Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo del inmunoeficiencia. La ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación de mitocondrias o lisosomas en células vivas individuales, en una mezcla compleja de diferentes tipos de células. Este método para estudiar las células T y B también se puede aplicar a muchos otros tipos de células como macrófagos, células dendríticas o cualquier célula primaria cosechada de una muestra de tejido.
El procedimiento lo demostrará Chin-Wen Wei, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para etiquetar los orgánulos para la cuantificación, primero, agregue una vez diez a las sextas células T del ratón a un tubo de fax inferior redondo por marcador. Y peletiza las células por centrifugación.
precaleable a 37 grados Celsius medio de cultivo libre de suero para diluir las soluciones de material de la sonda específica del orgánulo a las concentraciones de trabajo finales en el medio. Y re-suspender las células en 100 microlitros de tinte de sonda por tubo. A continuación, incubar las células en una incubadora de cultivo celular durante el período de tinción adecuado, deteniendo la reacción al final de la incubación con un mililitro de tampón de fax frío por tubo.
Luego, recoger las células con otra centrifugación y re-suspender los pellets en 100 microlitros del sobrenadante de hibrido 24G2 pretitulado en hielo. Después de diez minutos, agregue un mililitro de búfer de fax por tubo. Recoger las células por centrifugación y etiquetar las células con 50 microlitros del cóctel de anticuerpos conjugados de fluorescencia pretitulado de interés.
Añadir la concentración adecuada según la tabla. Y búfer de fax durante 20 minutos sobre hielo, protegido de la luz. Al final de la incubación, agregue un mililitro de tampón de fax por tubo.
Recoger las células por centrifugación. Y re-suspenda las células en 300 microlitros de tampón de fax complementados con un microgramo por mililitro de yoduro propidium. Inmediatamente después de agregar la contramancha nuclear y cromosómica, encienda el ordenador de análisis de citómetros de flujo, el citómetro de flujo, el software de adquisición de fax y cualquier otro dispositivo accesorio dependiendo de la plataforma de la máquina.
Ejecute PBS a través del sistema durante aproximadamente un minuto para asegurarse de que la línea de flujo está llena con PBS y el búfer de vaina. Abra un nuevo experimento y configure los parámetros del citometro de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Filtrar las células a través de un colador celular de 70 micrómetros.
Y vórtice antes de la adquisición de cada muestra para evitar grumos y doblete de formación. Abra el ajuste Compensación automática y cree trazados de puntos para cada parámetro fluorescente. Una vez establecidas todas las tensiones, ajuste la compensación y aplique la compensación a las muestras.
Cree una gráfica de dispersión hacia delante frente frente a la dispersión lateral y optimice las tensiones para que las celdas de interés aparezcan dentro de la gráfica. Cree un trazado de dispersión hacia delante frente frente y puerta las celdas individuales. Cree un área de dispersión hacia adelante frente frente a la gráfica de área de dispersión lateral y auerte los linfocitos.
Cree un área de dispersión hacia adelante frente frente a la gráfica de yoduro propidium y acote las celdas vivas. Una vez establecidas todas las tensiones, ajuste la compensación y aplique la compensación a las muestras. A continuación, cargue el primer tubo de muestra, cree las gráficas de marcadores de superficie celular adecuadas y recopile al menos 1.000 eventos de la población de interés.
Una vez ejecutadas todas las muestras, exporte los datos de flujo para su posterior análisis. Y guarde el experimento como una plantilla para preservar la configuración del citometro y los parámetros para experimentos similares en el futuro. El contenido mitocondrial del sitio final es el más bajo en células T dobles negativas, pico en la etapa doble negativa dos y tres, y ligeramente disminución en la etapa doble negativa cuatro.
Con timocitos positivos dobles que demuestran un mayor número de mitocondrias que los timocitos positivos individuales CD4 y CD8, lo que sugiere que el contenido mitocondrial fluctúa durante el desarrollo. Los timocitos positivos individuales CD4 y CD8 presentan una intensidad de fluorescencia media mitocondrial más alta que las células T esplénicas CD4 o CD8, lo que sugiere que las células T ingenuas que recirculan en el ambiente sanguíneo rico en oxígeno tienen una masa mitocondrial aún menor que los timocitos. Curiosamente, esta reducción del contenido mitocondrial es más prominente en el CD8 que el linaje celular CD4 T, y la activación de la célula T disminuye aún más la presencia de estos orgánulos.
Se observan contenidos lisosomales relativamente bajos, pero detectables, en todas las poblaciones de timocitos, con una presencia más prominente en un timocito doble negativo. En la periferia, se detecta un número relativamente alto de lisosomas en la memoria y en las células T positivas CD8 del efector. La combinación de tintes específicos de organelle y marcador de superficie con citometría de flujo es una forma poderosa de caracterizar el estado metabólico de las células en una mezcla compleja.
Se puede utilizar un tinte específico de orgánulo adicional para detectar retículo endoplasmático, vacuola autofágica u otro compartimento intracelular de interés.
