Damos las gracias a Andy Johnson, del Centro de Investigación Biomédica de la UBC para la asistencia con el análisis de FACS. Financiación de Investigación del Cáncer en el Laboratorio de Wong es proporcionada por la Sociedad Canadiense del Cáncer del Instituto de Investigación (subvención de funcionamiento # 019250) y de Reinversión de los fondos de investigación de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la UBC. JMYW con el apoyo de las Cátedras de investigación de Canadá y la Michael Smith Foundation para los programas de Investigación en Salud de desarrollo profesional.

1. Preparación de la célula <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="Figura 0" /> <ol><li> Células de placas para lograr una densidad de aproximadamente el 60% de confluencia. Las células deben estar en fase de registro en el momento de la recolección. Para las células MCF7, esto se logra mediante la siembra menos 5 x 10 5 células / placa 10 cm en los medios apropiados. HT29 y LS180 células se sembraron a 6 x 10 5 células / placa 6 cm. Se utilizó medio DMEM suplementado con FBS al 10% y 1x penicilina / estreptomicina. Asegúrese de placas de semillas para los controles adecuados positivos y negativos enAdemás de las muestras de la prueba. Estos incluyen los siguientes: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> yo </td><td> control positivo </td><td> BrdU sólo </td></tr><tr><td> ii </td><td> control positivo </td><td> PI sólo </td></tr><tr><td> iii </td><td> control negativo </td><td> BrdU negativo, negativo PI </td></tr></tbody></table> (Debe señalarse que un experimento preliminar con puntos de tiempo múltiples tales como la descrita en este protocolo se puede utilizar para limitar el marco de tiempo durante el cual llevar a cabo las colecciones futuras.) <ol start="2"><li> Las células cultivadas en placas se incuban a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24-48 h, permitiendo así que las células de recuperar y adjuntar. </li><li> Para pulsar las células de la etiqueta con bromodesoxiuridina (BrdU), se sustituye wi DMEMª medio fresco que contiene 10 mM BrdU. Las células se incubaron durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2 para permitir la incorporación de BrdU en el DNA. Asegúrese de dejar una placa no se trata de actuar como control negativo. </li><li> Los medios de etiquetado pulso es eliminado y las células se enjuagan brevemente con 1X PBS. </li><li> Medios frescos de crecimiento se añade (menos el BrdU) y las células se permite que continúe a incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta el punto de tiempo apropiado para la cosecha se alcanza. </li></ol> 2. La recolección y fijación <ol><li> Las células no tratadas desde el paso 1.3 se consideran el punto de tiempo cero. Esta muestra se pueden cosechar junto con el punto de tiempo de 1 h que se recoge inmediatamente después del tratamiento BrdU. </li><li> Para cosechar las células, los medios se retira y las placas se enjuagaron una vez con PBS 1X. </li><li> Las células se tripsinizaron, se recogió en medios de cultivo y se sedimentaron luego por centrifugación a 1500 rpm durante 5 min Supernatant se descarta. </li><li> Enjuague 1-10 x 10 6 células en 5 ml de hielo frío PBS 1X. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 min sobrenadante se descarta. </li><li> El pellet de células se resuspende en 100 l de PBS enfriado en hielo / 1% de FBS. La adición de FBS al 1% en PBS ayudas en la prevención de aglutinación celular. </li><li> Añadir estas células gota a gota a 5 ml de -20 ° C, 70% de etanol para fijar las células. </li><li> Incubar en hielo durante 30 min o almacenar a 4 ° C durante la noche. Este es un paso ideal en que se detiene la recogida de muestras de los diversos momentos. Las muestras se pueden dejar en etanol durante varios días, lo que les permite ser procesadas simultáneamente a través del resto del protocolo. </li></ol> 3. BrdU y tinción PI <ol><li> Pellets células por centrifugación durante 5 min a 1500 rpm. </li><li> Retire el fijador, pero deje ~ 50 l en el que de aflojar el sedimento por agitación. </li><li> Para desnaturalizar el ADN, se añade lentamente 1 ml de HCl 2N / Triton X-100gota a gota, mientras que un vórtice. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Pellets células por centrifugación de las muestras durante 5 min a 1500 rpm. Aspirar y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml de tetraborato sódico 0,1 M, pH 8,5, para neutralizar el paso de desnaturalización. </li><li> Centrifugar las células durante 5 min a 1500 rpm. Aspirar y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 75 l de mezcla de tinción BrdU (50 l 0,5% de Tween 20/1% de BSA / PBS + 20 l conjugado con FITC anti-BrdU + 5 l 10 RNasa mg / ml). </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos protegido de la luz. </li><li> Para precipitar las células, centrifugar las muestras durante 5 min a 1500 rpm. Aspirar y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS que contenía 5 ug / ml de yoduro de propidio. </li></ol> 4. Citometría de Flujo <ol><li> Para analizar las células, un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nm y elfiltros adecuados es necesario. El software de análisis tales como CellQuest es necesaria la creación de las parcelas se describen a continuación. </li><li> Cuando se ejecuta la muestra a través del citómetro de flujo, crear una dispersión hacia adelante (SSC-H) vs dispersión lateral (FSC-H) plan para garantizar la distribución del tamaño apropiado de las células (Figura 1A). Ambos de estos parámetros se trazan en una escala lineal. </li><li> Al mismo tiempo ver una parcela de FL3-H (IP mancha) vs FL2-W (fig. 1B). Esta trama se utiliza para crear una puerta (R3) para aislar la fracción de células que están dentro del patrón de distribución normal del ciclo celular. En general, este patrón de distribución se caracteriza por dos grupos de células de la contenido de ADN 2N y 4N de tinción PI que representa el G1 y G2 fases del ciclo celular, respectivamente. Una cadena de células situadas entre estos 2 grupos es representativo de la replicación del ADN en curso que se produce en la fase S del ciclo celular. </li><li> Crear un plan displaying las células cerradas (R3) desde el paso 4.3, con FL1-H (FITC, gráfico log) en el eje y PI (gráfico lineal) en el eje x (fig. 1C). Esta parcela se utilizará para establecer los parámetros restantes en los diversos controles descritos en el punto 1.1, así como para recopilar datos para el análisis. </li><li> Coloque el PI sólo muestra teñida en el citómetro. Ajuste la ganancia para colocar en el G1 ~ 200 en el eje x. Esto será más fácil de visualizar en un histograma de la mancha de PI. </li><li> Un segundo control implica la ejecución de una muestra de BrdU-sólo en el citómetro de flujo. Ajuste la ganancia para que las 2 poblaciones de células (BrdU positivos vs negativos BrdU) aparecen en la trama. Idealmente, las células BrdU negativas están posicionados para aparecer justo por debajo de 10 -1. </li><li> El control final es la muestra de BrdU / PI negativo. Ejecutar este control negativo para asegurar que las células no aparecen en cualquiera de los cuadrantes de la mano derecha o superiores. </li><li> Una vez que los parámetros de las distintas parcelas se han establecido, elcitómetro de flujo está calibrado y listo para el procesamiento de las células BrdU y PI manchados. Un mínimo de 10.000 células que se encuentran cerrada en la correcta fracción de PI (consulte el paso 4.3) debe ser leído por colección. </li><li> Para analizar los datos recogidos, el software como FlowJo o FACSDiVa se utilizan. Cada una de las parcelas antes mencionadas pueden ser recreados en estos programas y realizar un análisis cuantitativo y estadístico. </li><li> El punto final del análisis implica varias etapas sucesivas. La creación de una parcela de FITC vs PI con células cerradas como positivo de la trama PI vs FL2 W-PI permite distinguir la población ciclista. Una segunda puerta se crea a partir de esta trama mediante el aislamiento de la población BrdU positivas. Expresando esta población distintiva en un histograma con la PI en el eje X permite realizar un seguimiento de la evolución temporal de la progresión del ciclo celular. Esto puede ser aún más visualizaron mediante el trazado de la cantidad de BrdU de células positivas con G1 o G2 contenido como una función del tiempo. </li></ol> 5. Los resultados representativos Normalmente las células ciclismo teñidas con yoduro de propidio tienen picos distintos a G1 y G2, que corresponden a las células que contienen el contenido de ADN 2N y 4N, respectivamente (Figura 2). Pulso etiquetado con BrdU permite etiquetado selectivo de una subpoblación de células que están activamente sintetizando ADN (fase es decir, S). Poco después de la eliminación del reactivo BrdU, todas las células marcadas se encuentran en la fase S (Figura 3). Al restringir el etiquetado de un pulso corto uno es capaz de seguir este momento distintas sub-población de las células a lo largo de numerosos puntos de tiempo a medida que pasan a través de las siguientes fases del ciclo celular. Esto puede ser visualizada en el punto de tiempo de 1 h en la Figura 3 como una clara falta de G1 y G2 picos. Información adicional se puede derivar de la etapa de etiquetado BrdU. No sólo la proporción de células que se dividen activamente medir, pero una estiMate de distribución etapa del ciclo celular entre dos muestras se puede determinar también. Por la recolección de células a intervalos igualmente espaciados después de la eliminación del reactivo BrdU, las células pueden rastrearse a medida que continúan ciclo, el progreso de G2 y finalmente se mueven a través de la división celular de las células originales, finalmente emergiendo como células hijas BrdU-positivas con G1 contenido de ADN (Figura 4). Un ejemplo de cuantificación fase del ciclo celular y análisis cinético se proporciona en la Figura 5. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) la dispersión hacia adelante en comparación con gráfico de dispersión lateral de un representante de la población de células MCF7. (B) PI en función del ancho (FL-W) Parcela de una población de células MCF7 representante. De apertura de puerta se muestra para excluir dobletes de células en el análisis final (R3). Dobletes celulares tendrán un mayor ancho de pulso de una sola célula, ya que tardan más en pasar a través del rayo láser y therefmineral puede excluirse del análisis. (C) en comparación con FITC PI (BrdU) Parcela de una muestra representativa de células MCF7. De apertura de puerta se muestra para incluir sólo los FITC (BrdU) células positivas (R4). <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gráfico representativo histograma de una población total de células normalmente bicicleta. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Histograma de las células que han sido recogidos 1h después de la eliminación del impulso de BrdU, después de compuerta para FITC (BrdU)-células positivas. BrdU de células positivas en un punto de tiempo temprano después de la eliminación de etiqueta muestran perfiles de PI que corresponden a las muestras que muestra el contenido de ADN consistente con las células que están en la fase S del ciclo celular, lo que confirma el etiquetado con éxito de células sólo durante la síntesis de ADN. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig4.jpg" a<html> lt = &quot;Figura 4&quot; /&gt; Figura 4. Comparación de la cinética de progresión del ciclo celular entre las líneas celulares de cáncer, cánceres de colon HT29 (A) y LS180 (B), así como el cáncer de mama MCF7 (C). Las células se recogieron cada hora durante 8 horas, tras la eliminación del impulso de BrdU. En este experimento, se observó un perfil claro de la progresión acelerada del ciclo celular a través de la fase G2 del ciclo celular en la LS180 línea celular de colon. Comparación de la cinética entre los dos perfiles de células de cáncer colorrectal, la aparición de un pico G1 es evidente en T = 4 horas después de BrdU en las células LS180, en comparación con el punto en el tiempo correspondiente a la línea de células HT-29, que carece de este pico. En comparación con cualquiera de las dos líneas celulares de colon, las células MCF7 en bicicleta a un ritmo significativamente reducido. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig4large.jpg">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <html> volver 5 &quot;/&gt; Figura 5. (A) del ciclo celular fase de análisis cuantitativo de las células cancerosas BrdU marcado. El algoritmo de Decano / Jett / Fox se aplicó a HT29, LS180 y MCF7 (ilustrado en color verde). Las células resultantes distribuciones de fase del ciclo de cada muestra se expresa como porcentaje del total de BrdU de células positivas para cada fase. Sólo selecciona los puntos de tiempo para cada línea celular se muestran, como los análisis de algunos de los puntos de tiempo anteriores produjeron resultados no válidos. En estos puntos de tiempo anteriores, todas las células BrdU-positivas están en fase S y por lo tanto carecen G1 distinta y picos G2, que son necesarias para la aplicación del algoritmo. (B) histogramas de las células cancerosas que muestra la cinética de la progresión a través de G2 / M fases del ciclo celular. La progresión a través G2 / M fases es el más rápido de las células LS180, seguido por HT29 y MCF7. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig5large.jpg">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <html> jpg &quot;alt =&quot; Figura S1 &quot;/&gt; Figura S1. Controles de citometría de flujo. MCF7 células se muestran como (A) control negativo donde las células no son ni PI ni manchada BrdU. (B) PI tiñen solamente. (C) BrdU marcado con FITC muestras. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS2.jpg" alt="Figura S2" /> Figura S2. Esquema ilustración que muestra la relación entre espectro de emisión fluorescente de PI frente a FITC (BrdU). Las ventanas de recogida espectrales para canal fluorescente 1 (FL1, para FITC) y el canal fluorescente 3 (FL3, para PI) se muestran en las cajas correspondientes. No hay solapamiento entre los espectros de fluoróforo FL1 y detección FL3. Evidentemente, la compensación de fluorescencia no es necesario cuando los datos experimentales de PI y FITC-co-BrdU marcado células se recogen en los FL1/FL3 canales, respectivamente. Espectros de fluorescencia se obtuvieron a partir de BD Biosciences página web:target = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045figS2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Mediante la combinación de la citometría de flujo con la incorporación de BrdU, tenemos las herramientas necesarias para estudiar la cinética del ciclo celular. La característica distintiva de BrdU para funcionar como un análogo de la timidina es lo que permite la cuantificación de ADN contenido de una celda de ciclismo. La incorporación de BrdU en una hebra de ADN hija creciente durante la fase de síntesis del ciclo celular es lo que permite seguir una subpoblación de células de ciclismo a través de la repl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> bromodesoxiuridina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td> yoduro de propidio </td><td> Sigma </td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml de valores </td></tr><tr><td> FITC anti-BrdU </td><td> Becton Dickinson </td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td> tetraborato de sodio </td><td> Pescador </td><td> S80172 </td><td> 0,1 M, pH 8,5 </td></tr><tr><td> Calibre FACS </td><td> Becton Dickinson </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

El control preciso de la iniciación y progresión posterior a través de las distintas fases del ciclo celular son de importancia primordial en la proliferación de las células. La división celular ciclo es una parte integral del crecimiento y la reproducción y la desregulación de los principales componentes del ciclo celular han sido implicados en los eventos precipitantes de 1,2 carcinogénesis. Agentes moleculares en terapias contra el cáncer con frecuencia buscan vías biológicas responsables de la regulación y la coordinación de la división del ciclo celular 3. Aunque la cinética del ciclo celular tienden a variar según el tipo de célula, la distribución de las células entre las cuatro fases del ciclo celular es bastante consistente dentro de una línea celular particular debido al patrón consistente de mitógeno y la expresión del factor de crecimiento. Eventos genotóxicos y otros factores de estrés celular puede resultar en un bloqueo temporal de la progresión del ciclo celular, lo que resulta en la detención o una pausa temporal en una fase del ciclo celular particular para permitir a las institucionesgación del mecanismo de respuesta adecuada. La capacidad de observar experimentalmente el comportamiento de una población de células con referencia a su etapa progresión del ciclo celular es un avance importante en la biología celular. Los procedimientos comunes, tales como mitótico quitarse de encima, centrifugación diferencial o de la clasificación de citometría de flujo basada en se utilizan para aislar las células en determinadas fases del ciclo celular 4-6. Estos fraccionados, del ciclo celular enriquecidos fase-poblaciones son luego sometidos a tratamientos experimentales. Rendimiento, la pureza y la viabilidad de las fracciones separadas a menudo puede ser comprometida utilizando estos métodos de separación físicos. A su vez, el lapso de tiempo entre la separación de las poblaciones de células y el inicio de un tratamiento experimental, mediante el cual las células fraccionadas puede pasar de la fase del ciclo celular seleccionado, pueden presentar retos significativos en la implementación exitosa y la interpretación de estos experimentos. Otros enfoques para stUdy etapas del ciclo celular incluyen el uso de productos químicos para sincronizar las células. El tratamiento de células con inhibidores químicos de los principales procesos metabólicos para cada fase del ciclo celular son útiles para bloquear la progresión del ciclo celular a la siguiente etapa. Por ejemplo, el ribonucleótido reductasa hidroxiurea detiene las células en la coyuntura G1 / S mediante la limitación de la oferta de desoxinucleótidos, los bloques básicos del ADN. Otros productos químicos notables incluyen el tratamiento con afidicolina, un inhibidor de la alfa polimerasa para la detención G1, el tratamiento con colchicina y nocodazole, ambos de los cuales interfieren con la formación de huso mitótico para detener las células en fase M y finalmente, el tratamiento con el ADN terminador de la cadena 5-fluorodeoxyridine iniciar a S fase de la detención 7.9. El tratamiento con estos productos químicos es un medio eficaz para sincronizar una población total de células en una fase particular. Con la eliminación de la sustancia química, las células de reunirse con el ciclo celular al unísono. El tratamiento de la versión de prueba siguiente agentea partir de la química del ciclo celular de bloqueo asegura que la respuesta al fármaco provocó es de un uniforme, ciclo celular etapa específica de la población. Sin embargo, dado que muchos de los sincronizadores químicos son compuestos conocidos genotóxicos, separando la participación de diversas vías de respuesta a los sincronizadores (frente a los agentes de prueba) es un reto. Aquí se describe un método de marcaje metabólico para el seguimiento de una subpoblación de células activamente bicicleta a través de su progresión desde la fase de replicación del ADN, a través de la división y la separación de sus células hijas. Junto con la cuantificación de citometría de flujo, este protocolo permite la medición de la progresión cinética del ciclo celular en ausencia de ya sea mecánicamente o químicamente inducida celular subraya comúnmente asociada con otras metodologías de células de sincronización del ciclo 10. En las siguientes secciones vamos a discutir la metodología, así como algunas de sus aplicaciones en la investigación biomédica.

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Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Rastreo cambios sutiles en la progresión y la cinética de las fases del ciclo celular puede llevarse a cabo mediante el uso de una combinación de marcaje metabólico de los ácidos nucleicos con BrdU y tinción de ADN genómico total a través de yoduro de propidio. Este método evita la necesidad de sincronización química de ciclo de las células, impidiendo así la introducción de daño en el DNA no específico, que a su vez afecta a la progresión del ciclo celular.

Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

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Research

JoVE Journal

Biology

21.0K vistas.  University of British Columbia. Rastreo cambios sutiles en la progresión y la cinética de las fases del ciclo celular puede llevarse a cabo mediante el uso de una combinación de marcaje metabólico de los ácidos nucleicos con BrdU y tinción de ADN genómico total a través de yoduro de propidio. Este método evita la necesidad de sincronización química de ciclo de las células, impidiendo así la introducción de daño en el DNA no específico, que a su vez afecta a la progresión del ciclo celul...

Video: Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Investigación

Biología

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Citometría de flujo basado Purificación de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Los cigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Medición de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endorreduplicación medición por citometría de flujo de protoplastos aislados de tubérculos

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Methods Article

Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo