Usando este método de citometría de flujo cuantitativo, los investigadores pueden calcular las costumbres cinéticas y de equilibrio de la interacción de membrana traída y estimar el número de proteínas traídas por los sitios en la membrana PPH. Las ventajas de este método son la simplicidad y disponibilidad de reactivos y equipos. Este método es exclusivamente para la investigación básica.
El protocolo fue desarrollado para estudiar las interacciones de lípidos de proteínas en el cálculo de sangre, y se puede utilizar en otras áreas para caracterizar la interacción de proteínas con varias membranas lipídicas. El método se puede utilizar para la evaluación cuantitativa de la dinámica de unión al ligando en las diversas células y tipos de ligandos. Comience los experimentos de unión cinética diluyendo las vesículas de fosfolípidos en el tampón de Tyrode a una concentración de un micromolar y un volumen total de 250 microlitros.
Luego mezcle el factor de coagulación X o FX FD marcado con fluorescentes y una concentración de 500 nanomolares con las vesículas de fosfolípidos en una proporción de uno a uno para obtener un volumen total de 500 microlitros. Inyecte inmediatamente 500 microlitros de la suspensión mixta en el citómetro de flujo. A un caudal con una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y un filtro de emisión de 585 nanómetros; con un ancho de 42 para el canal FL dos.
A continuación, mida la fluorescencia media en el canal FL cuatro con excitación a 633 nanómetros y filtro de emisión a 660 nanómetros con un ancho de 20. Cuando se logra la saturación de unión, diluya rápidamente la muestra 20 veces con el tampón de Tyrode y controle la disociación hasta que se alcance una fluorescencia basal, o una meseta. Para los experimentos de unión al equilibrio, incube cinco vesículas de fosfolípidos artificiales micromolares con concentraciones variables de FX FD de cero a 1000 nanomolares en el tampón de Tyrode durante 20 minutos.
Después de la incubación, diluya cada muestra 20 veces hasta un volumen final de 200 microlitros con el tampón de Tyrode y luego analice la muestra diluida por citometría de flujo en 30 segundos. Para analizar los datos, exporte los experimentos en formato FSC desde el software de adquisición de datos de citometría al software de citómetro para el análisis de datos. Al elegir el archivo y, a continuación, hacer clic en las fichas Exportar archivos y ARCHIVOS FSC.
una vez hecho esto, abra los archivos FCS en el software del citómetro seleccionando los archivos en la computadora y arrastrando los archivos al espacio de trabajo del programa. Para la apertura de las microvesículas, identifique la región de las microvesículas por fluorescencia del colorante lipofílico, DIC 16 tres. A continuación, utilice el botón de trazado de la hoja de cálculo para crear un diagrama de puntos SSC a partir de FL dos D I C 16 en coordenadas de registro.
A continuación, elija el botón de puerta rectangular para dibujar una región de cierre. Para analizar los experimentos cinéticos, cree un diagrama de puntos utilizando las coordenadas de fluorescencia a lo largo del tiempo para la región de las vesículas. A continuación, exporte los datos sobre el cambio en la fluorescencia a lo largo del tiempo en el formato CSV; yendo a elegir muestra y haciendo clic derecho en la pestaña de exportación, seguido de elegir FL cuatro veces en parámetros, seleccione el directorio para guardar antes de hacer clic en el formato CSV seleccionado y presione la pestaña de exportación.
Después de la transferencia, abra el archivo CSV en el software estadístico para calcular la fluorescencia de la media móvil simple y el tiempo por cada 1000 eventos aproximados a un gráfico de la dependencia de la fluorescencia de la media móvil única en el tiempo bajo el supuesto de dependencia exponencial y use el valor para calcular la constante de asociación cinética utilizando una ecuación. A continuación, calcule la constante de disociación cinética utilizando la ecuación descrita anteriormente. Para analizar la fecha del ensayo de unión al equilibrio, determinar la fluorescencia promedio de FX FD en la región de las vesículas para cada concentración seleccionada de FX FD y luego aproximar la dependencia de la fluorescencia del factor unido de la concentración del factor agregado en la suposición de unión de sitio único.
Calcule los parámetros de unión promedio utilizando una ecuación a partir de tres repeticiones independientes como mínimo. Proceda a preparar perlas calibradas incubando plaquetas filtradas en gel con calcio IANA 4A veintitrés, ciento ochenta y siete en presencia de cloruro de calcio 2,5 milimolar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las plaquetas activadas agregan las diversas concentraciones de FX FD e incuban las plaquetas con dos volúmenes de formaldehído.
Después de una hora, detenga la reacción incubando las plaquetas con tres glicina molar y 5% BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego purifique la mezcla del tinte no reaccionado con centrifugación a 400 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenado antes de volver a depositar el pellet en el tampón de Tyrode que contiene 0.5% BSA.
A continuación, mida el nivel de fluorescencia de las perlas de calibración en cada muestra utilizando un espectrofluorómetro y luego usando el citómetro de flujo. Determine el número de cuentas en cada muestra con la ayuda de un contador de celdas. Convierta la intensidad de fluorescencia de cada muestra de perla respectiva a la concentración de colorante fluorescente soluble utilizando un espectrofluorómetro y recalcule la concentración de colorante fluorescente para el número de moléculas de espectrofluorómetro.
Cree un gráfico de dependencia de la fluorescencia promedio de las perlas en un citómetro de flujo sobre el número de moléculas de fluróforo para cada muestra. A continuación, aproxime la dependencia por proporcionalidad de línea utilizando el ajuste de análisis y ajuste de tabulaciones lineales en orden. A partir de la aproximación en la ecuación, calcule el factor de conversión de la fluorescencia media a los sitios de unión.
Más tarde calcule el número aparente de los sitios de unión por vesícula de interés. El análisis representativo muestra la apertura de las vesículas lipídicas de fósforo artificial que tienen un micrómetro de tamaño con el tinte fluorescente lipofílico incorporado, el tinte I C 16, la puerta se estableció en base a una muestra que contiene vesículas lipídicas artificiales del mismo tamaño sin el tinte fluorescente. La cinética de la unión de la proteína a las vesículas se analizó en la primera etapa mediante la recolección continua de la muestra.
Los datos obtenidos fueron analizados mediante citometría de flujo. Las mediciones citométricas de flujo deben comenzar tan pronto como sea posible después de mezclar las soluciones y diluir con el tampón de Tyrode. El método propuesto podría complementarse con resonancia de plasma superficial para el estudio de las interacciones de membrana traídas que es altamente sensible con buena resolución temporal y no requiere entrega traída La principal ventaja de este método es su accesibilidad y simplicidad.
