y los factores que contribuyen a la transformación neoplásica de estas células. Modelos similares han sido descritos en otros tejidos en el epitelio polarizado está presente. Por ejemplo, en el polarizado cultivos primarios de epitelio de las vías, el efecto de herregulina sobre el crecimiento celular y la respuesta al daño celular se evaluó 12. Estos tipos de sistemas de modelos proporcionan una manera nueva y útil para estudiar el inicio y la patogénesis de los tumores que se derivan de los tejidos epiteliales, y esto es de vital importancia en los tejidos, como el Financial Times, donde no hay líneas de células existen en la actualidad, y donde hay una gran necesidad de la identificación de las principales vías y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM:F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>15-090-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultroser G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Chemical Company</td>
<td>67042</td>
<td>Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Primaria culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>353802</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 well Transwell Permeable supports</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning (Costar)</td>
<td>3470</td>
<td> Clear, 6.5 mm insert, 0.4 &mu;m pore size, treated polyester </td>
</tr>
<tr>
<td>MEM (Minimal Essential Media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11459643001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sall2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr T. Benjamin, Harvard</td>
<td>Gift</td>
<td>1:20 dilution</td>
</tr>
<tr>
<td>Pax8 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proteintech</td>
<td>10336-1-AP</td>
<td>1: 1000 dilution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells

Cáncer epitelial de ovario es la principal causa de mortalidad por cáncer de mujeres en los Estados Unidos. A diferencia de otros específicos para las mujeres el cáncer, como carcinomas de mama y útero, donde las tasas de mortalidad han disminuido en los últimos años, las tasas de curación del cáncer de ovario se han mantenido relativamente sin cambios durante las últimas dos décadas 1. Esto se debe principalmente a la falta de herramientas de evaluación adecuadas para la detección de la enfermedad en etapa temprana, cuando la cirugía y la quimioterapia son más eficaces 2, 3. Como resultado, la mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad en estadio avanzado y la participación abdominal difuso. Esto se complica aún más por el hecho de que el cáncer de ovario es una enfermedad heterogénea con múltiples subtipos histológicos 4, 5. El carcinoma de ovario seroso (SOC) es el subtipo más común y agresiva y la forma más frecuentemente asociada con mutaciones en los genes BRCA. Los actuales modelos experimentales en este campo incluyen el uso de líneas celulares de cáncer y los modelos de ratón para comprender mejor los sucesos iniciadores genética y la patogénesis de la enfermedad de 6, 7. Recientemente, la trompa de Falopio se ha convertido en un nuevo sitio para el origen del SOC, con la trompa de Falopio (FT) de células epiteliales secretoras (FTSEC) como la célula de origen propuesta 8, 9. Actualmente no hay líneas celulares o sistemas de cultivo disponible para estudiar el epitelio FT o la FTSEC. Aquí se describe una nueva ex vivo sistema de cultivo en células primarias de FT epiteliales humanas se cultivan de manera que conserve su arquitectura, la polaridad, inmunofenotipo, y la respuesta al estrés fisiológico y genotóxicos. Este modelo ex vivo es una herramienta útil para el estudio del SOC, lo que permite una mejor comprensión de cómo los tumores pueden surgir de este tejido, y los mecanismos implicados en la iniciación y progresión del tumor.

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

La trompa de Falopio (FT) se está convirtiendo en un sitio alternativo de origen para el carcinoma de ovario seroso (SOC). Este protocolo describe un nuevo método para el aislamiento y<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de células epiteliales del tubo de Falopio. Este recapitula el sistema<em&gt; In vivo</emEpitelio&gt; y permite el estudio de la patogénesis del SOC.

Ex Vivo Cultura de células humanas primarias epiteliales del tubo de Falopio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

ex-vivo-culture-of-primary-human-fallopian-tube-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

19.5K vistas.  Dana-Farber Cancer Institute. La trompa de Falopio (FT) se está convirtiendo en un sitio alternativo de origen para el carcinoma de ovario seroso (SOC). Este protocolo describe un nuevo método para el aislamiento y Ex vivo Cultivo de células epiteliales del tubo de Falopio. Este recapitula el sistema In vivo y permite el estudio de la patogénesis del SOC.

Video: Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primaria células epiteliales bronquiales Cultivada a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas epiteliales de la piel humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura de embriones de ratón con la piel y en vivo de imágenes de melanoblasto Migración

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Lentivirus óptimo de producción y el cultivo celular condiciones necesarias para la transducción de éxito células epiteliales bronquiales humanos primarios

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

Modelo alveolar humano multicelular compuesto por células epiteliales y células inmunes primarias para la evaluación de riesgos

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...