Los autores gustaría dar las gracias a las siguientes personas por sus contribuciones técnicas e intelectuales para el desarrollo de estos métodos a través de los años: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis celular Ciencia e Investigación PTI) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), y Mary Waugh (Dartmouth Medical School). También me gustaría dar las gracias a la clase de Bowdoin 2006 de los Cursos Anuales de Métodos de Investigación y Aplicaciones de la citometría de flujo, lo que generó los datos mostrados en la Figura 2. Citometría de flujo se realizó en el Laboratorio de Roswell Park Cancer Institute Citometría de flujo, que se estableció en parte por donaciones de equipo del Programa de Instrumentos NIH compartido, y recibe el apoyo de la Beca Core (5 P30 CA016056-29) de la NationalInstituto del Cáncer Roswell Park para el Cáncer del Instituto, y en la Citometría de Flujo Abramson Cancer Center y clasificación de células Laboratorio de Recursos de la Universidad de Pennsylvania, que fue establecida en parte por donaciones de equipo del Programa de Instrumentos NIH compartido, y recibe el apoyo de NIH # 2P30 CA016520 del Instituto Nacional del Cáncer. La obra se muestra en las figuras 3 y 5 también fue apoyado en parte por subvención SBIR EB00228 del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (NIBIB) otorgó a PTI Research, Inc.

1. Etiquetado general de membrana con PKH26 Tracking Dye Celular (Ref. 25, Figura 1) <ol><li> Utilice una técnica estéril para los pasos 1,1 hasta 1,9. Preparar ~ 10 7 células humanas mononucleares de sangre periférica o los linfocitos (hPBMC, HPBL) utilizando el método estándar del laboratorio con la adición de un centrifugado final 300 xg para minimizar la contaminación por plaquetas. Resuspender las células en 10 7 / ml en HBSS BSA 1% y colocar en hielo, reservando una parte alícuota de 500 l (5x10 6 células) para uso en la Etapa 2. </li><li> Coloque 5x10 6 células (500 l) en un tubo de 12 x 75 mm de polipropileno cónico. Lavar una vez con 3,5 ml de HBSS. Aspirar con cuidado el sobrenadante, dejando no más de 15-25 l de fluido residual, pero teniendo cuidado de no eliminar las células. Utilice este tubo para preparar una suspensión de células 2x en el paso 1,4. </li><li> Durante el lavado de células en el paso 1,2, añadir 0,5 ml de diluyente de vehículo etiquetado C (del kit de PKH26GL) a un tubo de 12 x 75 mm de polipropileno cónico. Utilice este tubo para prepararson un 2x PKH26 solución en el paso 1,5. </li><li> Añadir 0,5 ml de diluyente de vehículo etiquetado C a la célula sedimento lavado de la Etapa 1,2 y aspirar y dispensar 3-4 veces para obtener una suspensión de células individuales (células 2x). Evitar la formación de burbujas y el exceso de mezcla, que pueden reducir la viabilidad celular y la recuperación. </li><li> Inmediatamente después de la preparación de la suspensión de células 2x en el paso 1,4, preparar un 2x (4 mM) solución de colorante añadiendo 2,0 l de 1,0 mM PKH26 stock de tinte en etanol (del kit de PKH26GL) al tubo C Diluyente preparado en el Paso 1,3 y vórtice a dispersar uniformemente. </li><li> Inmediatamente después de la preparación de la solución de colorante en el paso 2 x 1,5, rápidamente pipetear la suspensión de células a partir del paso 2 x 1,4 a 2 veces la solución de colorante y al mismo tiempo aspirar y dispensar 3-4 veces para dispersar completamente las células en tintes No:. Añadir 1,0 mM tinte directamente a células, verter las células 2x 2x en el tinte, o añadir celdas 2x 2x colorante mientras se agitaba. Debido a que la tinción es casi instantánea, tales métodos producen menosintensidades uniformes que el método recomendado (Figura 2). </li><li> Después de 1 min, añadir 1,0 ml de suero inactivado por calor o BSA HBSS +5% para detener la absorción de colorante en las membranas celulares. Si no se utiliza suficiente proteína corre el riesgo de la formación de agregados de colorantes, que pueden pellet con las células durante los pasos de lavado y causar etiquetado no deseada de otras células presentes en un experimento. Si el medio de calor con 10% de suero inactivado (CM) o HBSS 1% de BSA se va a usar como el reactivo de parada, llevar a cabo la tinción en un tubo de polipropileno cónico de 15 ml y añadir al menos 5,0 ml de reactivo de parada para asegurar la adsorción de todos colorante no incorporado. </li><li> Centrifugar las células marcadas por 5 min @ ~ 400 x g. Aspirar con cuidado el sobrenadante sin necesidad de retirar las células. Lavar el sedimento dos veces con 4 ml de HBSS CM o BSA 1%, la dispersión de la pastilla antes de recentrifugación. Para minimizar el arrastre de tinte adsorbido sobre las paredes del tubo y maximizar la eficiencia del lavado, transferir las células a un tubo de polipropileno de fresco después de la first resuspensión. Nota: adecuadamente células teñidas se muestran un matiz distinto color rosa en el pellet. </li><li> Resuspender el sedimento celular lavado en 1,0 ml de BSA% HBSS +1. Contar las células, determinar la recuperación celular, y ajustar el volumen para dar una concentración final de 10 7 / ml. Con la aspiración cuidadosa, recuperación celular debe ser ≥ 85%. Si la recuperación celular es &lt;70%, determine la causa antes de continuar. Extraer una alícuota de 150 l (1.5x10 6 células) y colocar en hielo para su uso en el Paso 2. </li></ol> 2. Preparación de los controles de configuración del instrumento y ensayo (Tabla 1) <ol><li> Alícuota de 50 l (5x10 5) de células no teñidas de la suspensión celular guardado en el paso 1,1 en cada uno de cinco tubos Eppendorf de 1,8 ml: 1, 3, 4, 5, y 7. Alícuota de 50 l (5x10 5) de células PKH26 OP de Paso 1,9 en cada uno de tres tubos: 2, 6 y 8. </li><li> Añadir 10 l bloque de IgG (100 ug / tubo de IgG; ver tabla de Reactivos) a los Tubos 1-8e incubar durante 10 min a temperatura ambiente (20-25 ° C). </li><li> Añadir una cantidad de saturación de la anticuerpo (s) indicado en la Tabla 1 para los tubos 4, 5, 7, y 8 e incubar todas las muestras (tubos 1-8) para 30 min a temperatura ambiente y protegido de la luz. </li><li> Añadir 1,5 ml de HBSS BSA 1% a todas las muestras, sedimentar las células por centrifugación (5 min @ 400 xg) y se lava una vez con 1,5 ml de HBSS 1% de BSA, con aspiración cuidadosa para evitar la pérdida de células. </li><li> Resuspender cada muestra en 500 l de HBSS BSA 1%. Si se requiere de muestras a ser analizadas en el citómetro, transferir a un tubo de 12 x 75 mm de fondo redondo. Añadir 10 l de 100 ug / ml 7-AAD diario de las acciones de trabajo (véase la tabla de Reactivos) a los tubos 3, 6, 7 y 8, como se indica en la Tabla 1. Incubar en hielo durante 30 min antes de su uso en la configuración del citómetro de flujo y tinción de verificación (Paso 3). </li></ol> 3. Flujo de configuración del citómetro y Verificación de tinción <ol><li> Verifique que el flujo CytOMeter está funcionando correctamente, utilizando los procedimientos establecidos del laboratorio para el control de calidad diario. Verificar que las señales pueden ser fácilmente detectados en cada ventana de espectro para ser utilizado, y que las respuestas del detector son linealmente proporcionales a la intensidad de la señal en la ventana que se utilizará para la supervisión proliferación 14. </li><li> Adquirir FSC frente a SSC de datos para el tubo 1, utilizando escalas lineales de pantalla. Ajustar la amplificación de cada detector de tal manera que la población de linfocitos cae en el cuadrante inferior izquierdo de la gráfica de puntos, no está fuera de escala en cualquiera de los parámetros, y no se interrumpe debido a la umbralización. Recopilar datos sin sincronización FSC frente a SSC para todas las muestras en Plaza de 3,3 a 3,7. </li><li> Adquirir datos para el tubo 1, sin usar la compensación de color y escalas logarítmicas de visualización de los 4 detectores de fluorescencia. Ajuste de alta tensión de cada detector (HV) para colocar la autofluorescencia de los linfocitos no marcados en la escala con pocos / sin células se acumula en el primer canal. Establecer un límite de análisis para cada histogramacorrespondiente a la más brillante 2% de las células no teñidas. </li><li> El uso sin compensación de color y los ajustes de alto voltaje establecido en los pasos 3.2 y 3.3, la adquisición de datos para el tubo 2, recogiendo FSC, SSC y señales en los 4 detectores de fluorescencia. Para el detector usado para monitorear PKH26 fluorescencia, verificar que todas las células PKH26 pos aparecer en escala como un solo pico simétrico en la década 3 ª -4 ª, con pocas células / no en el último canal. Si hay varios picos o forma de los picos se sesga, repita el paso 1, con especial atención a la sal minimización y técnica de mezcla (Figura 2). Si es necesario, ajustar la concentración de colorante. </li><li> Uso de los parámetros establecidos en el paso 3.3, la adquisición de datos para el tubo 3, recogiendo FSC, SSC y señales en los 4 detectores de fluorescencia. Para el detector usado para monitorear 7-AAD fluorescencia, verificar que la 7-AAD células pos caer encima del límite de 2% establecida en el paso 3,3 (es decir, que las células no viables están bien resueltosviables a partir de 7-AAD células neg). </li><li> Uso de los parámetros establecidos en el paso 3.3, la adquisición de datos para el tubo 4, recogiendo FSC, SSC y señales en los 4 detectores de fluorescencia. Verifique que las células CD8 pos están bien resueltos a partir de células teñidas (es decir, la caída por encima del límite del 2% establecido en el paso 3.3 para el detector FITC). Repita con el tubo 5 y verificar que las células CD8 pos están bien resueltos a partir de células teñidas (es decir, la caída por encima del límite del 2% establecido en el paso 3.3 para el detector de APC). </li><li> Uso de la configuración establecida en el paso 3.3, adquirir datos para tubos 6, 7 y 8, recogiendo FSC, SSC y señales en los 4 detectores de fluorescencia. </li><li> Use los archivos en modo de lista recogidos para tubos 1-5 y el software de compensación de color para establecer un color se superponen matriz para cada fluorocromo en los detectores que se utilizan para controlar los tres fluorocromos otros. Aplicar esta matriz para el modo de lista de archivos para la muestra 6 y verificar que la presencia de PKH26 laboratorioeling no altera la capacidad de detectar 7-AAD células pos. </li><li> Aplica el color se superponen matriz de paso de 3,8 a modo de lista del archivo de muestra 7 y verifique que: a) 3 subpoblaciones bien resueltas (CD3 CD4 neg neg, CD3 CD4 neg pos CD3 y CD4 pos pos) se pueden identificar en un FITC frente a APC diagrama de puntos, y b) la presencia de anti-CD3-FITC y anti-CD4-APC no altera la capacidad de detectar 7-AAD células pos. Si la presencia de anti-CD3-FITC altera el límite superior 2% para los datos recogidos en el detector de PKH26, reajustar el límite según se requiera. </li><li> Aplicar la matriz de color se superponen desde el paso 3.8 para el modo de lista de archivos para la muestra 8. Si la presencia de PKH26 etiquetado altera el límite del 2% para el FITC, 7-AAD o detectores de APC de los establecidos mediante el control autofluorescencia en el paso 3.3, vuelva a ajustar el límite (s) según sea necesario utilizando Tube 7 de la Tabla 1 y verificar que Todavía es posible distinguish CD3 CD4 pos pos, pos CD3 CD4 neg, CD3 y CD4 neg neg células usando el límite ajustado (es). </li></ol> 4. Proliferación Selección del modelo para la Vigilancia división celular por dilución de colorante <ol><li> Determinar el espaciado entre generaciones, que es dependiente del número de canales y décadas logarítmica en el citómetro. Para los instrumentos digitales, este valor, típicamente 4 o 5 décadas, se determina por el número de contenedores en el procesador de señal digital. En los instrumentos analógicos, donde el número de décadas no suele ser un número entero, modelado preciso es el número exacto de décadas en ser determinado experimentalmente. Para hacer esto, los datos de una mezcla de perlas fluorescentes calibrados con el fabricante asignadas intensidades relativas se adquiere a la configuración del detector mismas de alta tensión utilizados en el experimento. La posición de los picos de talón permite la calibración de la escala logarítmica en términos de intensity rango por década registro. Específicamente, esto se hace mediante el trazado del número de canal para cada tipo de perla contra el tronco del fabricante asigna valor. La pendiente de una línea recta de mejor ajuste para los valores de datos de cuentas indica el número de unidades de intensidad relativa por canal. Multiplicado por el número de canales, entonces este valor será el número de décadas de registro para la escala completa, de la cual puede ser el número de canales que corresponden a una disminución de dos veces en la intensidad (es decir, el espaciamiento hija generación) calculado 14. </li><li> Decida si va a utilizar un espacio fijo entre generaciones o para permitir la separación de flotar. Un estándar (fijo) le permite utilizar el valor de separación generacional determinado en el paso 4.5 para asignar la ubicación de cada generación, y se suele utilizar cuando el histograma carece de picos distintos. Un valor flotante permite que cada posición de pico generacional a ser determinada por la forma de histograma y se usa típicamente cuando distinguishablpicos e intergeneracionales son evidentes. </li><li> Decida si va a utilizar un ancho pico fijo para todas las generaciones, o un ancho variable. Un ancho fijo utiliza el SD calculado para la muestra de control no estimulado para modelar todas las generaciones y se elige típicamente cuando la muestra carece de picos distinguibles generacionales. Una anchura variable permite que el programa para variar independientemente la SD para cada generación y se utiliza mejor con picos distinguibles generacionales. </li><li> Ejecute un programa que contiene un módulo de análisis de la proliferación (aquí ModFit LT Versión 3.3). Cargar el archivo estimulado PKH26 pos del conjunto de datos a analizar (por ejemplo, un cultivo estimulado 96 hr de células PKH26 pos contratiñeron como para el tubo 8 en la Tabla 1). </li><li> Seleccione los parámetros para el análisis, en este caso PKH26 (585/42) sobre cerrado viable (7-AAD neg) linfocitos CD3 POS y FSC frente a SSC para excluir los desechos pequeños y grandes agregados (Figura 3). En la definición deestas regiones tener cuidado de incluir la zona alta dispersión frontal donde se encuentran típicamente explosiones y CD3 en cuenta que la expresión puede ser modulada abajo en cultivos estimulados. </li><li> Crear un modelo de proliferación nuevo con el Asistente para la Proliferación. Uso del archivo de datos abiertos (ficha Inicio), cargue el archivo de control no estimulado PKH26 pos y definir la ubicación del canal de pico en la distribución parental correspondiente a las células indivisas. </li><li> Analizar el archivo de la no estimulada PKH26 pos de control, teniendo en cuenta los valores de la posición del pico parental y anchura (desviación estándar). Si una anchura de pico fijo (SD) se desea, comprobación de enganche SD. </li><li> Cargar el PKH26 neg control (por ejemplo, un cultivo de 96 h las células PKH26 neg contratiñeron como para el tubo 7 en la Tabla 1). Ajuste el número de generaciones por ajustar el canal de pico para la generación más oscuro encima del control PKH26 neg. Esto determina la numbre de las generaciones hijas el modelo puede encajar con precisión y es típicamente 6-9 generaciones. </li><li> Abrir el archivo de datos para la muestra estimulada (por ejemplo, un cultivo estimulado 96 hr de células PKH26 pos contratiñeron como para el tubo 8 en la Tabla 1) y confirmar que las regiones de la posición del pico parental y la SD tal como se define en el Paso 4,7 permanecen sin cambios. Si la distancia generacional fijo se desea, seleccione la opción Modelo estándar, de lo contrario seleccione la opción Flotante. </li><li> Analizar cada archivo experimental en el conjunto de datos, utilizando el mismo modelo definido en el Paso 4.9. Ajustes menores en la posición del pico parental puede ser necesario para el mejor ajuste tal como se define visualmente y por la reducción de chi cuadrado (RCS) de valor. </li><li> Registre los indicadores de proliferación deseados que resultan de la de mejor ajuste para cada archivo experimental en el conjunto de datos. Para una descripción completa de los posibles métricas ver Ref. 22. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

K. Humphrey, JD Tario Jr., y Wallace PK han recibido pre-comerciales reactivos celulares de seguimiento para la evaluación de Life Technologies, Inc. y BD Biosciences. AD Bantly y JS Moore han recibido pre-comercial célula de seguimiento de los reactivos para la evaluación de Life Technologies, Inc. y la financiación de PTI Research, Inc. para la pre-comercial caracterización de células CellVue diversos seguimiento de los tintes. K. Muirhead es empleado por SciGro, Inc., que ofrece servicios de consultoría a las Tecnologías de Phanos, Inc. (propietaria de la PKH y tintes CellVue) y proporciona soporte de copia de seguridad técnica para Sigma-Aldrich y tecnologías de orientación molecular, Inc. (distribuidores de estos colorantes). La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Sigma-Aldrich.

Los métodos descritos aquí son las que se encuentran en nuestros laboratorios combinados para dar más fiabilidad óptimos resultados para el etiquetado hPBMC el uso de tintes membrana 13,16,18 y fenotipificación subconjunto de linfocitos y la proliferación de seguimiento utilizando tintes membrana o proteínas 2,11,13,16, 18. Como se ilustra en las Figuras 1 y 2, el etiquetado uniforme brillante es más fácilmente consigue limitando la presencia de sales fisiológicas y utilizando una técnica de mezcla que resulta en la exposición rápida y homogénea de todas las células a la misma concentración de colorante. Debido a que la tinción con colorantes de membrana se produce por el reparto en la bicapa lipídica, otras variables que alteran la concentración de colorante libre también puede afectar la eficiencia de etiquetado. Por ejemplo, el etiquetado en tubos de poliestireno de fondo redondo de resultados en menos eficiente lavado de las sales antes de la resuspensión en Diluyente C y también en menor concentración libre de tintes debido a la adsorción de colorante en las paredes del tubo, en particulara bajas concentraciones de colorante. Ambos factores tienden a dar más amplias distribuciones de tinción que cuando etiquetado se realiza utilizando tubos cónicos de polipropileno de fondo (Figuras 3, 4 y resultados sin publicar). Edad y tipo de muestra también pueden afectar la anchura del pico incluso cuando los procedimientos de tinción se utilizan optimizado. Por ejemplo, CV para PKH26 pos linfocitos aislados de sangre recién extraída rango de 14 a 20% (Figura 3, Ref. 13 y resultados no publicados), mientras que CV de los linfocitos aislados de 24 muestras de sangre hr viejos o rango TRIMA féresis filtros 25 a 30 % (Figura 4 y Ref. 18). La tinción uniformidad y la medida en que las células no viables pueden ser excluidos de análisis tanto afectar si los picos distinguibles hija son evidentes en el perfil de dilución de colorante, que a su vez influye en la elección de un modelo de proliferación para ajustar los datos observados (Figuras 5 y 6 </strong&gt;). Aunque ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) se usa aquí como un ejemplo de software usado para generar métricas como el índice de proliferación y frecuencia del precursor (Figuras 3, 5 y 6, Tabla 3), otros paquetes de software también contienen módulos para analizar datos de proliferación. Estos incluyen FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) y FlowJo (Árbol Star, Inc., Ashland, Oregón). Todos estos programas utilizan una no lineal de análisis de mínimos cuadrados para encontrar iterativamente el mejor ajuste a los datos en bruto, cambiando la posición, la altura y la SD (o anchura) de los picos Gaussianos que representan generaciones sucesivas hija. Índice de proliferación (IP) y la frecuencia de los precursores (PF) son las medidas más utilizadas de medida de la proliferación. PI, tal como se define por ModFit, es una medida del aumento de número de células durante el curso del ensayo, análogo a la &quot;índice de estimulación &#39;de un ensayo de absorción de timidina. PF devuelve la fracción de células en la populat inicialion que responden al estímulo de la proliferación. Se recomienda precaución, sin embargo, al leer la literatura desde la terminología varía un poco entre paquetes de software (por ejemplo, FlowJo y ModFit utilizan diferentes definiciones y cálculos de lo que se entiende por &quot;proliferación Index&quot;) 22. Los temas críticos discutidos aquí para el etiquetado y el análisis de proliferación con tintes de membrana también se encuentran cuando se utilizan colorantes proteicos. Por ejemplo, una cuidadosa atención a la técnica de mezcla también deben ser observadas, junto con la exclusión de células muertas / morir, con el fin de obtener distribuciones uniformes y picos distinguibles hija cuando se utiliza CFSE (Figura 6) 2-4,13,18,24. La elección apropiada de fluorocromos para fenotipado y evaluación de viabilidad es también importante para evitar excesivas solapamiento espectral y la incapacidad de reconocer las células positivas de anticuerpos, particularmente con tintes visibles emisores de proteína tales como CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. La reducción de la concentración de colorante de seguimiento disminuye los problemas de compensación en canales espectrales adyacentes pero también limita el número de divisiones celulares que pueden ser monitoreados antes de intensidades hija celulares comienzan a solaparse con la autofluorescencia. Alternativamente, el uso de tintes de células nuevas de rastreo tales como el emisor de Claret CellVue rojo lejano (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) o violeta emisor de CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) puede reducir los problemas de compensación (Figura 6). Finalmente, aunque los colorantes de membrana en general tienden a exhibir una menor toxicidad 11,26, es posible sobre células de etiqueta ni con la clase de colorante. Por tanto, es siempre necesario verificar que la concentración de colorante de seguimiento utilizado no ha alterado la funcionalidad de las células para ser rastreados (Figura 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo o equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Comercialmente adquirida </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (FBS) </td><td> Atlanta Biológicos </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> El calcio y el magnesio libre, sin rojo de fenol </td></tr><tr><td> IgG humana fracción Cohn II y III globulinas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-CD3 humano-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Anti-ratón humanos CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-CD4 humano PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-CD19 humano-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; Saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-CD3 humano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azida libre </td></tr><tr><td> Ratón anti-CD28 humano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azida libre </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 rojo fluorescente de células kit de unión que contiene 10-3M PKH26 en EtOH y C Diluyente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT o MINI26-1KT </td><td> Procedimientos en el paso 1 se aplican tambiéna los kits que contienen PKH67 u otros colorantes CellVue </td></tr><tr><td> Claret CellVue mucho rojo fluorescente celular kit de unión que contiene 10-3M Claret CellVue en EtOH y C Diluyente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT o MIDCLARET 1KT- </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (y-6)-diacetato de carboxifluoresceína, succinimidil éster (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> No fluorescente; escindidos por esterasas de membrana para formar amino-reactivo fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Violet corregible </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Estéril 12 x 75 mm cónico tubos de polipropileno y gorras </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Da tinte mejor eficiencia de tinción de membrana (reducido adsorción de colorante, menos pérdida de células durante la aspiración sobrenadante) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round fondo tubos de poliestireno </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Citómetro de flujo </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Cualquier citómetro capaz de detectar FITC, PKH26, y 7 AAD-(ex. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm, y 655 nm, respectivamente) y ex APC. 633-640 nm, em. 660 nm) </td></tr><tr><td> Citómetro de flujo </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII cian </td><td> Cualquier citómetro capaz de detectar FITC, PKH26, y 7 AAD-(ex. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm, y 655 nm, respectivamente) y ex APC. 633-640 nm, em. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratorio Preparado </td></tr><tr><td> 7 Aminoactinomycin D, caldo concentrado </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml en PBS. Congelar y almacenar en alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7 Aminoactinomycin D, worrey de stock </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 g / ml en PBS; preparar diariamente de 1 mg / ml stock congelado. </td></tr><tr><td> IgG bloque </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml de IgG humana fracción Cohn II y III globulinas + 10 mg / ml de BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Tintes fluorescentes seguimiento celulares, en combinación con el flujo y la citometría de imagen, son herramientas poderosas para estudiar las interacciones y destinos de los diferentes tipos de células in vitro e in vivo. 1-5 Aunque existen literalmente miles de publicaciones que utilizan estos colorantes, algunos de los las aplicaciones móviles más comunes de seguimiento incluyen la supervisión de: <ol><li> tallo y la quiescencia de células progenitoras, la proliferación y / o diferenciación 6-8 </li><li> antígeno impulsado por la membrana de transferencia 9 y / o la proliferación de células precursoras y 3,4,10-18 </li><li> inmune de células reguladoras y efectoras función 1,18-21. </li></ol> Tintes de células disponibles comercialmente de seguimiento varían ampliamente en sus composiciones químicas y propiedades de fluorescencia pero la gran mayoría de caída en una de dos clases basadas en su mecanismo de marcaje de las células. &quot;Tintes de membrana&quot;, tipificado por PKH26, son tintes altamente lipofílicas tsombrero de forma estable, pero de manera no covalente en las membranas celulares 1,2,11 partición. &quot;Tintes proteína&quot;, tipificado por CFSE, amino son los colorantes reactivos que forman enlaces covalentes estables con proteínas celulares 4,16,18. Cada clase tiene sus propias ventajas y limitaciones. La clave de su uso exitoso, especialmente en los estudios multicolor donde múltiples colorantes se utilizan para rastrear diferentes tipos de células, por lo tanto para entender los temas críticos que permitan el uso óptimo de cada clase 2-4,16,18,24. Los protocolos incluyen aquí destacar tres causas comunes de malos resultados o variable cuando se utiliza el seguimiento de células tintes. Estos son: <ol><li> Si no se consigue brillante, etiquetado uniforme y reproducible. Este es un punto de partida necesario para cualquier estudio de seguimiento de celda, pero requiere atención a las diferentes variables cuando se utilizan colorantes de membrana que cuando se utilizan colorantes de proteínas o reactivos de unión en equilibrio, tales como los anticuerpos. </li><li> Subóptimas combinaciones de fluorocromos unnd / o la no inclusión de controles críticos de compensación. El seguimiento de fluorescencia del colorante es típicamente 2 10-03 10 veces más brillante que la fluorescencia de anticuerpos. Por tanto, es esencial verificar que la presencia de un colorante de seguimiento no comprometer la capacidad de detectar otras sondas que se utilizan. </li><li> Si no se obtiene un buen ajuste con el software de modelado pico. Este tipo de software permite la comparación cuantitativa de los efectos proliferativos entre las diferentes poblaciones o estímulos basados ​​en la frecuencia o precursor otras métricas. La obtención de un buen ajuste, sin embargo, requiere la exclusión de muerto / muerte de las células que pueden distorsionar los perfiles de dilución de tinturas y congruencia de los supuestos que subyacen en el modelo con las características del perfil de tinte dilución observada. </li></ol> Ejemplos dados aquí ilustrar cómo estas variables pueden afectar a los resultados cuando se utiliza la membrana y / o tintes de proteínas para controlar la proliferación celular.

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Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

El uso exitoso de los tintes de seguimiento para controlar la función celular inmune celular y la proliferación implica varios pasos críticos. Se describen métodos para: 1) la obtención brillante, uniforme, reproducible etiqueta-ción con colorantes de membrana, 2) selección de fluorocromos y condiciones de adquisición de datos, y 3) la elección de un modelo para cuantificar la proliferación celular basada en la dilución de colorante.

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

35.3K vistas.  Roswell Park Cancer Institute. El uso exitoso de los tintes de seguimiento para controlar la función celular inmune celular y la proliferación implica varios pasos críticos. Se describen métodos para: 1) la obtención brillante, uniforme, reproducible etiqueta-ción con colorantes de membrana, 2) selección de fluorocromos y condiciones de adquisición de datos, y 3) la elección de un modelo para cuantificar la proliferación celular basada en la dilución de colorante.

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Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Investigación

Biología

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Celular seguimiento mediante fotoconvertible proteínas durante el desarrollo de pez cebra

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

La tinción histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celda Secundaria Elements Pared

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Comparación de tres diferentes métodos para determinar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

Ensayo de absorción de colesterol LDL utilizando celular directo imágenes análisis con células control de salud

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Medición de la proliferación de células musculares lisas vasculares mediante la química de clics

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...