Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la HealthGrants DK85035 y DK074797 (IH).

1. Las cepas de gusano <ol><li> Obtener C. elegans de tipo salvaje cepas Bristol N2 desde el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) y mantenerlos en NGM placas sembradas con E. coli cepa OP50 7. Nota: gusano transgénico cepas IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizados fueron generados a lo descrito previamente 11. IQ6011 puede ser solicitado al autor correspondiente. </li></ol> 2. Preparación de modificación C. elegans Habitation y Reproducción Medio (mCeHR) Preparar medios líquidos mCeHR como se describe a continuación 12. Este medio líquido axénico permite que los gusanos crecen sin fuentes de alimentos adicionales. Llevar a cabo todas las manipulaciones de los medios líquidos axénicos y axénicos gusanos utilizando condiciones estrictamente estériles tales como una campana de flujo laminar. <ol><li> Obtener la leche ultra-pasteurizada descremada en una tienda de comestibles. Utilice el pro refrigeradaconducto y no el producto temperatura ambiente. Antes del uso en mCeHR medio, veta la leche en infusión cerebro corazón (BHI) placas de agar y se incuban durante 3 días a 30 ° C y 37 ° C para comprobar la esterilidad. Transferir la leche a 50 ml tubos estériles y se almacena a -80 ° C </li><li> Preparar cada uno de los siguientes componentes y se combinan en el orden y cantidades dadas para preparar 1 l de mCeHR (Tabla 1A): 10 ml de 2 mM de colina, citrato diácido 10 ml de vitamina y mezcla del factor de crecimiento (véase la receta en la Tabla 1B), 10 ml de 2,4 mM de myo-inositol, 10 ml de cloruro de hemina 2 mM, 250 ml de agua desionizada. Aplicar y filtro de succión a través de una unidad de filtro de 0,22 micras. </li><li> Añadir 20 ml de la mezcla de ácido nucleico (receta en la Tabla 1C), 100 ml de mezcla de minerales (receta en la Tabla 1D), 20 ml de 170 mg / ml de hidrolizado de lactoalbúmina, 20 ml de aminoácidos esenciales, 10 ml de aminoácidos no esenciales ácidos, 20 ml de 450 mM KH 2 PO 4,50 ml de 1,45 M de D-glucosa, 10 ml de 1 M de HEPES, sal de sodio, 250 ml de agua desionizada. </li><li> Aplicar el vacío para filtrar esterilizar los componentes. Quite el filtro y añadir 1 ml de 5 mg / ml de colesterol. Asegúrese de que el pH de los medios de comunicación es de aproximadamente 6-6,5. Nota: Esta solución puede ser almacenada a -80 ° C durante hasta un año. </li><li> Añadir 20% (v / v) de ultra pasteurizada leche descremada orgánica al medio de mCeHR antes de su uso. Utilice una técnica escrupulosamente estéril (por ejemplo en una campana de flujo laminar) al abrir y alícuotas de la leche. Almacene el papel a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparar C. elegans para la Cultura en axénico mCeHR Liquid Media <ol><li> Crecer gusanos en diez de 60 mm NGM placas hasta que no haya muchos gusanos grávidas y una cantidad mínima de OP50 E. coli en las placas. </li><li> Eliminar los gusanos de cada placa por lavado con 5 ml de tampón M9 (receta en la Tabla 1F), y combinar en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Permitir a los gusanos a settle dejando el tubo en reposo durante 5 a 10 minutos y luego retirar con cuidado el sobrenadante que contiene la E. coli. </li><li> Repita los pasos 3.2 y 3.3 2x para eliminar la mayor cantidad de las bacterias residuales como sea posible antes de continuar el procedimiento. </li><li> Resuspender los gusanos en 0,1 N de NaCl en un volumen que es un múltiplo de tres, por ejemplo en el que los gusanos individuales pueden verse 1,5 ml, 3 ml o 6 ml en el tubo. </li><li> Lejía los gusanos mediante la adición de NaOH 5 N y 5% de hipoclorito de sodio solución (lejía) en una relación de 01:02:06 a la suspensión gusano. Por ejemplo, 1 ml de NaOH 5 N: 2 ml de 5% de hipoclorito de sodio: 6 ml de la suspensión gusano. Mezclar el NaOH y lejía antes de añadir a la suspensión gusano. </li><li> Vortex la solución vigorosamente hasta que los gusanos grávidas se disuelven y sólo los huevos son visibles dentro de la suspensión (aproximadamente 5 a 10 minutos). Supervisar el proceso utilizando un microscopio de contraste de fases con un objetivo de 10X. </li><li> Después de que los gusanos se han disuelto completamente, pellets de inmediato lahuevos a 800 xg durante 45 segundos a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con 10 ml de agua estéril centrifugando el pellet a 800 xg durante 45 segundos a 4 ° C. </li><li> Después del blanqueo, transferir el sedimento de huevo a un matraz de cultivo de tejido de 25 cm 2 que contiene 10 ml de medio mCeHR suplementadas con 100 g / ml de tetraciclina. Estas operaciones se realizarán utilizando técnicas estériles. Si lo desea, agregue los antibióticos adicionales, incluyendo 250 ácido nalidíxico mg / ml, para prevenir el crecimiento bacteriano en los cultivos líquidos axénicos. </li><li> Incubar los cultivos líquidos a 20 ° C en una incubadora de agitación a aproximadamente 70 rpm. </li><li> Compruebe los gusanos todos los días para observar el grado de desarrollo y la tasa de crecimiento. Nota: Worms inicialmente crecen lentamente y requieren de 7 a 10 días en estar grávido. Sin embargo, como los gusanos aclimatan al medio líquido el tiempo de generación se reducirá a aproximadamente 4 días de tipo salvaje (N2) gusanos. </li><li> Después de que los gusanos tienen devellado a la etapa grávido en medios líquidos, transferir la cultura gusano a un tubo cónico y sedimentar los gusanos a 800 xg durante 5 min a 4 ° C usando un rotor de cubeta oscilante. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento suavemente gusano en un volumen igual de 0,1 M de NaCl. Por ejemplo, utilizar 10 ml de NaCl 0,1 M para los gusanos cultivadas en 10 ml de mCeHR. Permita que los gusanos se asienten durante 5 minutos en hielo. </li><li> Llevar a cabo el procedimiento de blanqueamiento como se describió anteriormente en los pasos 3.5 a 3.8, y permitir que los gusanos crezcan para una segunda generación en los medios líquidos axénicos. Si es necesario, añadir el antibiótico de nuevo para inhibir el crecimiento bacteriano. </li><li> Una vez más permiten a los gusanos a continuación, se convierten en grávido sedimentar y resuspender los gusanos en NaCl 0,1 M como se describe en los pasos 3,12 y 3,13, a continuación, blanquear de nuevo como se describe en los pasos 3.5 a 3.8, para producir una población sincronizada. Crecer a los gusanos de larva L1 en medios líquidos sin antibióticos a partir de ahora. </li></ol> 4. Sincronización de Worms de líquidoCultura <ol><li> Pellets y resuspender los gusanos en NaCl 0,1 M como se describe anteriormente en las etapas 3.12 y 3.13. Bleach como se describe anteriormente en las etapas 3.5 a 3.8. </li><li> Resuspender el precipitado huevo en 10 ml de tampón M9 y permitir que las larvas eclosionan O / N a 20 ° C en un agitador de plataforma giratoria. Nota: Los huevos eclosionan en larvas L1, pero no van a desarrollar aún más, la sincronización de los gusanos en la fase L1. </li><li> Mantener y gusanos subcultura, pellet L1 larvas a 800 xg durante 5 min, y luego volver a suspender las larvas en 10 ml de mCeHR y la transferencia a un matraz de 25 cm 2. Permita que los gusanos crecer a 20 ° C en una plataforma giratoria. Mantener una densidad máxima de 3.000 gusanos / ml / cm 2 para asegurar una nutrición adecuada para los gusanos. Nota: En esta etapa, los antibióticos no son necesarios para mantener las condiciones axénicas cuando los procedimientos se llevaron a cabo utilizando técnicas estériles en una campana de flujo laminar. Worms se inspeccionarán diariamente para controlar el crecimiento. </li></ol> 5. Gratuitozing y descongelación Worms para cultivos axénicos mediano <ol><li> Congele culturas gusano asíncronos axénicos o larvas L1 sincronizada en nitrógeno líquido. Gusanos de pellets a 800 xg durante 5 min y después se resuspenden en tampón de S (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, NaCl 146,25 mM) utilizando 0,5 ml para cada vial. Añadir un volumen igual de tampón de S con 30% v / v de glicerol a cada vial y transferir los gusanos a -80 ° C antes del almacenamiento a largo plazo en N2 líquido. Congele aproximadamente 1 x 10 6 gusanos por ml en cada vial. </li><li> Descongele gusanos incubando los viales a 37 º C durante aproximadamente 2 minutos hasta que casi todo el hielo se derrita. En una campana de flujo laminar, la transferencia de los gusanos a un frasco estéril que contiene mCeHR y colocarlos a 20 ° C. </li></ol> 6. Determinar el efecto de Hemin La concentración en el crecimiento y la reproducción mCeHR <ol><li> Utilice los medios mCeHR axénicos para ensayar crecimiento dependiente de nutrientes de C. elegans. Para determinar el efecto Oconcentración hemina f en el crecimiento y el desarrollo del gusano, utilice sincronizado gusanos N2 axénicos u otras cepas de interés. Sincronizar larvas L1 como se describió anteriormente en la sección 4. </li><li> Al día siguiente, pellet y contar las larvas L1 sincronizada y diluir a 1 lombriz al l de medios axénicos. Hacer cloruro de hemina 10 mM en 0,3 M de NH 4 OH y ajustar el pH a 8 usando HCl concentrado. </li><li> Añadir 800 l de los medios de comunicación mCeHR a una placa de 24 pocillos. Añadir 100 gusanos a cada pocillo en 100 l de medios de comunicación. Añadir cloruro de hemina a cada pocillo en concentraciones que van desde 0 M, 1,5 M a 1,000 M en triplicado. Asegúrese de que todos los pozos contienen la misma concentración de 0,3 M NH 4 OH. Resuspendió suavemente los gusanos antes de pipetear para asegurar que 100 larvas L1 se añaden a cada pocillo. </li><li> Examine los gusanos diario y anote el crecimiento de cada concentración en cada pocillo. Cuente el número de gusanos después de 9 días de incubación y trazar el número de gusanos / ml correspondientes a cada grupo hemoconcentración (Figura 1). </li></ol> 7. Efecto de la Concentración La hemina en hemo gusanos de sensores <ol><li> Incubar gusanos sensor heme L1 sincronizados (Phrg-1 :: GFP) en mCeHR contienen 4 M, 8 M, 10 M y 20 M hemina. </li><li> Imagen de los gusanos mediante microscopía confocal de fluorescencia, 48 h después de la incubación (Figura 2). </li></ol> 8. Utilizando mCeHR para generar transgénico C. elegans Uso de bombardeo de micropartículas Nota: El procedimiento para la generación y ejecución de bombardeo con micropartículas utilizando gusanos crecen en mCeHR UNC-119 (ed3) se indica en la figura 3 13. <ol><li> Preparación Worm <ol><li> Transferir aproximadamente 1 x 10 6 UNC-119 (ed3) gusanos asíncronos en 90 ml de medio mCeHR en un 175 cm 2 frasco de una semana antes de los bombardeos. Permita que los gusanos crecer a 20 ° C ona plataforma de agitación a ~ 70 rpm (Figura 3-1). Nota: Una semana más tarde, la densidad gusano debe ser significativamente mayor con muchos gusanos adultos grávidas. Se requerirán aproximadamente 3 x 10 7 gusanos de bombardeo con micropartículas. </li><li> Chill JM109 E. coli sembró 10 cm NGM placas de hielo. </li><li> Transfiera los gusanos axénicos de dos tubos de 50 ml cónicos y centrifugar los gusanos a 800 xg durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender los gusanos en cada tubo en 50 ml de tampón M9 (Figura 3-2). </li><li> Permita que los gusanos adultos para sedimentar por gravedad durante 10 a 15 min en hielo. Nota: El pellet 2 ml debe contener ahora&gt; 90% gusanos adultos. Este pellet 2 ml debe tener aproximadamente 5 x 10 6 gusanos y es suficiente para un bombardeo de micropartículas. </li><li> Escudo toda la superficie de la placa refrigerada JM109 sembró NGM con el sedimento de 2 ml de gusanos. Deje que el líquido se absorba completamente a continuación, dejar la placadurante 30 min en hielo antes de proceder (Figura 3-3). </li></ol></li><li> Preparación de partículas de oro <ol><li> Pesar 30 mg de partículas de oro en un tubo de microcentrífuga siliconado. Añadir 1 ml de 70% de etanol y agitar el tubo durante 5 min. </li><li> Deje que el tubo repose durante 15 min y centrifugar a 6000 xg durante 10 segundos para que sedimenten las partículas de oro. Eliminar el sobrenadante usando una punta de pipeta tocando cuidadosamente la punta al lado del tubo opuesta a las partículas de oro. </li><li> Se lavan las partículas de oro con 1 ml de agua estéril, de vórtice durante 1 min y centrifugar brevemente el tubo a 6000 xg durante 10 seg. Repetir la etapa de lavado dos veces, a continuación, volver a suspender las partículas de oro en 0,5 ml de 50% de glicerol estéril. Nota: La concentración final de las partículas de oro será de 60 mg / ml y se puede almacenar durante 1 a 2 meses a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar la mezcla de partículas de ADN-oro <ol><li> Combinar 10 g del ADN del plásmido deseado con 10 y# 956; g del plásmido de rescate unc-119 en un tubo de silicona de 1.5 ml. Añadir 50 l de agua DI y 100 l de solución de partículas de oro bien resuspendido a continuación vórtice durante 1 min. </li><li> Añadir 150 l de CaCl2 2,5 M y agitar de nuevo la solución durante 1 min. A esta solución, añadir 60 l de espermidina 0,1 M y agitar durante 3 a 5 min. </li><li> Pulso centrifugar la solución a 6.000 xg durante 10 segundos, retire el sobrenadante y añadir 300 l de etanol al 70%. Así Vortex durante 1 min, centrifugar pulso a 6.000 xg, eliminar el sobrenadante y resuspender en 170 l de etanol al 100%. Vigorosamente agite la solución durante 5 a 10 min y después se pulso de centrífuga y separar el sobrenadante. </li></ol></li><li> Bombardeo (Figura 3-3) Nota: Este protocolo se realiza con el sistema de suministro de partícula especificado en la Tabla de Materiales / Equipos. Siga las instrucciones para el instrumento de administración de partículas disponible. <ol> &lt;li&gt; Coloque una hoja de papel de seda en una placa de 15 cm. Usando las pinzas, sumerja siete macrotransportadores individualmente en etanol al 100% y las ponen sobre el tejido se seque. </li><li> Limpiar a fondo la cámara biolistic, titular macroportador y placa objetivo con etanol al 70%. Limpie y esterilice en autoclave las pantallas de parada antes de cada procedimiento de bombardeo. </li><li> Cargue los macrocarrriers en el soporte utilizando pinzas y pulse en el soporte con la función de estar. </li><li> Esparza de forma uniforme 20 l de las partículas de oro recubiertas de ADN en el centro de cada macroportador y luego dejar que la solución se seque por completo. </li><li> Limpiar las dos partes del divisor de presión con etanol y montar con discos de ruptura de etanol limpiado. Atornille el divisor de presión montado y discos de ruptura en la cámara de bombardeo. </li><li> Montar una pantalla de detención en autoclave con el titular macroportador y colocar el aparato en el estante de metal requerida y de bloqueo en su lugar. </li><li> Inserte la macr ensambladoocarrier aparato en la cámara de biolística en la ranura asignada por debajo del divisor de presión y alinearse con el divisor de presión. </li><li> Pegue la placa de NGM abierto con los gusanos en el estante de placa de puntería y cierre la puerta de la cámara. </li><li> Para bombardear gusanos, ajustar la presión a la que se necesita para romper los discos de ruptura. Encienda el vacío a 28 pulgadas de Hg de presión, a continuación, pulse el botón de disparo hasta que los discos de ruptura. </li><li> Cortar el vacío y retire la placa de NGM del aparato. Lavar los gusanos de la placa y redistribuir en veinte placas de 10 cm NGM sembradas con E. JM109 coli (Figura 3-4). </li><li> Permita que los gusanos crezcan durante 10 a 14 días a 25 ° C y se mueren de hambre los platos. Worms rescatadas del defecto unc-119 tendrán un movimiento normal y pueden ser identificados en este momento. Elija al menos 10 gusanos &quot;de tipo salvaje&quot; de platos separados para su posterior análisis ya que representan las líneas transgénicas independientes (Figure 3-5). </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no hay que compiten intereses financieros o de conflicto de intereses.

En este protocolo se presenta un mCeHR modificado axénico medios líquidos que permite un rápido C. generación elegans con la producción de un gran número de gusanos. Este medio presenta diversas ventajas como los gusanos se cultivan sin contaminar E. coli o subproductos bacterianos y pueden ser explotados en los estudios nutricionales y toxicológicos. El uso de E. coli u otras bacterias en estos estudios tiene varios inconvenientes. Por ejemplo, el crecimiento de las bacterias ...

El nematodo del suelo, el Caenorhabditis elegans, un organismo modelo de gran alcance usada en numerosos estudios de la genética a la toxicología. Como resultado de su tamaño de 1 mm, tiempo de generación rápida de cuatro días facilidad de cultivo, y un gran número de progenie, estos nematodos se han utilizado en un número de genéticos y farmacológicos pantallas 1, 2. Los investigadores se aprovechan de este gusano para identificar moléculas y vías conservadas en sistemas de vertebrados. Estas vías incluyen señales de muerte celular, vías de envejecimiento y el metabolismo, y el sistema nervioso 3-6. Además, la transparencia de C. elegans permite la generación de líneas transgénicas utilizando los reporteros de proteínas fluorescentes, que se pueden visualizar directamente para analizar los patrones de expresión de genes y localización de la proteína. En muchos estudios de este nematodo se cultiva en una superficie a base de agar sólido utilizando un medio de crecimiento de nematodos (NGM) placas o en lculturas iquid sembraron con Escherichia coli como una fuente de alimento 7,8. Estas fuentes alimenticias bacterianas pueden confundir a los estudios bioquímicos y toxicológicos con la interferencia de subproductos bacterianos que afectan a la interpretación de los resultados. Con el fin de evitar estos efectos combinados, C. elegans pueden ser cultivadas en un axénicos medios líquidos que está desprovisto de bacterias como una fuente de alimento. El uso de este medio de comunicación, cultivadas con éxito a millones de gusanos altamente sincronizados para muchos estándar C. protocolos elegans, incluyendo el análisis de microarrays de genes regulados diferencialmente en C. elegans expuesto a diferentes concentraciones de hemo, y la producción de gusanos transgénicos utilizando bombardeo de genes. Este medio se define y se modifica a partir de una receta original formulado por el Dr. Eric Clegg 9 químicamente. El uso de este medio de comunicación mCeHR, hemos logrado identificar genes implicados en la homeostasis del heme, referido a los genes como hemo sensibles (hrg s) 10, lo que haríano habría sido posible en condiciones de crecimiento normales que utilizan placas de agar NGM sembradas con E. coli. En este protocolo se describe el procedimiento para la introducción y el mantenimiento de C. elegans cultivadas en E. coli para la axénicos mCeHR y utilizar este método para obtener un gran número de gusanos para la producción de transgénicos C. líneas elegans utilizando bombardeo con micropartículas. Nosotros también presentan estudios que muestran la utilidad de usar medios axénicos para determinar las necesidades nutricionales de C. elegans usando hemo como un ejemplo. Estos estudios muestran que el uso de los medios de comunicación mCeHR permite para el crecimiento rápido de un gran número de C. elegans para muchas aplicaciones posteriores utilizados por los investigadores del gusano.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">M-2393</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">S-4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium citrate.H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CuCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C455-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MnCl2.4H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">M87-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">Z-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C70-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5 -phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanosine 2 - and3&#160; -monophosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">U-6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymine&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T0376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">N-Acetylglucosamine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>A3286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-Alanine</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td>S25648&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">p-Aminobenzoic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B-4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cyanocobalamine (B-12)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">V-2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Folinate (Ca)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-0761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacinamide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantetheine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantothenate (Ca)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td>
			<td style="width:108px;">ACRCS</td>
			<td style="width:121px;">21663-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxal 5&#39;-phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-3657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxamine.2HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">Riboflavin 5-PO4(Na)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">R-7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Thiamine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-6,8-Thioctic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Choline di-acid citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">myo-Inositol</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-7520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">L-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Heart Infusion</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">211065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Hemin chloride</td>
			<td style="width:108px;">Frontier Scientific</td>
			<td style="width:121px;">H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">HEPES, Na salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:108px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:121px;">F676-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11140-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalidixic acid sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>N4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td style="width:108px;">MP Biomedicals</td>
			<td>2194542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biolistic Delivery System</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>165-2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Gold particles (Au Powder)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">&#160;Ferro Electronic Material Systems</td>
			<td style="width:121px;">6420 2504, JZP01010KM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">or</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gold Particles 1.0 &#956;m</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>&#160;165-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

En este protocolo, se presentan los materiales necesarios y el procedimiento para las C modificado. Correos Legans habituación y reproducción de medios (mCeHR). Además, los pasos para exponer y aclimatación C. elegans cultivadas en E. coli para axénicos medios líquidos se describen. Finalmente, los experimentos posteriores que utilizan axénicos C. elegans ilustran los beneficios de este procedimiento. La capacidad de analizar y determinar C. requerimiento de nutrientes elegans fue ilustrado por la creciente N2 gusanos de tipo salvaje en medios líquidos axénicos con concentraciones variables hemo. Este procedimiento puede ser replicado con otros nutrientes para determinar la concentración óptima para el crecimiento y el desarrollo gusano o, para determinar los efectos toxicológicos de los tratamientos farmacológicos. Los efectos de las concentraciones de hemo variadas en el crecimiento de los gusanos de tipo salvaje se determinaron a través de la observación microscópica cualitativa y cuantificando tl número de gusanos que crecieron en cada concentración de hemo. Además, el efecto de las concentraciones de nutrientes variadas puede ensayarse mediante la utilización de gusanos que expresan sensores fluorescentes que responden a los cambios en el nutriente de interés. Además, un gran número de gusanos fueron producidos fácilmente para la generación de transgénicos C. elegans utilizando bombardeo con micropartículas.

El cultivo de C. elegans en axénicos ayudas medio líquido en la determinación de los nutrientes que son requeridos por los gusanos, sin la interferencia de los metabolitos secundarios producidos por E. coli. Gusanos Wildtype N2 aclimatarse a los medios mCeHR plazo de tres generaciones y muestran un crecimiento similar a los gusanos que crecen en placas bacterianas NGM. De hecho, estos gusanos se convierten en hembras grávidas dentro de 4 días, en comparación con 3,5 días para los gusanos crecen ...

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Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans usualmente se cultivan en placas de agar sólido o en cultivos líquidos sembradas con E. coli. Para evitar subproductos bacterianos de confusión estudios toxicológicos y nutricionales, se utilizó un medio líquido axénicos, CEHR, para crecer y sincronizar un gran número de gusanos para una gama de aplicaciones posteriores.

El cultivo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; En axénico Liquid Media y Creación de transgénicos Worms por bombardeo de micropartículas

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

16.9K vistas.  University of Maryland.  C. elegans usualmente se cultivan en placas de agar sólido o en cultivos líquidos sembradas con E. coli. Para evitar subproductos bacterianos de confusión estudios toxicológicos y nutricionales, se utilizó un medio líquido axénicos, CEHR, para crecer y sincronizar un gran número de gusanos para una gama de aplicaciones posteriores. 

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Investigación

Biología

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Un rastreable<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Nucleótido y extracciones de proteínas de Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

El cultivo

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