Los autores desean agradecer a los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y la Sociedad Canadiense del Cáncer para financiar la investigación del ciclo celular en el laboratorio. MJC es un beneficiario de una beca de MD / PhD de la CIHR. MJC y MA son miembros del programa de formación CaRTT.

1. El etiquetado y la fijación de las células <ol><li> Añadir 1 l de reactivo de marcaje proliferación celular (BrdU) por ml de medio de cultivo celular (1 a 1000 de dilución) 1 hora antes de la cosecha. El período de etiquetado puede ser necesario alargar más lento crecimiento de las células. </li><li> A las células de la cosecha, medio de cultivo, aspire y lave a fondo con solución salina de fosfato (PBS). Repita la operación para eliminar completamente los rastros de mediano plazo. </li><li> Lávese las culturas rápidamente por tercera vez con PBS que contenía 3 mM EDTA y aspire a fondo. </li><li> Añadir un pequeño volumen de PBS que contenía 3 mM EDTA para cada plato, de 0,5 ml para una placa de 6 cm es ideal. Se incuba a 22 ° C durante aproximadamente 5 minutos para separar las células. Transferir a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Las células se centrifugan a 500 xg durante 5 minutos para que sedimenten, eliminar el sobrenadante y se resuspenden a fondo en 100 l de PBS. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 5 ml de EtOH al 95%, gota a gota, mientras agitación. En esta etapa, las células pueden ser almacenadas a 4 º C durante al menos unmes. </li></ol> 2. La desnaturalización y la tinción de BrdU y el ADN <ol><li> Centrifugar las células a 500 xg durante 5 minutos para precipitar las células y eliminar EtOH al 95%. Resuspender en 1 ml de HCl 2N y el 0,5% Tx-100 mediante la adición de una forma gota a gota mientras agitación. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Centrifugar como antes en la sección 2.1 y cuidadosamente aspirado sobrenadante ya que las células forman un sedimento muy suelto en este paso. Resuspenda suavemente en 1 ml de 0,1 M NaB 4 O 7 (pH 8,5) y se incuba durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Precipitar las células como anteriormente en la sección 2.1 y resuspender en 0,5 ml de solución de anticuerpos (PBS con BSA al 1% y el 0,2% de Tween-20) con el ratón anti-BrdU anticuerpos diluido 1 a 50. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Precipitar las células de nuevo y volver a suspender en 50 ml de solución de anticuerpos de conejo que contiene anticuerpos anti-ratón secundario conjugado con FITC diluido 1 a 25. Incubar durante 30 minutosmesa de trabajo y protegerlo de la luz. </li><li> Centrifugar las células por última vez y volver a suspender en 0,5 ml de yoduro de propidio y RNasa solución (PI-RNasa solución PBS con BSA al 1%, 10 mg / ml de yoduro de propidio, 0,25 mg / mL de RNasa A) y se incuban en la oscuridad a 37 ° C durante 30 minutos. Por otra parte el ARN puede ser digerido la noche a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Pase solución a través de un colador para eliminar los agregados de células y recoger las células individuales en un tubo apropiado para la captación de muestras en el citómetro de flujo. Una vez más, las muestras deben ser protegidos de la exposición directa a la luz. </li></ol> 3. El análisis por citometría de flujo <ol><li> Las células deben ser analizados por un citómetro de flujo estándar que es capaz de discriminar a los dobletes (dos células que pasan a través de la celda de flujo como una sola) con capacidad de detección adecuados para yoduro de propidio y FITC. Las células individuales se pueden detectar en esta solicitud de citometría de flujo por puerta de enlace para los eventos basados ​​en dispersión frontal y lateral emergente de dispersiónpoblaciones, y mediante el uso de las propiedades de tinción de ADN yoduro de propidio. La apariencia de un gráfico de puntos discriminar doblete varía entre citómetros de flujo y se basa en las propiedades de yoduro de propidio tinción, consulte a su centro local de citometría de flujo para el asesoramiento en la creación de un discriminador de doblete en su análisis. En general, en una población de forma asíncrona la proliferación de las células, las células individuales son por lo general los dos picos más abundante (2N y 4N ADN) en la parcela discriminar doblete y una puerta debe ser dibujado a su alrededor. Se seleccionará un solo eventos celulares que se utilizan para todos los análisis posteriores a continuación. </li><li> La primera muestra a analizar debe ser una cultura de forma asíncrona proliferación que sirve como un control positivo para la tinción y citometría de flujo de configuración. Ajustar la sensibilidad de los tubos fotomultiplicadores para la tinción de yoduro de propidio de tal manera que los picos de 2N y 4N a partir de células singlete se centran en 200 y 400 (unidades arbitrarias) en el eje X. A menudo una mancha s abundanteSUMINISTRO de estas células para asegurarse de que todos los parámetros de la citometría de flujo se han ajustado adecuadamente sin necesidad de utilizar esta muestra. Este control positivo es también útil para los nuevos usuarios se familiaricen con el funcionamiento del citómetro de flujo. </li><li> Ajustar la sensibilidad del tubo fotomultiplicador para la detección de FITC de tal manera que las poblaciones de G1 y G2 / M están por encima del fondo. Células BrdU positivas debe ser aproximadamente 10 veces más brillante y el eje Y debe mostrarse como una escala logarítmica. A veces es útil incluir un control negativo para la tinción de BrdU (mediante la sustitución de los anticuerpos anti-BrdU con no específica de IgG en el paso 2.3) para distinguir claramente las células marcadas positivamente. </li><li> Ajuste la compensación entre yoduro de propidio y FITC de tal manera que solo los eventos capturados por la forma citómetro de flujo de un arco en forma de herradura de G1 en la parte inferior izquierda hasta la fase S y hacia abajo en la parte inferior derecha de G2 / M. Por favor, consulte la siguiente referencia para un análisis más profundo disdiscusión de los principios y el uso de citometría de flujo y las referencias allí para aplicaciones específicas 2. </li></ol> 4. Análisis de datos <ol><li> 5 000 a 10 000 eventos de células individuales con el rango deseado de contenido de ADN se deben recoger para cada muestra con el fin de tener confianza en que la población de células en el cultivo han sido totalmente incluidos en la muestra. </li><li> Una vez que las células se han medido de yoduro de propidio y BrdU contenido que necesitan para ser asignados a las fases G1, S o G2 / M. Para ello, la elaboración puertas alrededor de las dos poblaciones BrdU negativa centrada en 200 y 400 (G1 y G2 / M, respectivamente). Todo por encima de estas cajas deben ser incluidos en una sola puerta que las medidas de la fase S (Fig. 1A). El porcentaje de células en cada puerta representa el número relativo de células en G1, S y G2 / M (Fig. 1B). </li></ol> 5. Protocolo alternativo para el análisis del ciclo celular en una población mixta de células <ol><li> Este protocolo alternativomás útil cuando la transfección de vectores de expresión habitualmente resulta en un bajo porcentaje de células que expresan el producto del gen de interés, o cuando el tratamiento farmacológico para seleccionar una población pura de células no es práctico. Esto se traduce en una proporción relativamente pequeña de células de interés están contaminados con una gran población de células untransduced. En este caso, co-transfectar plásmidos que expresan el gen o del shRNA de interés junto con un plásmido que expresa un marcador para la detección de células transfectadas mediante citometría de flujo, tales como una membrana anclada GFP 3, o un marcador de superficie celular CD19 extranjeros como 4 o CD20 5. </li><li> A los efectos de este protocolo vamos a utilizar CD20 tinción como un ejemplo, sin embargo, la tinción de CD19 es esencialmente idéntico. En el caso de la transfección con CD20, no hay necesidad de etiquetar BrdU, sólo las células de la cosecha tal como se describe en los pasos 1,2 a 1,5 por encima de la mancha y por la adición de 20 l FITC conjugado con anticuerpos anti-CD20 a las células en el ice durante 20 minutos en la oscuridad. Fijar las células como se describe en 1.6 paso. Las células una vez más se pueden almacenar por lo menos durante un mes a 4 ° C en la oscuridad. Para la detección de buenas prácticas agrarias, omita la tinción de anticuerpos a partir de este paso y fijar y almacenar las células como se describe. </li><li> Re-hidratar las células de granulación en la centrífuga a 500 xg durante 5 minutos y resuspender en 5 ml de PBS con 1% BSA. </li><li> Vuelva a que sedimenten las células a 500 xg durante 5 minutos y suspender las células en 0,5 ml de yoduro de propidio y la solución de RNasa como se describió anteriormente en la sección 2.5. </li><li> Continúe siguiendo las instrucciones de preparación de células en el 2,6 y el análisis de las instrucciones en 3.1 y 3.2. </li><li> Ajustar la sensibilidad del tubo fotomultiplicador para la detección de FITC de tal manera que las células teñidas están por encima del fondo. Idealmente, CD20-FITC células positivas se 10X a 100X más intensamente teñido de fondo y el eje de esta trama debe mostrarse como una escala logarítmica (Fig. 2A). Células CD20 positivas que son más brillantes que backg 10 vecesronda (y con la tinción de yoduro de propidio entre 200 y 400) deben ser seleccionados para la exhibición en un yoduro de propidio frente a los recuentos de células histograma como se muestra en la fig. 2C. Para las líneas celulares que expresan marcadores que sean fácilmente teñidas brillantes (es decir, 10 veces más de 100 veces por encima del fondo), el CD20 positivo de corte se debe establecer en el fondo 10 veces. La inclusión de tinción de las células más débil aumenta la variabilidad en estos experimentos, presumiblemente debido a que el gen de interés es también débilmente expresado en estas células. Para las líneas celulares que sólo el rendimiento débilmente teñidas CD20 positivos (es decir, menos de 10 veces de fondo), la determinación de un punto de corte debe realizarse con un control negativo que consiste en células CD20 manchado, no transfectadas. </li><li> Por lo menos 1000 CD20 acontecimientos positivos se deben recoger para cada muestra. Los experimentos con menos que 1000 eventos se producen una alta variabilidad. Los paquetes de software tales como ModFit LT (Verity Software), Multi Ciclo de AV (Phoenix Flow Systems), y flujo de Jo (Árbol estrella) utilizar estimaciones matemáticas delas poblaciones G1, S y G2 / M que contribuyen a la forma de la curva en los histogramas, como los que se muestran en la figura. 2B y C. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Ofrecemos tres ejemplos de análisis experimental del ciclo celular utilizando nuestros enfoques. El primero utiliza la expresión retroviral de la dependiente de ciclina p27Kip1 inhibidor de la cinasa en fibroblastos de embriones de ratón. Veinticuatro horas después de la selección de medicamentos para la infección viral se completa, las células fueron pulso marcado con BrdU durante una hora. En este experimento, la expresión ectópica del inhibidor se utiliza para detener la proliferación de las células (Fig. 3 A y B). Como se muestra en la fig. 3B poco eventos BrdU positivos son evidentes en la puerta de la fase S en respuesta a p27. Asimismo, el porcentaje de células en fase S de células que expresan p27 es muy bajo como el diagrama de la figura. 3C. Este tipo de análisis ha sido muy eficaz en la caracterización de los defectos de control del ciclo celular en células derivadas de varias cepas de gene-dirigido ratones 6, 7, 8. En el segundo experimento, sin transformar las células epiteliales mamarias (MCF10A) fueron tratados con la citoquina inhibidora del crecimiento, factor de crecimiento transformante beta uno (TGF-β1) durante 24 horas. Las células fueron marcadas con BrdU durante cuatro horas, inmediatamente antes de la cosecha. Como se muestra en la fig. 4 BrdU etiquetado en células en fase S disminuye en gran medida por el TGF-β1 señalización, la especificidad de nuestra coloración también se valida con un control de IgG negativo (Fig. 4C). La cuantificación de las diferentes fases del ciclo celular confirma que el TGF-β1 inhibe la proliferación de todo en la fase G1 del ciclo celular, dando lugar a una acumulación en esta fase. En nuestro último ejemplo, el PRB deficiente SAOS-2 células son transfectadas con un vector CMV-CD20 y la expresión ya sea CMV-RB o CMV-β-Gal como control. Tres días después de transfección las células fueron cosechadas, se tiñe y fija. Análisis por citometría de flujo de estas célulass se muestra en la fig. 5. Esto demuestra la distribución del ciclo celular de las células transfectadas de control negativo (Fig. 5) en comparación con la distribución de las 72 horas siguientes de expresión pRb (Fig. 5B). Después de ajuste de curvas por el software de ciclo múltiple, una comparación directa de la proporción de las fases del ciclo celular se muestra en la fig. 5C. Esto revela la acumulación de células en la expresión G1 siguientes pRb y la disminución relativa de las células de las fases S y G2 / M. Hemos utilizado las variaciones en este ensayo para probar los mecanismos de G1 arresto ampliamente 9, 10, 11, 12, 13. Estos ejemplos demuestran cómo el control del ciclo celular puede ser medida en respuesta a una variedad de estímulos o manipulaciones de la célula. Este enfoque por lo tanto, puede adaptarse a muchas aplicaciones que requieren la medición de la posición del ciclo celular en los experimentos de tipo cultural. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg" /> Figura 1. Quantitción de las fases del ciclo celular con yoduro de propidio combinado y la tinción de BrdU (PI-BrdU). (A) Este panel muestra tres dimensiones de la citometría de flujo con yoduro de propidio y las células BrdU manchado. Tenga en cuenta que las células con el contenido de ADN 2N y 4N se centran en los 200 y 400 marcas en la escala del eje X para la intensidad de tinción con yoduro de propidio. La intensidad de la tinción de BrdU se mide en una escala logarítmica en el eje. Tenga en cuenta la posición de compuertas utilizadas para cuantificar las células en el G1, S y G2 / M fases del ciclo celular. (B) La proporción relativa de células en cada una de las puertas de la G1, S y G2 / M de A se muestran en este gráfico. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg" /> Figura 2. La cuantificación de las fases del ciclo celular en las células seleccionadas con yoduro de propidio y el CD20 de la superficie celular marcador. (A) Este panel muestra yoduro de propidio y CD20 tinción de una mezcla de células, algunas de las cuales ectópica expresan CD20 y pRB. Tenga en cuenta que las células con2N y 4N del ADN (las poblaciones más abundantes) se centran en los 200 y 400 marcas en el eje X. La posición de la puerta de CD20 + selecciona las celdas que están manchados por lo menos 10 veces más brillante que el fondo. (B) Un gráfico de los recuentos de células en comparación con tinción con yoduro de propidio se muestra de células CD20 negativas en el panel A que están proliferando de forma asíncrona. (C) Un gráfico similar se muestra de células CD20 positivas desde el panel A, que han sido inducidos a la detención con la expresión de pRb y contienen células con contenido de ADN principalmente 2N. Esto demuestra que un detenido sub-población se puede distinguir de otras células en esta cultura a través de esta técnica de tinción. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg" /> Figura 3. La inhibición de la proliferación celular por p27Kip1. (A) PI-BrdU análisis se utiliza para medir las fases del ciclo celular en una población de forma asíncrona la proliferación de células que se transduced con un vacío vecto retroviral pBaber. (B) Un análisis similar de las células transducidas con pBabe-p27. Nótese la ausencia de células en la fase S y la mayor intensidad de los eventos en G1 y puertas G2 / M. (C) La cuantificación de las células en las respectivas fases del ciclo celular en forma asíncrona de control y la proliferación de las células que expresan p27. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg" /> Figura 4. La inhibición de la proliferación celular por el TGF-β1 (A) PI-BrdU análisis de la proliferación de células MCF10A forma asíncrona. (B) Análisis de las células tratadas con 100 pM de TGF-β1 durante 24 horas. Tenga en cuenta la acumulación de células principalmente en la fase G1 del ciclo celular. (C) Validación de la tinción de BrdU sustituyendo el anticuerpo anti-BrdU primaria con un control no IgG específica en las células proliferan de forma asíncrona. (D) la cuantificación gráfica de las fases del ciclo celular respectivos de A y B. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg" /><br/&gt; Figura 5. La inhibición de la proliferación celular por pRB. (A) Los recuentos de células en comparación con la tinción con yoduro de propidio de CD20 y ß-gal células transfectadas se muestra. Este es un importante control como parte de la transfección se puede sincronizar las células, haciendo que la población no transfectadas (CD20 - las células) como un control inadecuado de la transfectadas sub-población. Transfectadas las células deben ser comparadas con otras células transfectadas de forma análoga. (B) Los recuentos de células en comparación con el gráfico de yoduro de propidio de CD20 y pRB transfectadas las células. Tenga en cuenta la presencia casi exclusiva de un máximo de 2N. (C) La representación gráfica de las proporciones de células determinada fase del ciclo de A a B y el uso de métodos de ajuste de curvas en el software de ciclo múltiple.

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Los autores no tienen nada que revelar.

En nuestra experiencia, el éxito de estas técnicas depende de unos pocos controles clave y las condiciones experimentales. Uno de ellos es el establecimiento de un control de la proliferación de manera asíncrona para su uso en estos experimentos. Este control tiene tres propósitos importantes. En primer lugar, asegura que las condiciones de cultivo utilizado para todas las muestras experimentales son suficientes para apoyar la proliferación continua de la ausencia de tratamiento. Este ejemplo también sirve el propósito de un control positivo de la metodología de tinción para asegurarse de que BrdU o células CD20 positivas se pueden detectar cuando están presentes. Por último, la muestra se utiliza para calibrar el citómetro de flujo. Esta muestra de control se puede utilizar para ajustar la intensidad de tinción con yoduro de propidio para detectar células 2N y 4N a 200 y 400, respectivamente. Además, la sensibilidad de detección de BrdU o CD20 se puede ajustar para que las señales positivas y negativas se centran, como se muestra en las figuras 1A y 2A. Cuando todas las muestras tienen una concentración similar de células en el PI-RNase solución, entonces algunos ajustes en el citómetro se necesitan muestras posteriores se ejecutan. Esto es importante por razones de la figura. 4B y 5B, donde la acumulación de G1 fuerte crea esencialmente un pico G1 único que podría ser mal interpretada como G2 / M. Los experimentos representante también hacen otros puntos importantes. En primer lugar, demuestran que la captación de BrdU y el etiquetado pueden variar entre los tipos de células. Por esta razón es importante para determinar empíricamente la duración del pulso y de las condiciones de coloración necesarias para detectar adecuadamente las células en fase-S. En general, los tipos de células que hacen las veces de la cultura en 24 horas o menos se pueden etiquetar con BrdU en una hora. De crecimiento más lento tipos de células pueden requerir más tiempo las legumbres y las alteraciones a las condiciones de la tinción de anticuerpos y la duración. MCF10A células son un excelente ejemplo en este sentido, ya que fueron marcadas con BrdU durante cuatro horas y se tiñeron con el doble de la concentración normal de anticuerpos en cuatro veces más. Los investigadoresdebe tener cuidado de no exceder de 6 horas de BrdU a pesar de las células de crecimiento muy lento, ya que erróneamente puede conducir a la inclusión de G2 / M en la población de células en fase S. En segundo lugar, en la comparación de los efectos de p27Kip1 expresión con los de TGF-β1, está claro que p27 puede inducir a una acumulación en cualquiera de las fases G1 y G2 / M, mientras que el TGF-β1 señalización induce una detención en G1. Los medios tradicionales de detección de la proliferación como la 3 H-timidina y recuento de centelleo son incapaces de distinguir estas posibilidades. En nuestro protocolo alternativo que demuestran la detección de una subpoblación de células en una población mayor no transfectadas. Es importante determinar empíricamente el reportero más apropiado para la detección de las células transfectadas. En nuestra experiencia, algunos tipos de células de la superficie celular o bien expresan marcadores de mal, o no puede apropiadamente el tráfico a la membrana plasmática, resultando en una incapacidad para detectar las células transfectadas. Likewise no todas las células tolerar la forma unida a la membrana de las buenas prácticas agrarias. La selección de la reportera más apropiado debe ser hecha por la evaluación de la eficacia de transfección de la periodista, así como la intensidad relativa de expresión en comparación con los controles no transfectadas. Lo ideal es la expresión heteróloga de estas moléculas es bien tolerado y esto sugiere que los marcadores tienen poco o ningún efecto sobre la distribución del ciclo celular. Una limitación de este tipo de métodos de citometría de flujo es que sólo son capaces de establecer las abundancias relativas de las fases del ciclo celular en comparación con los otros. Por esta razón, es ambigua si la expresión de p27 en la Figura 3 realmente induce un arresto en G1 y G2 / M, o si sólo se disminuye la progresión a través de estas fases en relación con la fase S. Estas posibilidades pueden ser investigados aún más por el tratamiento de una muestra paralela de células con un inhibidor de la mitosis, como nocodazole, o G1 / S, como inhibidor de la aphidicolin. Ya que estos fármacos crear una dominaciónnt arresto en la fase M o principios de la fase S, respectivamente, las células proliferan lentamente se acumula en el punto de arresto por drogas inducida. Por ejemplo, células detenidas en G1, debido a la expresión pRb se mantendrá en el G1 a pesar del tratamiento, mientras que nocodazole control de las células se acumulan en la fase-M 13. En conjunto, estos enfoques experimentales ofrecen una metodología flexible que puede aplicarse a una amplia gama de preguntas de investigación de células de mamíferos ciclo. Ellos fácilmente pueden detectar alteraciones en la progresión del ciclo celular y cuantificar las diferencias en comparación con los controles.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> La proliferación de células de etiquetado de reactivos </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Los anticuerpos anti-BrdU </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón conjugado con FITC Anticuerpos </td><td> Vector de los laboratorios </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de células cepa </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos anti-CD20 </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> Cycle Software Multi </td><td> Phoenix Sistemas de Flujo </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cell cycle position in mammalian cells

La regulación de la proliferación celular es esencial para la morfogénesis de tejidos durante el desarrollo de organismos multicelulares. Además, la pérdida de control de la proliferación celular subyace a la patología de enfermedades como el cáncer. Como tal, hay una gran necesidad de ser capaces de investigar la proliferación celular y cuantificar la proporción de células en cada fase del ciclo celular. También es de vital importancia para identificar indistintamente las células que se replican su ADN dentro de una población más grande. Desde la decisión de una célula a proliferar se realiza en la fase G1 inmediatamente antes de iniciar la síntesis de ADN y el avance en el resto del ciclo celular, la detección de la síntesis de ADN en esta etapa permite una determinación inequívoca de la situación de la regulación del crecimiento en cultivo celular experimentos. Contenido de ADN en las células pueden ser fácilmente cuantificado por citometría de flujo de células teñidas con yoduro de propidio, un tinte de ADN intercalantes fluorescentes.Del mismo modo, la síntesis de ADN activo puede ser cuantificada por el cultivo de células en presencia de la timidina radiactiva, de recoger las células, y midiendo la incorporación de radiactividad en una fracción insoluble en ácido. Tenemos una experiencia considerable con el análisis del ciclo celular y recomendar un enfoque diferente. Se investiga la proliferación celular utilizando bromodesoxiuridina / fluorodesoxiuridina (abreviado simplemente como BrdU) tinción que detecta la incorporación de estos análogos de la timina en el ADN sintetizado recientemente. El etiquetado y la tinción de las células con BrdU, junto con la tinción de ADN total de yoduro de propidio y análisis por citometría de flujo 1 ofrece la medida más precisa de las células en las distintas fases del ciclo celular. Es nuestro método preferido, ya que combina la detección de la síntesis de ADN activa, mediante la tinción de BrdU basados ​​en anticuerpos, con un contenido total de ADN de yoduro de propidio. Esto permite la separación clara de las células en el G1 de primera fase S, o S a finales de la fase G2 / M.Además, este enfoque puede ser utilizado para investigar los efectos de muchos estímulos diferentes de células y agentes farmacológicos en la regulación de la progresión a través de estas diferentes fases del ciclo celular. En este informe se describen los métodos para el etiquetado y la tinción de las células en cultivo, así como su análisis por citometría de flujo. También se incluyen ejemplos experimentales de cómo este método puede ser utilizado para medir los efectos de las señales que inhiben el crecimiento de las citocinas como el TGF-β1, y los inhibidores de proliferación, como el inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, p27Kip1. También se incluye un protocolo alternativo que permita el análisis de la posición del ciclo celular en una subpoblación de células dentro de una cultura más amplia 5. En este caso, se demuestra cómo detectar una detención del ciclo celular en células transfectadas con el gen del retinoblastoma, aun cuando en gran medida superados en número por las células no transfectadas en la misma cultura. Estos ejemplos ilustran las muchas formas en que la tinción de ADN ycitometría de flujo pueden ser utilizados y adaptados para investigar cuestiones fundamentales de control de ciclo celular de mamífero.

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Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Determinar la posición del ciclo celular de una población de células, o la comprensión de cómo afectan a la proliferación de señales, puede ser fácilmente medido por citometría de flujo utilizando este protocolo. Se presenta un enfoque simple experimental para la tinción de células y la cuantificación de su posición en el ciclo celular.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

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59.8K vistas.  University of Western Ontario. Determinar la posición del ciclo celular de una población de células, o la comprensión de cómo afectan a la proliferación de señales, puede ser fácilmente medido por citometría de flujo utilizando este protocolo. Se presenta un enfoque simple experimental para la tinción de células y la cuantificación de su posición en el ciclo celular.

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

A largo plazo de imágenes usando las células de mamíferos Wide-Field Microscopía

Investigación

Biología

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

Análisis de Expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagen Ca Local<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en las células de mamífero en cultivo

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...