Ringraziamo i membri del laboratorio di Miller per la discussione e lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un premio nuovo investigatore del Centro Shock Nathan di Eccellenza nella biologia di base di invecchiamento DLM e il National Institutes of award Salute R00 AG030550 di DLM.

1. Costruzione di camere ambientali <ol><li> Selezionare il più piccolo volume ragionevole di camera richiesta per l&#39;ambito del progetto. Sezione deve essere fatta di gas (O 2) materiale impermeabile. Piatti cristallizzazione Pyrex, scatole Anaeropack o grandi cast-acrilici scatole (Ellard Instrumentation), possono essere utilizzati. Abbiamo scoperto che 9 50 piastre mm possono andare bene in un piatto x 100 50 cristallizzazione Kimex. Lastre di vetro possono essere usati come coperchi per piatti di cristallizzazione Pyrex. </li><li> Praticare un foro nella camera selezionata e montare con un maschio di plastica al raccordo Luer Portagomma (Cole Parmer). Raccordi possono essere garantiti da raccordo o con resina epossidica. Installare un raccordo simile sul lato opposto del contenitore per consentire al gas di fluire dentro e fuori della camera. Se possibile, compensare i fori per aumentare la miscelazione turbolenta. </li><li> Ottenere serbatoi di gas compressi con definiti O 2 concentrazioni (bilanciato con N 2) che sono certificati standard per O 2 content o, per condizioni anossiche, puro N 2 (&lt;10 ppm O 2). Utilizzare commutazione automatica regolatori per studi a lungo termine per evitare di compromettere i livelli di ossigeno nelle camere. </li><li> Risposta organica all&#39;ipossia ha dimostrato di essere dipendente dalla temperatura 15. Inserendo la camera in un incubatore, temperature differenti può essere mantenuta. Le temperature all&#39;interno di un incubatore può essere irregolare e come tale, è prudente fare uso di un registratore di dati di temperatura per misurare costantemente la temperatura all&#39;interno della camera. </li></ol> 2. Collegamento del gas per la camera ambientale <ol><li> Per tutte le connessioni, utilizzare un ottavo-pollici esterno-diametro del tubo collegato con dei connettori a scatto o raccordi a compressione. Tubi deve essere impermeabile e non reattivo con O 2, come etilene propilene fluorurato (FEP) o nylon (Cole Parmer). Per uno schema della configurazione completata, vedi Figura 1. </li><li> Collegare il comserbatoi premuto in un dispositivo di controllo del flusso, ad esempio un controllore di flusso di massa (Sierra Instruments) o rotametro (Aalborg). Assicurarsi che la pressione a monte del serbatoio è entro la portata del dispositivo di flusso ed i raccordi a gomito. Due stadi regolatori sono generalmente utilizzati, con la seconda fase impostato la pressione desiderata [Vedere la sezione tre per la selezione del tasso adeguato flusso] </li><li> Idrato il gas da gorgogliare attraverso acqua distillata utilizzando una bottiglia di lavaggio con gas cilindro poroso, poi diretta in uno dei raccordi sulla camera ambientale, lasciando il secondo raccordo aperto per gas di scarico (vedi figura 1). Per studi a breve termine, l&#39;idratazione gas protegge essiccazione piatto, ma il monitoraggio dell&#39;umidità può essere necessario per studi a lungo termine. </li><li> Dow Corning grasso vuoto può essere usato per sigillare la camera. Pesi di luogo sul coperchio della camera di garantire una tenuta ermetica. Per confermare una perfetta tenuta ed un adeguato flusso, tenere una piccola pozza d&#39;acqua nel palmo della yla mano guantata al raccordo sulla camera e verificare la presenza di bolle. </li></ol> 3. Selezione Portata <ol><li> Supponendo perfetta miscelazione, non vi è scambio di gas 90% dell&#39;atmosfera gassosa ogni volta che si sostituisce il volume della camera (legge di Fick). Ad esempio, in una camera 100 cc con una portata di 100 cc / min, l&#39;aria casa originale nella camera sarà sostituito con il 90% del gas desiderato dopo 1 minuto, e si avvicinano asintoticamente cambio completo del 90% ogni minuto successivamente. </li><li> Portate superiori e piccoli contenitori raggiungeranno la concentrazione di ossigeno desiderata più rapidamente. Per 100 x 50 Kimex contenitori (400 cc), una portata di 120 cc / min raggiungerà il 99,9% in 10 minuti scambio (scambi 3). Tale portata è adatto per la maggior parte delle condizioni di ossigeno. A nostra conoscenza non vi è stato uno studio sistematico di come il tasso di variazione della concentrazione di O 2 influenza la risposta in C. elegans. </li></ol><ol><li> Worms esposti a condizioni di ipossia comunemente sfuggire alla superficie delle piastre di agar. Per evitare ciò, posizionare un anello di acido palmitico (10 mg / ml in etanolo) attorno al bordo delle lastre. L&#39;acido palmitico uscirà soluzione evapora etanolo, formando una barriera fisica. Barriere acido palmitico non influiscono tasso di deposizione delle uova, fecondità o la durata della vita in C. elegans 16,17. Burrowing non si verifica più frequentemente in condizioni di ipossia, le misure preventive in modo supplementari non sono generalmente richiesti. </li><li><ol><li> Genera popolazioni sincronizzati da sbiancamento adulti gravide in una piccola goccia di soluzione di candeggina non teste di serie alcalina nematodi crescita dei media (NGM) piastre 18. A differenza dei tradizionali grandi lotti protocolli ipoclorito sbiancanti, raccogliere 1-100 animali in una goccia di soluzione di candeggina sulla superficie di una piastra NGM, quindi consentire la soluzione di candeggina per assorbire nella piastra <sup&gt; 18. Dopo almeno 12 ore, trasferire le larve L1 sincronizzato con piastre seminate con vivo OP50 batteri. In alternativa, si può consentire agli adulti gravide per deporre le uova sulla piastra per 2-3 ore di generare un gruppo di vermi che si svilupperà in modo sincrono o raccogliere le larve L4 da una popolazione mista. </li><li> Evitare di esporre embrioni sbiancato di ipossia, in quanto ciò può ridurre la vitalità 13. Per raccogliere embrioni giovani (2-4 cellule), gli adulti gravide può essere tagliato in un piccolo volume di acqua con una lama di rasoio e gli embrioni si trasferisce a piastre pipettare bocca per una successiva esposizione all&#39;ipossia. </li></ol></li><li> Sigillare le piastre nella camera ambientale. Gli animali di controllo devono essere tenuti in normossia (casa aria) alla stessa temperatura come vermi trattati. Non c&#39;è alcuna differenza osservabile tra i campioni rimasti in casa aria e quelli mantenuti in una camera identica a casa l&#39;aria che scorre su di loro. Avviare il flusso di gas e mantenere l&#39;esposizione per il tempo desiderato. Per garantire l&#39;uniformità in rampa, assicuratevi disostituire l&#39;acqua nella bottiglia del gas di lavaggio prima dell&#39;esposizione. </li><li> Per la sopravvivenza degli embrioni test, permettono di sviluppare i vermi per 48 ore dopo il ritorno in aria ambiente, a quel punto dovrebbero essere quarta fase delle larve / giorno uno adulti. Punteggio per la sopravvivenza, censura i vermi che non possono essere contabilizzate. </li><li> Per visualizzare animali esposti ad ipossia, spostare i vermi ad una goccia di M9 su un 22 mm 2 coprioggetto, e capovolgere su un blocco di agarosio al 2% in M9 18. Se necessario, levamisolo (25 mM) o di sodio azide (10 mM) può essere utilizzato come anestetico. Azide di sodio e levamisolo può confondere alcune osservazioni a causa della tossicità e dovrebbe essere usato con giudizio 19. </li></ol> 5. Harvest rapida di ipossia esposti a Worms (Esempio: Preparazione dei campioni per HIF-1 Analisi occidentale) Molti ipossia effetti indotti sono rapidamente invertito al rientro in aria ambiente, compresa la ripresa della produzione di uova 12, la fosforilazione di epitopi mitotichein embriogenesi 13 e degradazione della proteina HIF-1 9,20. Isolamento rapido degli animali esposti a ipossia è necessario per ottenere effetti riproducibili in queste condizioni. Con questa configurazione, gli animali possono essere raccolti e congelati in azoto liquido in meno di due minuti. Mentre guanto camere ipossia box consentono la manipolazione dei campioni in condizioni anossiche, il loro costo e praticità per condizioni diverse da anossia limitare la loro utilità. <ol><li> Grow Bristol vermi N2 su 4 10 cm ad alta crescita (HG) piastre fino la maggioranza dei vermi adulti sono gravide 18. Lavare vermi ad un tubo 15 ml contenente una soluzione alcalina candeggina 1:5 e incubare con rotazione fino vermi inizia a dissolversi, non più di 5 minuti 9. Lavare i vermi tre volte con M9, riducendo la velocità a 1500 xg tra ogni lavaggio senza frenatura. </li><li> Embrioni piastra sbiancato su 8 150 piastre NGM mm e permettono di sviluppare per le larve L4 (~ 48 ore per Bristol N2 a 22 ° C).Spostare le piastre di camere per prove ambientali e di esporre a ipossia (1.000 ppm, 5000 ppm) e anossiche (N2) le condizioni per 4 ore. I tempi di esposizione variano a seconda del modello sperimentale. Mentre l&#39;esposizione all&#39;ipossia ha un effetto immediato sul tasso di deposizione delle uova, due embrioni di cellule muoiono dopo 16-18 ore di esposizione 12. Con questa configurazione camera di ipossia, il limite inferiore di esposizione è vincolata dal tasso di cambio atmosfera necessaria per raggiungere l&#39;equilibrio. </li><li> Etichettare una provetta da microcentrifuga 1,5 ml e un tubo di 15 ml per ogni campione sperimentale. Worms esposti a ipossia è più probabile che aderisca alle pareti del tubo durante la raccolta. Per evitare questo, posto 100 pl di solfato di sodio 1% dodecil (SDS) in ogni provetta 15 mL conico. Se SDS inibisce applicazioni a valle, albumina di siero bovino (BSA) può essere utilizzato per evitare che si attacchi. L&#39;uso routinario di SDS o BSA non sembra avere una differenza apparente. Aggiungere 50 pl di colorante 2x proteina di carico (4% SDS, 10% 2-mercaptoetanolo etraccia di blu di bromofenolo in 30% glicerolo (w / v)) per il tubo per microcentrifuga 1,5 ml. Avere un Dewar di azoto liquido pronto. </li><li> Ora i passi dopo aver rimosso i vermi da ipossia e record. Togliere il coperchio della camera ipossica, prendere un piatto del campione, e richiudere la camera. Usare acqua distillata per lavare i vermi su un filtro di nylon e poi versare nel tubo di 15 ml. Spin i vermi verso il basso in una centrifuga desktop a 1500 xg per 15-20 secondi con freno. </li><li> Utilizzare un vuoto per rimuovere la maggior parte del surnatante dal tubo, lasciando intatto il verme pellet. </li><li> Usando una pipetta, spostare il verme pellet in 50 microlitri al tubo microcentrifuga 1,5 ml. Sigillare il tubo e immergere in azoto liquido. </li><li> Ripetere fino a quando tutti i campioni sono stati isolati. Seguire queste procedure per la casa di campioni di controllo dell&#39;aria per coerenza. I campioni possono essere conservati a -20 ° C. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Organismal effetti dell&#39;ipossia può essere vistoesaminando la vitalità fino all&#39;età adulta di C. elegans (Figura 2). Gli embrioni di cui da wild-type Bristol (N2) e HIF-1 (IA04) mutanti di delezione sono tutti a sopravvivere in casa aria concentrazioni di O 2 (210.000 ppm O 2). N 2 worm sono in grado di adattarsi e sopravvivere fino all&#39;età adulta in 5000 ppm O 2, mentre HIF-1 embrioni non sono vitali. Ciò dimostra che HIF-1 è essenziale per adattarsi al cambiamento dei livelli di ossigeno disponibile nell&#39;ambiente 10. Né N2 né HIF-1 gli animali possono sopravvivere l&#39;esposizione a 1000 ppm O 2. Visualizzazione verme direttamente in ipossia è possibile con l&#39;uso di un ambito dissezione e contenitore trasparente (Figura 3). Con direttamente ponendo la camera ipossia sulla portata dissezione, non vi è alcuna necessità di rimuovere i vermi da ipossia osservare reazioni organismi. La portata può essere dotato illumation fluorescenza (come in figura 3 </strong&gt;), estendendo ulteriormente i tipi di osservazioni in ipossia che sono possibili. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> Figura 1. Esempio di ipossia camera. Direzione del flusso di gas è indicata dalle frecce. Il gas è stoccato in serbatoi di gas compresso con definite concentrazioni di O 2 (1) e un regolatore di due fasi è collegato (2). Gas entra nella parte inferiore del tubo di flusso (3), esce dalla parte superiore alla portata corretta. Gas quindi fluisce nel pallone bolla (4), idratante il gas (garantire il corretto collegamento del pallone bolla osservando bolle). Idrato gas passa poi nella camera di ipossia alla valvola di afflusso (5), esponendo i campioni a ipossia. Il gas infine aperture nella camera attraverso un foro di scarico praticato nella camera. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> Figura 2. La vitalità degli embrioni esposti a 1000 ppm O 2, 5000 ppm O <sub&gt; 2 e normossia (~ 210.000 ppm O 2). Embrioni sono stati esposti a condizioni ciascuno di ossigeno come embrioni per 24 ore in camere di flusso continuo di ossigeno. Worms sono stati spostati verso condizioni di normossia, ha permesso di sviluppare verso l&#39;età adulta per 48 ore, e poi ha segnato per la vitalità fino all&#39;età adulta. n&gt; 50, N = 5. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> Figura 3. Visualizzazione di C. elegans in ipossia con il microscopio. Worms sono esposti all&#39;ipossia utilizzando i metodi descritti. La camera di trasparenza ambientale (realizzato con un piatto di cristallizzazione e lastra di vetro pyrex) è posizionato direttamente sul palcoscenico di un ambito dissezione. Due punti di vista sono mostrati, uno tra il flusso di gas intero set up, l&#39;altra con solo la camera sul palco microscopio.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questo metodo presenta una strategia per la costruzione di un ambiente ipossico che consente di ambienti con precise concentrazioni di ossigeno per essere mantenute in laboratorio. Queste camere di fornire un metodo semplice per esporre organismi a specifiche concentrazioni basse di O 2 e di controllo delle uscite molecolari e fisiologiche. La camera ambientale descritta è assemblato da laboratorio invece acquistabile e può quindi essere modificata per adattarsi alle esigenze dell&#39;esperimento. <p cl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Tubi (FEP e PTFE) </td><td> Cole Parmer Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;FEP) 06.605-27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE) &#39;R-3603 </td></tr><tr><td> Raccordi a compressione </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> 06.363-58 (M. accoppiatore 1/16 &quot;) 06.363-62 (F. accoppiatore 1/16 &quot;) 06.363-60 (M. accoppiatore 1/8 &quot;) 06.363-61 (F. accoppiatore 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> Tubo di passaggio </td><td> Aalborg </td><td> PMR3-010073 (3 uscite) PMR1-013520 (1 uscita) </td></tr><tr><td> Controllore di flusso di massa </td><td> Sierra Instruments </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) </td></tr><tr><td> Serbatoio di gas compresso </td><td> Airgas </td><td> Su ordinazione &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Plastic Luer maschio per raccordi portagomma </td><td> Cole Parmer </td><td> 45505-41 (serie 500 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> Cast scatole acrilici </td><td> Ellard Strumentazione </td><td> Su ordinazione </td></tr><tr><td> Raccordi (ottone o acciaio inox) </td><td> Seattle Fluid Systems </td><td> B-402-1 (1/4 &quot;dado) B-200-3 (1/8 &quot;raccordo a T) B-400-set (1/4 &quot;boccole) B-QM2-B1-200 (QC Corpo QM) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;maschio conn) </td></tr><tr><td> Dow Corning vuoto Grease </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> AnaeroPack box </td><td> Misubishi Gas Chemical Company </td><td> R684004 (0,4 litri) R685025 (2,5 litri) R685070 (7,0 litri) </td></tr><tr><td> Pyrex gas Bottiglia per il lavaggio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> L&#39;acido palmitico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> Capra anti-topo IgG-perossidasi di rafano </td><td> Southern Biotechnology Associates </td><td> 1032-1005 </td></tr><tr><td> SuperSignal Ovest Pico substrato Chemiluminsecent </td><td> Pierce Chemical </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 piatti in vetro di cristallizzazione </td><td> Kimax Kimble </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on c. elegans

L&#39;ossigeno è essenziale per tutti i metazoi per sopravvivere, con una sola eccezione nota 1. Diminuzione O 2 disponibilità (ipossia) possono sorgere durante gli stati di malattia, sviluppo normale o variazioni delle condizioni ambientali 2-5. Comprendere le vie di segnalazione cellulare che sono coinvolti nella risposta all&#39;ipossia potrebbe fornire una nuova visione strategie terapeutiche per diverse patologie umane, da ictus al cancro. Questo obiettivo è stato impedito, almeno in parte, le difficoltà tecniche connesse con l&#39;esposizione controllata ipossica in organismi modello geneticamente suscettibili. Il nematode Caenorhabditis elegans è ideale come organismo modello per lo studio della risposta ipossica, come è facile alla cultura e manipolare geneticamente. Inoltre, è possibile studiare le risposte cellulari a specifici ipossiche O 2 concentrazioni senza effetti confondenti da C. elegans ottenere O 2 (e altri gas) per diffusione, in contrapposizione ad un sistema respiratorio facilitato 6. Fattori note per essere coinvolte nella risposta ad ipossia sono conservati in C. elegans. La reale risposta al ipossia dipende dalla concentrazione specifica di O 2 che è disponibile. In C. elegans, l&#39;esposizione a moderare l&#39;ipossia provoca una risposta trascrizionale mediata in gran parte da HIF-1, i altamente conservate ipossia-inducibile fattore di trascrizione 6-9. C. elegans. embrioni richiedono HIF-1 per sopravvivere in 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . L&#39;ipossia è un termine generico per &quot;inferiore al normale O 2&quot;. Normossia (normale O 2) può anche essere difficile da definire. In genere consideriamo aria della stanza, che è 210.000 ppm O 2 per essere normossia. Tuttavia, è stato dimostrato che C. elegans ha una preferenza comportamentale per le concentrazioni di O 2 da 5-12% 50,000-120,000 ppm (O 2) 11. In larvae e adulti, HIF-1 agisce per prevenire l&#39;ipossia indotta diapausa in ppm O 5000 2 12. Tuttavia, HIF-1 non gioca un ruolo nella risposta a concentrazioni più basse di O 2 (anossia, definizione operativa &lt;10 ppm O 2) 13. In anossia, C. elegans entra in uno stato reversibile di animazione sospesa, in cui tutte le attività microscopicamente osservabile cessa 10. Il fatto che le diverse risposte fisiologiche si verificano in condizioni diverse evidenzia l&#39;importanza di avere il controllo sperimentale sulla concentrazione di O 2 ipossica. Qui, viene presentato un metodo per la realizzazione e la realizzazione di camere ambientali che producono condizioni di ipossia affidabili e riproducibili con concentrazioni definite di O 2. Il metodo flusso continuo assicura un rapido equilibrio della camera e aumenta la stabilità del sistema. Inoltre, la trasparenza el&#39;accessibilità delle camere permettono la visualizzazione diretta di animali esposti a ipossia. Si illustra, inoltre, un efficace metodo di raccolta C. elegans campioni rapidamente dopo l&#39;esposizione a ipossia, che è necessario osservare molte delle rapidamente invertiti cambiamenti che si verificano in ipossia 10,14. Questo metodo fornisce un fondamento di base che può essere facilmente modificato per esigenze di laboratorio individuali, compresi i sistemi di modelli diversi e una varietà di gas.

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Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Questo paper come utilizzare camere di ipossia a flusso continuo per generare atmosfere con concentrazioni definite di O<sub&gt; 2</sub&gt; Per capire le risposte biologiche a una riduzione dei O<sub&gt; 2</sub&gt;. Questo sistema è facile da installare e mantenere, e sufficientemente flessibile per adattarsi ad una vasta gamma di O<sub&gt; 2</sub&gt; Concentrazioni e sistemi modello

La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell&#39;ipossia sulla<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

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Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

12.0K Views.  University of Washington. Questo paper come utilizzare camere di ipossia a flusso continuo per generare atmosfere con concentrazioni definite di O 2 Per capire le risposte biologiche a una riduzione dei O 2. Questo sistema è facile da installare e mantenere, e sufficientemente flessibile per adattarsi ad una vasta gamma di O 2 Concentrazioni e sistemi modello

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

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Biologia

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissezione e registrazione dal bivio C. Elegans neuromuscolare

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La produzione di C. elegans Transgeni attraverso recombineering con il GalK Marcatori selezionabili

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...