Las figuras 1 y 2 se publicó anteriormente en Free Radical Biology y Medicina (Queliconi et al. 5) y tienen los derechos de autor en poder de Elsevier. Este trabajo fue apoyado por el Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), el Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, el Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), y USPHS GM087483 (KN ). Barbacoa es un estudiante de doctorado con el apoyo de una beca de la FAPESP.

1. C. Crecimiento elegans <ol><li> Preparar 35 mm Nematodo Crecimiento Medios (NGM) placas de agar sembradas con bacterias OP50, como por métodos de cultivo estándar 1. </li><li> Sincronizar C. elegans mediante la colocación de 6 adultos grávidas en una placa de NGM sin ​​semillas. Retire los adultos después de ~ 100 huevos se han establecido (hr ~ 3). </li><li> Las placas se incuban durante 3 días a 20 º C, momento en el que los gusanos se han desarrollado hasta la etapa adulta joven y son óptimos para este experimento. Protocolos alternativos para sincronizar C. elegans se describen en otra parte 10. </li></ol> 2. Materiales para AS <ol><li> M9 buffer (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM de Na 2 HPO 4, NaCl 86 mM, 1 mM MgSO 4) debe ser purgada de oxígeno equilibrando con N 2 (argón también se puede utilizar) durante 30 min antes del experimento y se mantiene rodeado de hielo. </li><li> Haz un pequeño agujero (3 mmde ancho) en la tapa de 1,5 ml tubos de microcentrífuga en el que se colocarán los gusanos durante AS. El agujero permite el intercambio de gases sin tener la tapa abierta, ya que esto puede conducir a un exceso de evaporación medios. </li></ol> 3. Anoxia / Inanición <ol><li> Llevar a cabo todos los experimentos al menos por triplicado. </li><li> Añadir 1 ml de tampón de RT, M9 oxigenada a cada placa de 35 mm que contiene gusanos adultos jóvenes cultivadas como se describe anteriormente. Tenga cuidado para evitar la eliminación de las bacterias de la placa (añadir M9 a los bordes en los que no se sembraron las bacterias). Después de ~ 1 min los gusanos deben nadando en el M9. </li><li> Escudo una punta de pipeta de 1 ml con BSA al vaso y la expulsión de una solución estéril de BSA al 1%. </li><li> Incline con cuidado la placa que contiene los gusanos en tampón M9, retire la M9 desde el mismo lugar en el que se añadió, y colocar la suspensión en los tubos de microcentrífuga preparadas. Dejar reposar en hielo hasta que los gusanos han caído a la parte inferior de los tubos (~ 1-2 Min). </li><li> Retire la mayor cantidad de M9 posible sin molestar a los gusanos del tubo (dejando unos 100 l), añadir 1 ml de la M9 y helado purgado con oxígeno y colocar el tubo en hielo hasta que los gusanos depositan en el fondo de nuevo. Repita el último paso de 3x. En el último lavado, eliminar la M9 hasta ~ 100 l permanece en el tubo. </li><li> Coloque los tubos con los gusanos en desoxigenada M9 dentro de una cámara anóxica / hipóxica (ver instrucciones abajo, Sección 3.6.1) o, alternativamente, en un contenedor sellado a medida (vea las instrucciones más adelante, sección 3.6.2). <ol><li> Si un anóxica / hipóxica cámara comercial es para ser utilizado, dejar un poco de M9 purgado dentro de la cámara antes de comenzar el paso 3.5 y repita el paso 3.5 una vez que los gusanos son dentro de la cámara. </li><li> Si una cámara personalizada se va a utilizar, una descripción detallada de cómo crear un aparato de bajo costo se presenta al final de este protocolo y ha sido descrito por otro grupo previamente 11. En pocas palabras: <ol&gt; <li> Haga dos agujeros en la tapa 250 de tipo Tupperware ml recipiente y agregue conectores de tubos para ellos. Una de ellas será usada para inyectar la mezcla de gas mientras que el otro será el de salida de gas en un baño de agua. </li><li> Coloque los gusanos en la cámara y sellar la cámara con la tapa. </li><li> De gas con una constante N 2 de flujo (100 ml / min). </li><li> Coloque el recipiente en el interior de un baño de agua a 26 ° C. Asegúrese de que el tubo de salida está bien sumergido en agua por lo que no hay retornos de aire y que no hay fugas en el sistema (aparente por las burbujas que surgen de la propia cámara). </li></ol></li></ol></li><li> Incubar los gusanos a 26 ° C durante 20 horas. </li></ol> 4. La reperfusión simulado <ol><li> Después de 20 horas bajo condiciones que, retire los tubos de la cámara de incubación en el aire ambiente. </li><li> Pipetear C. elegans con una punta recubierta con BSA (como en el paso 3.3) en un OP50 sembró 35 mm placa de NGM. Incubar las placas a 20 ° C durante 24 horas.Después de esto, los gusanos estarán listos para ser anotado. </li></ol> 5. Identificar Dead Versus vivo Worms <ol><li> Usando una selección de platino, toque ligeramente la parte superior de la cabeza del gusano. Gusanos vivos se moverán hacia atrás después de ser tocado. Si los gusanos son nonresponsive, anotar muerto. De vez en cuando, un gusano no se moverá hacia atrás, pero puede presentar un ligero movimiento de la cabeza de lado a lado. Aunque técnicamente no es muerto, estos gusanos es casi seguro que vencerá en cuestión de horas, y deben ser marcados como muertos. Si uno espera demasiado tiempo para anotar los gusanos, la eclosión interna de la progenie puede ocurrir y estas &quot;bolsas-de-gusanos&quot; se puede romper, por lo que la detección de los cadáveres muy difícil. </li><li> Retire ambos gusanos vivos y muertos de la placa que se computen para evitar conteos duplicados. Los gusanos vivos se pueden mover a una placa separada para realizar ensayos de comportamiento. La cantidad de gusanos que viven en relación con el total se representa como el% de gusanos supervivientes (Figura 1A </stRong&gt;). </li></ol> 6. Toque Ensayo de Respuesta <ol><li> Una descripción detallada de este protocolo ha sido presentado en Hart, Anne C., ed. Comportamiento (3 de julio de 2006), WormBook, ed. El C. elegans Comunitaria de Investigación, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> Para anotar la respuesta táctil, identificar los gusanos que se mueven y toque ligeramente el lateral de la cabeza del tornillo sin fin (cerca de la parte media de la faringe), con una selección de pestañas (Figura 3). </li><li> Si el gusano se mueve hacia atrás, anotar lo más sensible, si no, la puntuación por no ajustarse (Figura 1B). Repita este paso 10-15x para cada gusano con intervalos de 10 seg. Sonda al menos 10 gusanos en cada grupo para tener datos precisos. El mismo ensayo se puede usar para evaluar los cambios de locomoción hacia adelante siguiente toque ligero a la pared posterior del cuerpo. Asegúrese de no tocar la cabeza o la cola del gusano, ya que esto estimula un comportamiento distinto. </li><li> Por último, encepas de control genético corporativos [N2 Bristol de tipo salvaje para, mec (mecanosensorial) mutante positivo para el negativo - por ejemplo CB1338 mec-3 (e1338) IV] para calibrar la fuerza con la que tocar los gusanos. Demasiado duro de un estímulo provocará una respuesta de comportamiento en los mutantes mec, demasiado poco no va a provocar un efecto en los controles de tipo salvaje N2. </li></ol></li></ol> 7. Neuronal Modificaciones <ol><li> Para visualizar Post como modificaciones neuronales, utilizar una cepa que expresa GFP en las neuronas mec táctiles responden 4,5. Estas neuronas tienen largos procesos que se ejecutan a lo largo de la pared del cuerpo y son fácilmente anotó para anomalías morfológicas. Además, la información morfológica puede ser integrado con medidas de comportamiento de la función neuronal, como se describió anteriormente. Una cepa que se puede utilizar para este propósito es TU2583, que está disponible en el C Centro de Genética elegans y contiene el transgén integrado uIs25 expresando GFP from el promotor MEC-18, o alternativamente TU2562, que contiene un MEC-3 :: GFP fusión integrado. </li><li> Preparar una almohadilla de agarosa. <ol><li> Derrita la agarosa al 2% en agua, traiga a 1x M9 con un 10x, y mantener la solución a 70 ° C. </li><li> Coloque una gota (~ 20 l) de esta solución en un portaobjetos de vidrio (25 mm x 75 mm) que se ha colocado entre los otros dos diapositivas, cada uno de los cuales tienen una sola pieza de cinta adhesiva en su lado inferior. </li><li> Coloque un portaobjetos de vidrio final perpendicular a la primera en la parte superior de la solución de agarosa al 2%, y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Esto debería formar una almohadilla que es el espesor de la cinta. </li><li> Retire el carro superior y añadir 10 l de M9 que contenía 0,1% tetramisol, que inmovilizar a los gusanos. </li></ol></li><li> Mueva algunos (~ 10) viven gusanos en la diapositiva de agarosa al 2%. Coloque un cubreobjetos sobre ellos y visualizar GFP usando un microscopio de fluorescencia bajo un objetivo 100X con la iluminación apropiada. </li><li> Estropeadoneuronas mostrarán una cadena citosólica de la membrana de patrón de perlas en los procesos, compuesto por punctum múltiple (Figura 2A), y / o anomalías en la que aparecen los procesos para ser rotas (Figura 2B). Número de punto lagrimal y anomalías en las neuronas para cada tornillo sin fin, utilizando un total de al menos 10 gusanos. </li></ol> 8. Cámara hipóxica Lab-hecho <ol><li> Un estilo Tupperware, envase sellado hermético puede readaptar como una cámara anóxica. Tenga cuidado al seleccionar un contenedor que es tan pequeño como sea posible. Un pequeño contenedor crea un ambiente hipóxico más rápido y es más fácil de encajar en el baño de agua (Figura 4). </li><li> Haga dos agujeros en la tapa (se puede hacer con un destornillador o por calentamiento de fórceps y obligando a la tapa) e insertar un conector de plástico o metal que se ajusta el tubo (Figura 5A). Utilice pegamento que se puede colocar bajo el agua, y también se pone duro después del secado, evitando el movimiento deel conector y reducir por lo tanto la posibilidad de fugas (Figura 5B). </li><li> El recipiente debe ser colocado en el baño de agua de modo que se sumerge por completo (Figura 4). Para sumergir el recipiente, use un peso de la botella o de un peso de buceo. </li><li> Una de las conexiones de tubo se puede utilizar para introducir una mezcla de gas y el otro tubo actuará como un alivio de presión, por lo tanto, se debe dejar bajo el agua, de manera que el contenedor se sella del ambiente externo (Figura 4). </li><li> La composición del aire se puede modular mediante el uso de gas por encargo, controladores de flujo de masa o cualquier aparato que mezcla los gases deseados. El flujo de gas debe ser controlado, como de alto flujo puede crear una evaporación excesiva. Por ejemplo, en un recipiente de 250 ml, 100 ml / min de gas proporcionará buen espacio para los gusanos y un fundente adecuado. </li><li> La longitud del tubo debe mantenerse a un mínimo, ya que pueden ser permeables al gas, unallowing la entrada de O 2. Es importante evitar el uso de silicona, de Tygon tubos ya que estos materiales son permeables al intercambio de gases. Preferimos tubos de polipropileno o de nylon. Vidrio o la tubería de metal mantienen los gases bien, pero son también más difíciles de trabajar. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+gene+function+in+Caenorhabditis+elegans+using+RNA-mediated+interference.">Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference.</a> Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).</li><li>Vanden Hoek, ., L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate+modulates+oxidative+and+functional+damage+in+ischemia-reperfusion.">Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion.</a> Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).</li><li>Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+anesthetic+preconditioning+present+in+the+invertebrate+Caenorhabditis+elegans.">Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans.</a> Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).</li><li>Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-2+is+cytoprotective+and+contributes+to+mitochondrial+potassium+transport.">SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport.</a> PloS One. 6 (12), e28287 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+defined+gaseous+environments+to+study+the+effects+of+hypoxia+on+C.+elegans.">Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (65), e4088 (2012).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+anaerobic+response+of+C.+elegans+using+GC-MS.">Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS.</a> PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cell+cycle-regulated+proteins+correlates+with+anoxia-induced+suspended+animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).</li><li>Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+hif-1+gene+encodes+a+bHLH-PAS+protein+that+is+required+for+adaptation+to+hypoxia.">The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li><li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. k. o. g. e. r. b. &. #. 2. 4. 8. ;. G., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression.">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li><li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme,+Ndi1,+in+myocardial+reperfusion+injury.">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288 (2011).</li><li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development.">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como ha sido ampliamente utilizado en C. elegans para modelar la lesión IR. Algunos puntos clave hay que destacar para este protocolo: C. elegans son resistentes a una amplia gama de lesiones, lo que justifica la necesidad de 3 insultos concomitantes (calor, hambre y anoxia) para lograr la muerte de utilizar este sistema. Solo Anoxia no mata a los gusanos en esta ventana de tiempo 14. Por otra parte, el aumento de temperatura es una tensión adicional, por lo que es importante vigilar de cerca. Estrictamente hablando, la inanición no contribuye significativamente al grado de mortalidad observada 7, de por sí, pero parece reducir la variabilidad entre los distintos recipientes experimentales. Teniendo en cuenta que no puede haber una variabilidad significativa desde el día a día, es muy importante comparar las muestras se ejecutan directamente en paralelo, y para repetir los experimentos durante varios días. En general, los resultados se miden por tres placas separadas de 50 a 100 gusanos / condición experimental y éstos son losn promedio y considerado como una sola réplica experimental. Generalmente, entre siete y nueve repeticiones parecen ser suficiente para lograr o descartar significación estadística. La etapa de desarrollo de los gusanos utilizados en el experimento también debe ser monitoreado cuidadosamente como la susceptibilidad de las diferentes etapas de AS daño varía significativamente 15,16. El uso de los adultos jóvenes es estándar, y la etapa de larvas (L3 y L4) gusanos parecen ser más resistentes a los efectos dañinos de los AS (datos no publicados). Este protocolo presenta dos formas de realizar los experimentos, uno usando un aparato de laboratorio a medida (utilizando contenedores de tipo Tupperware y entrada de gas 11) y otra usando una cámara hipóxica comercial 4,6. La anoxia puede lograrse por otros medios que consumen el oxígeno, tal como se describe en otra parte 13,17. El uso de técnicas alternativas para crear un ambiente hipóxico puede cambiar el tiempo de incubación necesario ASpara crear la cantidad deseada de la muerte. Orientación ~ 20% de supervivencia es un punto de partida ideal para el estudio de las intervenciones de protección, mientras que el 80% es igualmente ideal para intervenciones que agravan los efectos perjudiciales de la AS. Otra advertencia importante es el tiempo en el que las puntuaciones de observadores gusanos muertos / vivos. Si el tiempo de análisis se extiende más allá de las 24 horas, los datos pueden ser engañosos, ya gusanos muertos vuelven cada vez más difíciles de identificar. Esto puede ser debido a los cadáveres gusano convertirse relativamente transparente a través del tiempo, pero también al hecho de que los embriones fecundados pueden convertirse en la progenie post-mortem en el interior de las carcasas y perturbar ellos a medida que surgen. El análisis de la morfología neuronal se puede modificar para observar los patrones de expresión de proteínas 18, la fragmentación nuclear 4 y otros parámetros 19 mediante la sustitución de una cepa de gusano que expresa el marcador codificado genéticamente apropiada. Una advertencia final es que la visualización de laprocesos neuronales se debe hacer a menos de 30 minutos después de la colocación de los gusanos en la diapositiva. Confinamiento de los animales bajo anestesia en las diapositivas durante períodos más largos pueden presentar daños AS-independiente. Ajuste la cantidad de animales por cremallera de acuerdo con el tiempo que se necesita para realizar un seguimiento y analizarlos.

C. elegans es un nematodo que ha sido ampliamente adoptado como un modelo de organismo eucariota multicelular desde su introducción por Brenner 1. Es un modelo barato, sencillo y versátil, que permite una conexión fácil entre alteraciones genéticas y fenotípicas cambia 2. La isquemia se caracteriza por una falta de nutrientes y el suministro de oxígeno a un tejido, seguido de reperfusión, cuando una ráfaga de especies reactivas del oxígeno se produce 3 y la mayoría del daño ocurre. En 2002, un modelo de isquemia / reperfusión (IR) en C. elegans fue desarrollado 4 que implica la presentación de todo el gusano a la anoxia, la privación de nutrientes y el estrés por calor durante aproximadamente 20 horas, seguido de 24 horas en condiciones normales. Aunque este modelo es técnicamente una anoxia-inanición (AS) condiciones, la muerte celular se produce a través de mecanismos que se conservan en los mamíferos, incluyendo el daño inducido por oxidantes durante la reperfusión &lt;sup&gt; 5. Además, similar a la de los mamíferos IR, daño inducido por AS en C. elegans pueden ser prevenidas por precondicionamiento isquémico 6,7 o preacondicionamiento anestésico 8,9. Los protocolos siguientes muestran cómo para imitar IR en C. elegans utilizando el modelo como, la forma de puntuación anomalías morfológicas y de comportamiento que resultan de AS, y cómo adaptar el protocolo de una manera que permite que el experimento que se llevó a cabo con una inversión inicial más baja usando una alternativa cámara construida fácilmente-por encargo .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">N2&#160; strain</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">Wild type strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">TU2583</td>
			<td style="width:453px;">integrated fluorescent transgene used to label touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CB1338 mec-3 (e1338)IV</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">CB1338</td>
			<td style="width:453px;">canonical mec-3 mutant that is touch insensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:208px;">0030 120.086</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Nikon USA</td>
			<td style="width:208px;">TE2000-U</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td style="width:269px;">Sheldon Manufacturing Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Model 2005</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Eyelash Pick</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">An eyelash pick can be prepared by attaching&#160; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hypoxic Chamber</td>
			<td style="width:269px;">Coy</td>
			<td style="width:208px;">8307030</td>
			<td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans

Protocolos para la anoxia / inanición en los organismo modelo genético C. elegans simulan isquemia / reperfusión. Los gusanos están separados de los alimentos bacteriana y se colocan bajo la anoxia durante 20 horas (la isquemia simulada), y posteriormente se trasladaron a una atmósfera normal con la comida (reperfusión simulada). Este experimentales resultados de paradigma en aumento de la muerte y el daño neuronal, y las técnicas se presentan para evaluar la viabilidad organismo, alteraciones en la morfología de los procesos de contacto de neuronas, así como la sensibilidad táctil, que representa la salida del comportamiento de la función neuronal. Por último, se describe un método para la construcción de incubadoras hipóxicas utilizando contenedores de almacenamiento de cocina común. La adición de una unidad de control de flujo de masa permite modificaciones que deban introducirse en la mezcla de gases en las incubadoras de encargo, y un baño de agua circulante permite tanto el control de la temperatura y hace que sea fácil de identificar fugas. Este método ofrece una alternativa de bajo costo para comercialmenteunidades disponibles.

Someter C. elegans a 20 horas de la EA a 26 ° C en una cámara de incubación en laboratorio por encargo como se describe (Sección 3.6.2) resultó en una mortalidad significativa (Figura 1 A) 5. Imágenes fluorescentes subsiguiente del punto lagrimal y se rompe en las buenas prácticas agrarias etiquetados procesos neuronales de los sobrevivientes confirmó la presencia de anomalías morfológicas (Figura 2). Los sobrevivientes también respondieron mal a la luz toque la pared del cuerpo (fig. 1B). Este modelo ha sido utilizado por varios grupos para estudiar como la predisposición genética, la intervención del farmacéutico, y la plasticidad metabólica afecta los resultados dependen tanto 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> Figura 1. C. elegans supervivencia y el tacto respuesta despuésAS. A) Porcentaje de gusanos que se exhiben 24 horas después de la AS supervivencia. La cepa N2 es el fondo genético de tipo salvaje, y KWN85 contiene un transgén integrado que etiqueta neuronas mec con las buenas prácticas agrarias. B) Respuesta al tacto estímulos de C. vivir elegans (N2 Strain) después de AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> Figura 2. Toque modificaciones neuronales después de AS. Neurona Touch anormalidades (PLML y PLMR), tales como los procesos y las pausas (A) o la acumulación de agregados de las buenas prácticas agrarias en los procesos de (B) tortuosos fueron monitoreados en sobreviviente anestesiado C. eleg<html> ans después de AS. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> Figura 3. Selección de pestañas. Una selección de las pestañas montado. En la inserción, un detalle de la pestaña pegada a la madera palillo de dientes. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> Figura 4. Fabricada en el laboratorio cámara hipóxica en el interior del baño de agua. Un recipiente cerrado listo para comenzar el experimento. Las flechas indican la entrada de gas y la salida y el peso de la botella se utiliza para evitar que se flotante. 231fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Detalles de la parte interna y externa de la tapa del recipiente. A) lado externo de la tapa del recipiente, lo que indica el tubo y su conector unido a la previamente hecha agujero. B) lado externo de la tapa del recipiente, lo que indica el conector del tubo colocada en el agujero previamente hecho.

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An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Un protocolo se describe que utiliza la anoxia / inanición en C. elegans para modelar la isquemia / reperfusión. Los resultados funcionales incluyen aumento de la mortalidad, anormalidades visibles en los procesos neuronales GFP-etiquetados, y las respuestas conductuales alterados que requieren la función neuronal.

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

9.8K vistas.  Universidade de São Paulo.  Un protocolo se describe que utiliza la anoxia / inanición en C. elegans para modelar la isquemia / reperfusión. Los resultados funcionales incluyen aumento de la mortalidad, anormalidades visibles en los procesos neuronales GFP-etiquetados, y las respuestas conductuales alterados que requieren la función neuronal. 

Video: An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Investigación

Biología

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...