Damos las gracias a los miembros del laboratorio de Miller para la discusión y lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un premio nuevo investigador del Centro de Choque Nathan de Excelencia en la biología básica de vejez para DLM y los Institutos Nacionales de Salud de adjudicación del R00 AG030550 de DLM.

1. Construcción de cámaras de medio ambiente <ol><li> Seleccione el tamaño de volumen razonable de la cámara necesarios para el alcance de su proyecto. Cámara debe estar hecha de gas (O 2) material impermeable. Platos Pyrex cristalización, cajas Anaeropack o grandes acrílico fundido cajas (Ellard Instrumentación), se pueden utilizar. Hemos encontrado que 9 mm placas 50 puede encajar en un 100 x 50 placa de cristalización Kimex. Las placas de vidrio se puede utilizar como tapas para platos de cristalización Pyrex. </li><li> Haga un agujero en la cámara seleccionada y se ajustan con un macho de plástico Luer de conexión de la manguera púa (Cole Parmer). Accesorios, puede obtenerse mediante instalación de tuberías o con epoxi. Instalar un accesorio similar en el lado opuesto del recipiente para permitir que el gas fluya dentro y fuera de la cámara. Si es posible, compensar los agujeros para incrementar la mezcla turbulenta. </li><li> Obtener los tanques de gas comprimido, con definidas concentraciones de O2 (en equilibrio con N 2) que están certificados estándar de O 2 COntent o, en condiciones de anoxia, puro N 2 (&lt;10 ppm de O 2). Utilice conmutación automática reguladores de estudios a largo plazo para evitar la interrupción de los niveles de oxígeno en las cámaras. </li><li> Organismos respuesta a la hipoxia se ha demostrado que es dependiente de la temperatura 15. Al colocar la cámara en una incubadora, diferentes temperaturas puede ser mantenida. Las temperaturas dentro de una incubadora puede ser desigual y, como tal, es prudente hacer uso de un registrador de datos de temperatura para medir continuamente la temperatura dentro de la cámara. </li></ol> 2. Conexión del gas a la Cámara del Medio Ambiente <ol><li> Para todas las conexiones, utilice un octavo de pulgada de diámetro exterior de un tubo conectado a través de conectores rápidos, ya sea o accesorios de compresión. Tubería debe ser impermeable y no reactivo con O 2, tales como etileno propileno fluorado (FEP) o nylon (Cole Parmer). Para una vista esquemática de la instalación completa, véase la Figura 1. </li><li> Conecte el comprensadas tanques de gas a un dispositivo de control de flujo, tales como un controlador de flujo másico (Sierra Instruments) o rotámetro (Aalborg). Asegurarse de que la presión aguas arriba del tanque está dentro del alcance del dispositivo de flujo y los accesorios de la manguera lengüeta. Dos etapas reguladores se utilizan generalmente, con la segunda etapa establece en la presión deseada [Véase la sección tres para seleccionar la velocidad de flujo apropiado] </li><li> Hidrato del gas por burbujeo a través del agua destilada utilizando una botella de lavado de gas con el cilindro poroso, a continuación, directamente en uno de los accesorios en la cámara ambiental, dejando el accesorio segunda abierto para gases de escape (ver Figura 1). Para estudios a corto plazo, la hidratación de gas protege contra la desecación plato, pero el monitoreo de humedad puede ser necesario para estudios a largo plazo. </li><li> Dow Corning grasa de vacío se puede utilizar para sellar la cámara. Coloque pesos en la tapa de la cámara para asegurar un sello hermético. Para confirmar un cierre hermético y un flujo adecuado, mantener una pequeña piscina de agua en la palma de la mano de ynuestra mano enguantada a la conexión a cabo en la cámara y compruebe si hay burbujas. </li></ol> 3. Selección de velocidad de flujo <ol><li> Suponiendo una mezcla perfecta, existe un 90% el intercambio de gases de la atmósfera gaseosa cada vez que se sustituye el volumen de la cámara (Ley de Fick). Por ejemplo, en una cámara de 100 cc con un caudal de 100 cc / min, la casa original de aire en la cámara será reemplazado con un 90% de su gas deseado después de 1 minuto, y se aproximará asintóticamente intercambio completo en un 90% cada minuto posteriormente. </li><li> Las mayores tasas de flujo y pequeños contenedores llegarán a su concentración deseada de oxígeno con mayor rapidez. Para 100 x 50 Kimex contenedores (400 cc), un caudal de 120 cc / min llegará a 99,9% de cambio en 10 minutos (3 intercambios). Este caudal es adecuado para la mayoría de condiciones de oxígeno. Para nuestro conocimiento no ha habido una investigación sistemática de cómo la tasa de cambio de concentración de O 2 influye en la respuesta en C. elegans. </li></ol><ol><li> Los gusanos expuestos a condiciones hipóxicas comúnmente escapar de la superficie de placas de agar. Para evitar esto, colocar un anillo de ácido palmítico (10 mg / ml en etanol) alrededor del borde de las placas. El ácido palmítico se salgan de la solución como se evapora el etanol, formando una barrera física. Las barreras de ácido palmítico no afectar la tasa de puesta de huevos, la fecundidad o la esperanza de vida en C. elegans 16,17. Madriguera no se produce con más frecuencia en condiciones de hipoxia, las medidas preventivas adicionales que no lo son por lo general requiere. </li><li><ol><li> Generar las poblaciones sincronizadas por el blanqueo adultas grávidas en una pequeña gota de solución de lejía alcalina de cabezas de serie de nematodos de crecimiento de los medios (NGM) placas 18. En contraste con los protocolos estándar de hipoclorito de gran lote de blanqueo, recoger 1-100 animales en una gota de solución de cloro en la superficie de una placa de NGM, a continuación, permitir que la solución de cloro para absorber en la placa <sup&gt; 18. Después de al menos 12 horas, trasladar las larvas L1 sincronizada a las placas sembradas con vivos OP50 bacterias. Alternativamente, se puede permitir que los adultos grávidas que ponen huevos en el plato durante 2-3 horas para generar un grupo de gusanos que se desarrollará de forma sincrónica o recoger larvas L4 de una población mixta. </li><li> Evite la exposición de embriones blanqueados a la hipoxia, ya que esto puede reducir la viabilidad 13. Para recoger los embriones jóvenes (2-4 células), los adultos grávidas puede ser cortada en un pequeño volumen de agua con una hoja de afeitar y los embriones se trasladó a las placas por pipeta boca para la posterior exposición a la hipoxia. </li></ol></li><li> Sellar las placas en la cámara ambiental. Los animales de control deben mantenerse en normoxia (casa aire) a la misma temperatura que los gusanos tratados. No hay diferencia observable entre las muestras que quedan en casa aire y los mantienen en una cámara idéntica a casa aire que fluye sobre ellos. Iniciar el flujo de gas y mantener la exposición durante el tiempo deseado. Para garantizar la uniformidad en la rampa, asegúrese dereemplazar el agua de la botella de lavado de gas antes de la exposición. </li><li> Para la supervivencia de embriones ensayo, permita que los gusanos a desarrollar durante 48 h después de la vuelta al aire ambiente, momento en el que debe ser la cuarta etapa larvas / día uno adultos. Goles para la supervivencia, la censura de los gusanos que no pueden tenerse en cuenta. </li><li> Para visualizar los animales expuestos a la hipoxia, mover los gusanos a una gota de M9 en un 22 mm 2 cubreobjetos, y se invierte en una almohadilla de agarosa al 2% en M9 18. Si el levamisol es necesario, (25 mM) o azida de sodio (10 mM) se puede utilizar como anestésico. La azida de sodio y levamisol podría confundir a algunas observaciones debido a la toxicidad y debe ser utilizada con prudencia 19. </li></ol> 5. Cosecha rápida de hipoxia expuestos gusanos (por ejemplo: preparación de muestras para HIF-1 Análisis de Western) Muchos la hipoxia inducida por los efectos se revirtieron rápidamente a su regreso al aire de la habitación, incluida la reanudación de la producción de huevos 12, la fosforilación de epítopos mitóticasen la embriogénesis 13 y la degradación de la proteína HIF-1 9,20. Aislamiento rápido de los animales expuestos a la hipoxia se requiere para obtener los efectos reproducibles en estas condiciones. Con esta configuración, los animales pueden ser cosechadas y se congelaron en nitrógeno líquido en menos de dos minutos. Mientras que las cámaras de hipoxia caja de guantes permiten la manipulación de las muestras en condiciones de anoxia, su costo y la practicidad para fines distintos a la anoxia limitar su utilidad. <ol><li> Crecer Bristol gusanos N2 en 4 de 10 cm de alto crecimiento (HG) las placas hasta que la mayoría de los gusanos son adultas grávidas de 18 años. Lavar gusanos a un tubo cónico de 15 ml que contiene una solución 01:05 lejía alcalina y se incuba con la rotación hasta que los gusanos empiezan a disolverse, no más de 5 minutos 9. Lave los gusanos tres veces con M9, desacelerándose a 1500 xg entre cada lavado sin frenos. </li><li> Placa blanqueados embriones sobre 8 150 mm y placas de NGM permitan desarrollar larvas L4 (aproximadamente 48 horas de Bristol N2 a 22 ° C).Mueva placas de cámaras ambientales y exponer a hipóxica (1.000 ppm, 5.000 ppm) y anóxicas (N2) condiciones durante 4 horas. Los tiempos de exposición variará dependiendo del diseño experimental. Mientras que la exposición a la hipoxia tiene un efecto inmediato sobre la tasa de puesta de huevos, embriones de dos células mueren después de 16-18 horas de la exposición 12. Con esta configuración cámara hipoxia, el límite inferior de la exposición se ve limitada por el tipo de cambio atmósfera necesaria para alcanzar el equilibrio. </li><li> Etiqueta de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y un tubo de 15 ml cónico para cada muestra experimental. Los gusanos expuestos a la hipoxia son más propensas a pegarse a las paredes del tubo durante la cosecha. Para evitar esto, el lugar 100 l de sulfato de sodio al 1% de dodecil (SDS) en cada tubo cónico de 15 ml. Si SDS inhibe aplicaciones posteriores, albúmina de suero bovino (BSA) se puede utilizar para evitar que se pegue. El uso rutinario de la SDS o BSA no parecen tener una diferencia evidente. Añadir 50 l de 2x proteína carga colorante (4% de SDS, 10% de 2-mercaptoetanol y unrastrear de azul de bromofenol en 30% de glicerol (w / v)) para el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tener un Dewar de nitrógeno líquido listo. </li><li> El tiempo de los pasos después de la eliminación de los gusanos de la hipoxia y el registro. Retire la tapa de la cámara de hipoxia, tomar un plato de muestras, y cerrar la cámara. Use agua destilada para lavar los gusanos a un filtro de nylon y luego verter en el tubo cónico de 15 ml. Haga girar los gusanos en una centrífuga de sobremesa a 1500 xg durante 15-20 segundos con freno. </li><li> Utilizar un vacío para eliminar la mayor parte del sobrenadante del tubo, dejando intacto el gusano de pellets. </li><li> Con una pipeta, mover el gusano de pellet en 50 l del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cierre el tubo y se sumergen en nitrógeno líquido. </li><li> Repita hasta que todas las muestras han sido aislados. Siga estos procedimientos para las muestras de control de aire de la casa de la coherencia. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C. </li></ol> 6. Los resultados representativos Organismal efectos de la hipoxia puede versemediante el examen de la viabilidad a la edad adulta de C. elegans (Figura 2). Los embriones puestos por tipo salvaje Bristol (N2) y HIF-1 (ia04) mutantes de deleción son todos sobreviven en la casa de aire concentraciones de O2 (210.000 ppm de O 2). N 2 los gusanos son capaces de adaptarse y sobrevivir a la edad adulta en ppm S 5000 2, mientras que HIF-1 embriones no son viables. Esto demuestra que HIF-1 es esencial para la adaptación a los niveles cambiantes de oxígeno disponible en el entorno 10. Ni N2, ni animales de HIF-1 puede sobrevivir a la exposición a 1.000 ppm de O 2. Visualización de gusano directamente en la hipoxia es factible con el uso de un microscopio de disección y recipiente transparente (Figura 3). Al colocar directamente la cámara de hipoxia en el microscopio de disección, no hay necesidad de eliminar los gusanos de la hipoxia para observar las reacciones de organismos. El ámbito puede estar equipado con illumation fluorescencia (como en la Figura 3 </strong&gt;), ampliando aún más los tipos de observaciones en la hipoxia que son posibles. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> Figura 1. Ejemplo de hipoxia cámara. La dirección del flujo de gas se indica por las flechas. El gas se almacena en los tanques de gas comprimido con definidos O 2 concentraciones (1) y un regulador de dos etapas se adjunta (2). El gas entra la parte inferior del tubo de flujo (3), que sale de la parte superior a la tasa de flujo correcto. El gas fluye en el matraz de burbuja (4), la hidratación del gas (asegurar la correcta conexión de burbuja matraz mediante la observación de burbujas). Gas hidratado luego pasa a la cámara de hipoxia en la válvula de entrada (5), exponiendo las muestras a la hipoxia. El gas, finalmente, los respiraderos en la habitación a través de un orificio de escape perforado en la cámara. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> Figura 2. La viabilidad de los embriones expuestos a 1000 ppm de O 2, 5000 ppm de O <sub&gt; 2 y normoxia (~ 210.000 ppm de O 2). Los embriones fueron expuestos a las condiciones de cada uno de oxígeno como embriones de 24 horas continuas en cámaras de flujo de oxígeno. Los gusanos fueron trasladados a normoxic condiciones, permitieron el desarrollo hasta la edad adulta durante 48 horas, y luego anotó para la viabilidad a la edad adulta. n&gt; 50, N = 5. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> Figura 3. Visualización de C. elegans en la hipoxia con el microscopio. Los gusanos están expuestos a la hipoxia utilizando los métodos descritos. La cámara transparente ambiental (construido con una placa de cristalización Pyrex y la placa de vidrio) se coloca directamente en la etapa de un microscopio de disección. Dos puntos de vista se muestran, uno que incluye el flujo de gas de todo el conjunto, los otros sólo con la cámara sobre la platina del microscopio.

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No hay conflictos de interés declarado.

Este método presenta una estrategia para construir un entorno hipóxico que permite ambientes con concentraciones exactas de oxígeno para ser mantenidas en el laboratorio. Estas cámaras proporcionan un método sencillo para exponer a los organismos específicos bajas concentraciones de O 2 y el seguimiento de las salidas moleculares y fisiológicas. La cámara ambiental descrito es montado por el laboratorio en lugar de comercialmente adquirida y por lo tanto puede ser modificado para adaptarse a las neces...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tubería (FEP y PTFE) </td><td> Cole Parmer Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE) &#39;R-3603 </td></tr><tr><td> Accesorios de compresión </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> 06.363-58 (M. acoplador de 1/16 &quot;) 06363-62 (F. acoplador de 1/16 &quot;) 06363-60 (M. acoplador 1/8 &quot;) 06363-61 (F. acoplador 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> Flujo de tubo </td><td> Aalborg </td><td> PMR3-010073 (3 de salida) PMR1-013520 (1 salida) </td></tr><tr><td> Misa controlador de flujo </td><td> Sierra Instruments </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Misa Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) </td></tr><tr><td> Tanque de gas comprimido </td><td> Airgas </td><td> Hecho por encargo &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Luer macho de plástico a los accesorios para manguera </td><td> Cole Parmer </td><td> 45.505-41 (serie 500 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> Reparto de cajas de acrílico </td><td> Ellard Instrumentación </td><td> Hecho por encargo </td></tr><tr><td> Accesorios de tubería (de latón o acero inoxidable) </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> B-402-1 (1/4 &quot;tuerca) B-200-3 (1/8 &quot;camiseta de la Unión) B-400-conjunto (1/4 &quot;casquillos) B-QM2-B1-200 (control de calidad QM Cuerpo) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;macho conn) </td></tr><tr><td> Dow Corning grasa de vacío </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> AnaeroPack cuadro </td><td> Misubishi Gas Chemical Company </td><td> R684004 (0,4 litros) R685025 (2,5 litros) R685070 (7,0 litros) </td></tr><tr><td> Pyrex de gas botella de lavado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> El ácido palmítico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> De cabra anti-IgG de ratón-peroxidasa de rábano </td><td> Southern Biotechnology Asociados </td><td> 1032-1005 </td></tr><tr><td> SuperSignal West Pico Chemiluminsecent sustrato </td><td> Pierce Chemical </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 platos de cristal de la cristalización </td><td> Kimax Kimble </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on c. elegans

El oxígeno es esencial para todos los metazoos para sobrevivir, con una sola excepción conocida 1. Disminución de la disponibilidad de O 2 (hipoxia) pueden surgir durante los estados de la enfermedad, el desarrollo normal o cambios en las condiciones ambientales 2-5. La comprensión de las vías de señalización celular que están implicadas en la respuesta a la hipoxia podría proporcionar una nueva visión de las estrategias de tratamiento para diversas patologías humanas, los accidentes cerebrovasculares hasta el cáncer. Este objetivo se ha visto obstaculizada, al menos en parte, por las dificultades técnicas asociadas a la exposición controlada de hipoxia en los organismos genéticamente susceptibles modelo. Los nematodo Caenorhabditis elegans es ideal como un organismo modelo para el estudio de respuesta hipóxica, ya que es fácil de manipular genéticamente y la cultura. Además, es posible estudiar la respuesta celular a hipoxia específicas de O 2 concentraciones sin efectos de confusión desde C. elegans obtención de O 2 (y otros gases) por difusión, en oposición a un sistema respiratorio facilitado 6. Factores que se sabe están implicados en la respuesta a la hipoxia se conservan en C. elegans. La respuesta real a la hipoxia depende de la concentración específica de O 2 que está disponible. En C. elegans, la exposición a la hipoxia moderada provoca una respuesta transcripcional mediada en gran parte por HIF-1, los altamente conservadas por la hipoxia-inducible factor de transcripción 6-9. C. elegans embriones requieren HIF-1 para sobrevivir en 5,000-20,000 ppm de O 2 7,10 . La hipoxia es un término general para &quot;menos de lo normal de O 2&quot;. Normoxia (normal O 2) también puede ser difícil de definir. En general, consideramos aire de la habitación, que es 210.000 ppm de O 2 para ser normoxia. Sin embargo, se ha demostrado que C. elegans tiene una preferencia conductual para el O 2 concentraciones de 5.12% (50.000-120.000 ppm O 2) 11. En larvae y adultos, HIF-1 actúa para prevenir la hipoxia inducida por la diapausa en 5000 ppm de O 2 12. Sin embargo, HIF-1 no juega un papel en la respuesta a bajas concentraciones de O 2 (anoxia, la definición operativa &lt;10 ppm de O 2) 13. En la anoxia, C. elegans entra en un estado de animación suspendida reversible en el que toda la actividad observable al microscopio deja 10. El hecho de que diferentes respuestas fisiológicas se producen en diferentes condiciones destaca la importancia de tener control experimental sobre la concentración de O 2 hipóxico. A continuación, presentamos un método para la construcción e implementación de cámaras ambientales que producen condiciones de hipoxia confiables y reproducibles, con concentraciones definidas de O 2. El método de flujo continuo asegura un rápido equilibrio de la cámara y aumenta la estabilidad del sistema. Además, la transparencia yaccesibilidad de las cámaras permiten la visualización directa de los animales estén expuestos a la hipoxia. Además, demuestran un método eficaz de recolección C. elegans muestras rápidamente después de la exposición a la hipoxia, que es necesario observar muchos de los cambios rápidamente-invertidos que se producen en la hipoxia 10,14. Este método proporciona un fundamento básico que puede ser fácilmente modificado para las necesidades de cada laboratorio, incluidos los sistemas de modelos diferentes y una variedad de gases.

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Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Este documento detalla cómo usar cámaras de flujo continuo de hipoxia para generar atmósferas con concentraciones definidas de O<sub&gt; 2</sub&gt; Entender las respuestas biológicas a la disminución de O<sub&gt; 2</sub&gt;. Este sistema es fácil de instalar y mantener, y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una amplia gama de O<sub&gt; 2</sub&gt; Concentraciones y sistemas modelo

Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

creating-defined-gaseous-environments-to-study-effects-hypoxia-on-c

Research

JoVE Journal

Biology

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

12.0K vistas.  University of Washington. Este documento detalla cómo usar cámaras de flujo continuo de hipoxia para generar atmósferas con concentraciones definidas de O 2 Entender las respuestas biológicas a la disminución de O 2. Este sistema es fácil de instalar y mantener, y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una amplia gama de O 2 Concentraciones y sistemas modelo

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Investigación

Biología

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...