Name: culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la HealthGrants DK85035 y DK074797 (IH).

1. Las cepas de gusano <ol><li> Obtener C. elegans de tipo salvaje cepas Bristol N2 desde el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) y mantenerlos en NGM placas sembradas con E. coli cepa OP50 7. Nota: gusano transgénico cepas IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizados fueron generados a lo descrito previamente 11. IQ6011 puede ser solicitado al autor correspondiente. </li></ol> 2. Preparación de modificación C. elegans Habitation y Reproducción Medio (mCeHR) Preparar medios líquidos mCeHR como se describe a continuación 12. Este medio líquido axénico permite que los gusanos crecen sin fuentes de alimentos adicionales. Llevar a cabo todas las manipulaciones de los medios líquidos axénicos y axénicos gusanos utilizando condiciones estrictamente estériles tales como una campana de flujo laminar. <ol><li> Obtener la leche ultra-pasteurizada descremada en una tienda de comestibles. Utilice el pro refrigeradaconducto y no el producto temperatura ambiente. Antes del uso en mCeHR medio, veta la leche en infusión cerebro corazón (BHI) placas de agar y se incuban durante 3 días a 30 ° C y 37 ° C para comprobar la esterilidad. Transferir la leche a 50 ml tubos estériles y se almacena a -80 ° C </li><li> Preparar cada uno de los siguientes componentes y se combinan en el orden y cantidades dadas para preparar 1 l de mCeHR (Tabla 1A): 10 ml de 2 mM de colina, citrato diácido 10 ml de vitamina y mezcla del factor de crecimiento (véase la receta en la Tabla 1B), 10 ml de 2,4 mM de myo-inositol, 10 ml de cloruro de hemina 2 mM, 250 ml de agua desionizada. Aplicar y filtro de succión a través de una unidad de filtro de 0,22 micras. </li><li> Añadir 20 ml de la mezcla de ácido nucleico (receta en la Tabla 1C), 100 ml de mezcla de minerales (receta en la Tabla 1D), 20 ml de 170 mg / ml de hidrolizado de lactoalbúmina, 20 ml de aminoácidos esenciales, 10 ml de aminoácidos no esenciales ácidos, 20 ml de 450 mM KH 2 PO 4,50 ml de 1,45 M de D-glucosa, 10 ml de 1 M de HEPES, sal de sodio, 250 ml de agua desionizada. </li><li> Aplicar el vacío para filtrar esterilizar los componentes. Quite el filtro y añadir 1 ml de 5 mg / ml de colesterol. Asegúrese de que el pH de los medios de comunicación es de aproximadamente 6-6,5. Nota: Esta solución puede ser almacenada a -80 ° C durante hasta un año. </li><li> Añadir 20% (v / v) de ultra pasteurizada leche descremada orgánica al medio de mCeHR antes de su uso. Utilice una técnica escrupulosamente estéril (por ejemplo en una campana de flujo laminar) al abrir y alícuotas de la leche. Almacene el papel a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparar C. elegans para la Cultura en axénico mCeHR Liquid Media <ol><li> Crecer gusanos en diez de 60 mm NGM placas hasta que no haya muchos gusanos grávidas y una cantidad mínima de OP50 E. coli en las placas. </li><li> Eliminar los gusanos de cada placa por lavado con 5 ml de tampón M9 (receta en la Tabla 1F), y combinar en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Permitir a los gusanos a settle dejando el tubo en reposo durante 5 a 10 minutos y luego retirar con cuidado el sobrenadante que contiene la E. coli. </li><li> Repita los pasos 3.2 y 3.3 2x para eliminar la mayor cantidad de las bacterias residuales como sea posible antes de continuar el procedimiento. </li><li> Resuspender los gusanos en 0,1 N de NaCl en un volumen que es un múltiplo de tres, por ejemplo en el que los gusanos individuales pueden verse 1,5 ml, 3 ml o 6 ml en el tubo. </li><li> Lejía los gusanos mediante la adición de NaOH 5 N y 5% de hipoclorito de sodio solución (lejía) en una relación de 01:02:06 a la suspensión gusano. Por ejemplo, 1 ml de NaOH 5 N: 2 ml de 5% de hipoclorito de sodio: 6 ml de la suspensión gusano. Mezclar el NaOH y lejía antes de añadir a la suspensión gusano. </li><li> Vortex la solución vigorosamente hasta que los gusanos grávidas se disuelven y sólo los huevos son visibles dentro de la suspensión (aproximadamente 5 a 10 minutos). Supervisar el proceso utilizando un microscopio de contraste de fases con un objetivo de 10X. </li><li> Después de que los gusanos se han disuelto completamente, pellets de inmediato lahuevos a 800 xg durante 45 segundos a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con 10 ml de agua estéril centrifugando el pellet a 800 xg durante 45 segundos a 4 ° C. </li><li> Después del blanqueo, transferir el sedimento de huevo a un matraz de cultivo de tejido de 25 cm 2 que contiene 10 ml de medio mCeHR suplementadas con 100 g / ml de tetraciclina. Estas operaciones se realizarán utilizando técnicas estériles. Si lo desea, agregue los antibióticos adicionales, incluyendo 250 ácido nalidíxico mg / ml, para prevenir el crecimiento bacteriano en los cultivos líquidos axénicos. </li><li> Incubar los cultivos líquidos a 20 ° C en una incubadora de agitación a aproximadamente 70 rpm. </li><li> Compruebe los gusanos todos los días para observar el grado de desarrollo y la tasa de crecimiento. Nota: Worms inicialmente crecen lentamente y requieren de 7 a 10 días en estar grávido. Sin embargo, como los gusanos aclimatan al medio líquido el tiempo de generación se reducirá a aproximadamente 4 días de tipo salvaje (N2) gusanos. </li><li> Después de que los gusanos tienen devellado a la etapa grávido en medios líquidos, transferir la cultura gusano a un tubo cónico y sedimentar los gusanos a 800 xg durante 5 min a 4 ° C usando un rotor de cubeta oscilante. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento suavemente gusano en un volumen igual de 0,1 M de NaCl. Por ejemplo, utilizar 10 ml de NaCl 0,1 M para los gusanos cultivadas en 10 ml de mCeHR. Permita que los gusanos se asienten durante 5 minutos en hielo. </li><li> Llevar a cabo el procedimiento de blanqueamiento como se describió anteriormente en los pasos 3.5 a 3.8, y permitir que los gusanos crezcan para una segunda generación en los medios líquidos axénicos. Si es necesario, añadir el antibiótico de nuevo para inhibir el crecimiento bacteriano. </li><li> Una vez más permiten a los gusanos a continuación, se convierten en grávido sedimentar y resuspender los gusanos en NaCl 0,1 M como se describe en los pasos 3,12 y 3,13, a continuación, blanquear de nuevo como se describe en los pasos 3.5 a 3.8, para producir una población sincronizada. Crecer a los gusanos de larva L1 en medios líquidos sin antibióticos a partir de ahora. </li></ol> 4. Sincronización de Worms de líquidoCultura <ol><li> Pellets y resuspender los gusanos en NaCl 0,1 M como se describe anteriormente en las etapas 3.12 y 3.13. Bleach como se describe anteriormente en las etapas 3.5 a 3.8. </li><li> Resuspender el precipitado huevo en 10 ml de tampón M9 y permitir que las larvas eclosionan O / N a 20 ° C en un agitador de plataforma giratoria. Nota: Los huevos eclosionan en larvas L1, pero no van a desarrollar aún más, la sincronización de los gusanos en la fase L1. </li><li> Mantener y gusanos subcultura, pellet L1 larvas a 800 xg durante 5 min, y luego volver a suspender las larvas en 10 ml de mCeHR y la transferencia a un matraz de 25 cm 2. Permita que los gusanos crecer a 20 ° C en una plataforma giratoria. Mantener una densidad máxima de 3.000 gusanos / ml / cm 2 para asegurar una nutrición adecuada para los gusanos. Nota: En esta etapa, los antibióticos no son necesarios para mantener las condiciones axénicas cuando los procedimientos se llevaron a cabo utilizando técnicas estériles en una campana de flujo laminar. Worms se inspeccionarán diariamente para controlar el crecimiento. </li></ol> 5. Gratuitozing y descongelación Worms para cultivos axénicos mediano <ol><li> Congele culturas gusano asíncronos axénicos o larvas L1 sincronizada en nitrógeno líquido. Gusanos de pellets a 800 xg durante 5 min y después se resuspenden en tampón de S (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, NaCl 146,25 mM) utilizando 0,5 ml para cada vial. Añadir un volumen igual de tampón de S con 30% v / v de glicerol a cada vial y transferir los gusanos a -80 ° C antes del almacenamiento a largo plazo en N2 líquido. Congele aproximadamente 1 x 10 6 gusanos por ml en cada vial. </li><li> Descongele gusanos incubando los viales a 37 º C durante aproximadamente 2 minutos hasta que casi todo el hielo se derrita. En una campana de flujo laminar, la transferencia de los gusanos a un frasco estéril que contiene mCeHR y colocarlos a 20 ° C. </li></ol> 6. Determinar el efecto de Hemin La concentración en el crecimiento y la reproducción mCeHR <ol><li> Utilice los medios mCeHR axénicos para ensayar crecimiento dependiente de nutrientes de C. elegans. Para determinar el efecto Oconcentración hemina f en el crecimiento y el desarrollo del gusano, utilice sincronizado gusanos N2 axénicos u otras cepas de interés. Sincronizar larvas L1 como se describió anteriormente en la sección 4. </li><li> Al día siguiente, pellet y contar las larvas L1 sincronizada y diluir a 1 lombriz al l de medios axénicos. Hacer cloruro de hemina 10 mM en 0,3 M de NH 4 OH y ajustar el pH a 8 usando HCl concentrado. </li><li> Añadir 800 l de los medios de comunicación mCeHR a una placa de 24 pocillos. Añadir 100 gusanos a cada pocillo en 100 l de medios de comunicación. Añadir cloruro de hemina a cada pocillo en concentraciones que van desde 0 M, 1,5 M a 1,000 M en triplicado. Asegúrese de que todos los pozos contienen la misma concentración de 0,3 M NH 4 OH. Resuspendió suavemente los gusanos antes de pipetear para asegurar que 100 larvas L1 se añaden a cada pocillo. </li><li> Examine los gusanos diario y anote el crecimiento de cada concentración en cada pocillo. Cuente el número de gusanos después de 9 días de incubación y trazar el número de gusanos / ml correspondientes a cada grupo hemoconcentración (Figura 1). </li></ol> 7. Efecto de la Concentración La hemina en hemo gusanos de sensores <ol><li> Incubar gusanos sensor heme L1 sincronizados (Phrg-1 :: GFP) en mCeHR contienen 4 M, 8 M, 10 M y 20 M hemina. </li><li> Imagen de los gusanos mediante microscopía confocal de fluorescencia, 48 h después de la incubación (Figura 2). </li></ol> 8. Utilizando mCeHR para generar transgénico C. elegans Uso de bombardeo de micropartículas Nota: El procedimiento para la generación y ejecución de bombardeo con micropartículas utilizando gusanos crecen en mCeHR UNC-119 (ed3) se indica en la figura 3 13. <ol><li> Preparación Worm <ol><li> Transferir aproximadamente 1 x 10 6 UNC-119 (ed3) gusanos asíncronos en 90 ml de medio mCeHR en un 175 cm 2 frasco de una semana antes de los bombardeos. Permita que los gusanos crecer a 20 ° C ona plataforma de agitación a ~ 70 rpm (Figura 3-1). Nota: Una semana más tarde, la densidad gusano debe ser significativamente mayor con muchos gusanos adultos grávidas. Se requerirán aproximadamente 3 x 10 7 gusanos de bombardeo con micropartículas. </li><li> Chill JM109 E. coli sembró 10 cm NGM placas de hielo. </li><li> Transfiera los gusanos axénicos de dos tubos de 50 ml cónicos y centrifugar los gusanos a 800 xg durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender los gusanos en cada tubo en 50 ml de tampón M9 (Figura 3-2). </li><li> Permita que los gusanos adultos para sedimentar por gravedad durante 10 a 15 min en hielo. Nota: El pellet 2 ml debe contener ahora&gt; 90% gusanos adultos. Este pellet 2 ml debe tener aproximadamente 5 x 10 6 gusanos y es suficiente para un bombardeo de micropartículas. </li><li> Escudo toda la superficie de la placa refrigerada JM109 sembró NGM con el sedimento de 2 ml de gusanos. Deje que el líquido se absorba completamente a continuación, dejar la placadurante 30 min en hielo antes de proceder (Figura 3-3). </li></ol></li><li> Preparación de partículas de oro <ol><li> Pesar 30 mg de partículas de oro en un tubo de microcentrífuga siliconado. Añadir 1 ml de 70% de etanol y agitar el tubo durante 5 min. </li><li> Deje que el tubo repose durante 15 min y centrifugar a 6000 xg durante 10 segundos para que sedimenten las partículas de oro. Eliminar el sobrenadante usando una punta de pipeta tocando cuidadosamente la punta al lado del tubo opuesta a las partículas de oro. </li><li> Se lavan las partículas de oro con 1 ml de agua estéril, de vórtice durante 1 min y centrifugar brevemente el tubo a 6000 xg durante 10 seg. Repetir la etapa de lavado dos veces, a continuación, volver a suspender las partículas de oro en 0,5 ml de 50% de glicerol estéril. Nota: La concentración final de las partículas de oro será de 60 mg / ml y se puede almacenar durante 1 a 2 meses a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar la mezcla de partículas de ADN-oro <ol><li> Combinar 10 g del ADN del plásmido deseado con 10 y# 956; g del plásmido de rescate unc-119 en un tubo de silicona de 1.5 ml. Añadir 50 l de agua DI y 100 l de solución de partículas de oro bien resuspendido a continuación vórtice durante 1 min. </li><li> Añadir 150 l de CaCl2 2,5 M y agitar de nuevo la solución durante 1 min. A esta solución, añadir 60 l de espermidina 0,1 M y agitar durante 3 a 5 min. </li><li> Pulso centrifugar la solución a 6.000 xg durante 10 segundos, retire el sobrenadante y añadir 300 l de etanol al 70%. Así Vortex durante 1 min, centrifugar pulso a 6.000 xg, eliminar el sobrenadante y resuspender en 170 l de etanol al 100%. Vigorosamente agite la solución durante 5 a 10 min y después se pulso de centrífuga y separar el sobrenadante. </li></ol></li><li> Bombardeo (Figura 3-3) Nota: Este protocolo se realiza con el sistema de suministro de partícula especificado en la Tabla de Materiales / Equipos. Siga las instrucciones para el instrumento de administración de partículas disponible. <ol> &lt;li&gt; Coloque una hoja de papel de seda en una placa de 15 cm. Usando las pinzas, sumerja siete macrotransportadores individualmente en etanol al 100% y las ponen sobre el tejido se seque. </li><li> Limpiar a fondo la cámara biolistic, titular macroportador y placa objetivo con etanol al 70%. Limpie y esterilice en autoclave las pantallas de parada antes de cada procedimiento de bombardeo. </li><li> Cargue los macrocarrriers en el soporte utilizando pinzas y pulse en el soporte con la función de estar. </li><li> Esparza de forma uniforme 20 l de las partículas de oro recubiertas de ADN en el centro de cada macroportador y luego dejar que la solución se seque por completo. </li><li> Limpiar las dos partes del divisor de presión con etanol y montar con discos de ruptura de etanol limpiado. Atornille el divisor de presión montado y discos de ruptura en la cámara de bombardeo. </li><li> Montar una pantalla de detención en autoclave con el titular macroportador y colocar el aparato en el estante de metal requerida y de bloqueo en su lugar. </li><li> Inserte la macr ensambladoocarrier aparato en la cámara de biolística en la ranura asignada por debajo del divisor de presión y alinearse con el divisor de presión. </li><li> Pegue la placa de NGM abierto con los gusanos en el estante de placa de puntería y cierre la puerta de la cámara. </li><li> Para bombardear gusanos, ajustar la presión a la que se necesita para romper los discos de ruptura. Encienda el vacío a 28 pulgadas de Hg de presión, a continuación, pulse el botón de disparo hasta que los discos de ruptura. </li><li> Cortar el vacío y retire la placa de NGM del aparato. Lavar los gusanos de la placa y redistribuir en veinte placas de 10 cm NGM sembradas con E. JM109 coli (Figura 3-4). </li><li> Permita que los gusanos crezcan durante 10 a 14 días a 25 ° C y se mueren de hambre los platos. Worms rescatadas del defecto unc-119 tendrán un movimiento normal y pueden ser identificados en este momento. Elija al menos 10 gusanos &quot;de tipo salvaje&quot; de platos separados para su posterior análisis ya que representan las líneas transgénicas independientes (Figure 3-5). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Nass, R., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dopaminergic+system:+opportunities+for+insights+into+dopamine+transport+and+neurodegeneration.">The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).</li><li>Lapierre, L. R., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+C+elegans+signaling+pathways+for+longevity.">Lessons from C elegans signaling pathways for longevity.</a> Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).</li><li>Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+aging+insights+from+long-lived+mutants.">The plasticity of aging insights from long-lived mutants.</a> Cell. 120, 449-460 (2005).</li><li>Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+determination+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).</li><li>Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+for+Factors+Involved+in+Neuronal+Specification+in+Caenorhabditis+elegans.">A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C+elegans+WormBook+the+online+review+of+C.">Maintenance of C elegans WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-11 (2006).</li><li>Win, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validated+Liquid+Culture+Monitoring+System+for+Lifespan+Extension+of+Caenorhabditis+elegans+through+Genetic+and+Dietary+Manipulations.">Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations.</a> Aging and disease. 4, 178-185 (2013).</li><li>Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CeHR+Axenic+Medium+for+Exposure+and+Gene+Expression+Studies.">Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies.</a> East Coast Worm Meeting. , (2002).</li><li>Severance, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+novel+genes+essential+for+heme+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).</li><li>Rajagopal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haem+homeostasis+is+regulated+by+the+conserved+and+concerted+functions+of+HRG-1+proteins.">Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins.</a> Nature. 453, 1127-1131 (2008).</li><li>Nass, R., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+Unit+1+9.">Chapter 1 Unit 1 9.</a> The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).</li><li>Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+gene+transformation+by+microparticle+bombardment+WormBook+the+online+review+of+C.">elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-10 (2013).</li><li>Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+heme+synthesis+in+a+free-living+eukaryote.">Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).</li><li>Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+medium+and+Caenorhabditis+elegans.">Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans.</a> BMC biotechnology. 3, 19 (2003).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction.</a> The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>White, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRG1+is+essential+for+heme+transport+from+the+phagolysosome+of+macrophages+during+erythrophagocytosis.">HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis.</a> Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).</li><li>Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intercellular+heme-trafficking+protein+delivers+maternal+heme+to+the+embryo+during+development+in+C+elegans.">An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans.</a> Cell. 145, 720-731 (2011).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation.">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40 (2004).</li><li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection.">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li></ol>

Los autores declaran que no hay que compiten intereses financieros o de conflicto de intereses.

En este protocolo se presenta un mCeHR modificado axénico medios líquidos que permite un rápido C. generación elegans con la producción de un gran número de gusanos. Este medio presenta diversas ventajas como los gusanos se cultivan sin contaminar E. coli o subproductos bacterianos y pueden ser explotados en los estudios nutricionales y toxicológicos. El uso de E. coli u otras bacterias en estos estudios tiene varios inconvenientes. Por ejemplo, el crecimiento de las bacterias ...

El nematodo del suelo, el Caenorhabditis elegans, un organismo modelo de gran alcance usada en numerosos estudios de la genética a la toxicología. Como resultado de su tamaño de 1 mm, tiempo de generación rápida de cuatro días facilidad de cultivo, y un gran número de progenie, estos nematodos se han utilizado en un número de genéticos y farmacológicos pantallas 1, 2. Los investigadores se aprovechan de este gusano para identificar moléculas y vías conservadas en sistemas de vertebrados. Estas vías incluyen señales de muerte celular, vías de envejecimiento y el metabolismo, y el sistema nervioso 3-6. Además, la transparencia de C. elegans permite la generación de líneas transgénicas utilizando los reporteros de proteínas fluorescentes, que se pueden visualizar directamente para analizar los patrones de expresión de genes y localización de la proteína. En muchos estudios de este nematodo se cultiva en una superficie a base de agar sólido utilizando un medio de crecimiento de nematodos (NGM) placas o en lculturas iquid sembraron con Escherichia coli como una fuente de alimento 7,8. Estas fuentes alimenticias bacterianas pueden confundir a los estudios bioquímicos y toxicológicos con la interferencia de subproductos bacterianos que afectan a la interpretación de los resultados. Con el fin de evitar estos efectos combinados, C. elegans pueden ser cultivadas en un axénicos medios líquidos que está desprovisto de bacterias como una fuente de alimento. El uso de este medio de comunicación, cultivadas con éxito a millones de gusanos altamente sincronizados para muchos estándar C. protocolos elegans, incluyendo el análisis de microarrays de genes regulados diferencialmente en C. elegans expuesto a diferentes concentraciones de hemo, y la producción de gusanos transgénicos utilizando bombardeo de genes. Este medio se define y se modifica a partir de una receta original formulado por el Dr. Eric Clegg 9 químicamente. El uso de este medio de comunicación mCeHR, hemos logrado identificar genes implicados en la homeostasis del heme, referido a los genes como hemo sensibles (hrg s) 10, lo que haríano habría sido posible en condiciones de crecimiento normales que utilizan placas de agar NGM sembradas con E. coli. En este protocolo se describe el procedimiento para la introducción y el mantenimiento de C. elegans cultivadas en E. coli para la axénicos mCeHR y utilizar este método para obtener un gran número de gusanos para la producción de transgénicos C. líneas elegans utilizando bombardeo con micropartículas. Nosotros también presentan estudios que muestran la utilidad de usar medios axénicos para determinar las necesidades nutricionales de C. elegans usando hemo como un ejemplo. Estos estudios muestran que el uso de los medios de comunicación mCeHR permite para el crecimiento rápido de un gran número de C. elegans para muchas aplicaciones posteriores utilizados por los investigadores del gusano.

<table><tbody><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>Potassium citrate monohydrate</td><td>Sigma</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td><td>Sigma</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5 -phosphate</td><td>Sigma</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 2&#039; - and 3&#039; -monophosphate</td><td>Sigma</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td><td>Sigma</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>Thymine</td><td>Sigma</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylglucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-Alanine</td><td>Fisher</td><td>S25648&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic Acid</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>Cyanocobalamine (B-12)</td><td>Sigma</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>Folinate (Ca)</td><td>Sigma</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>Niacin</td><td>Sigma</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamide</td><td>Sigma</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>Pantetheine</td><td>Sigma</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate (Ca)</td><td>Sigma</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal 5&#039;-phosphate</td><td>Sigma</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxamine 2HCl</td><td>Sigma</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine HCl</td><td>Sigma</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine HCl</td><td>Sigma</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-Thioctic Acid</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Choline di-acid citrate</td><td>Sigma</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td><td>Sigma</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>Hemin chloride</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixic acid sodium salt</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic Delivery System</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gold particles (Au Powder)&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>or</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gold Particles 1.0 &amp;mu;m</td><td>BioRad</td><td>&amp;nbsp;165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

En este protocolo, se presentan los materiales necesarios y el procedimiento para las C modificado. Correos Legans habituación y reproducción de medios (mCeHR). Además, los pasos para exponer y aclimatación C. elegans cultivadas en E. coli para axénicos medios líquidos se describen. Finalmente, los experimentos posteriores que utilizan axénicos C. elegans ilustran los beneficios de este procedimiento. La capacidad de analizar y determinar C. requerimiento de nutrientes elegans fue ilustrado por la creciente N2 gusanos de tipo salvaje en medios líquidos axénicos con concentraciones variables hemo. Este procedimiento puede ser replicado con otros nutrientes para determinar la concentración óptima para el crecimiento y el desarrollo gusano o, para determinar los efectos toxicológicos de los tratamientos farmacológicos. Los efectos de las concentraciones de hemo variadas en el crecimiento de los gusanos de tipo salvaje se determinaron a través de la observación microscópica cualitativa y cuantificando tl número de gusanos que crecieron en cada concentración de hemo. Además, el efecto de las concentraciones de nutrientes variadas puede ensayarse mediante la utilización de gusanos que expresan sensores fluorescentes que responden a los cambios en el nutriente de interés. Además, un gran número de gusanos fueron producidos fácilmente para la generación de transgénicos C. elegans utilizando bombardeo con micropartículas.

El cultivo de C. elegans en axénicos ayudas medio líquido en la determinación de los nutrientes que son requeridos por los gusanos, sin la interferencia de los metabolitos secundarios producidos por E. coli. Gusanos Wildtype N2 aclimatarse a los medios mCeHR plazo de tres generaciones y muestran un crecimiento similar a los gusanos que crecen en placas bacterianas NGM. De hecho, estos gusanos se convierten en hembras grávidas dentro de 4 días, en comparación con 3,5 días para los gusanos crecen ...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment at JoVE.com

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans usualmente se cultivan en placas de agar sólido o en cultivos líquidos sembradas con E. coli. Para evitar subproductos bacterianos de confusión estudios toxicológicos y nutricionales, se utilizó un medio líquido axénicos, CEHR, para crecer y sincronizar un gran número de gusanos para una gama de aplicaciones posteriores.

El cultivo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; En axénico Liquid Media y Creación de transgénicos Worms por bombardeo de micropartículas

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

16.9K vistas.  University of Maryland.  C. elegans usualmente se cultivan en placas de agar sólido o en cultivos líquidos sembradas con E. coli. Para evitar subproductos bacterianos de confusión estudios toxicológicos y nutricionales, se utilizó un medio líquido axénicos, CEHR, para crecer y sincronizar un gran número de gusanos para una gama de aplicaciones posteriores. 

Video: Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Investigación

Genética

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biología

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Biología del Desarrollo

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Neurociencias

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Cultivo y manipulación genética de nematodos entomopatógenos

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Inmunología e Infección

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Cultivo a largo plazo de Caenorhabditis elegans individuales en medios sólidos para la monitorización longitudinal de fluorescencia e intervenciones aversivas

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, rapid reproduction cycle (~3 days), short lifespan (~3 weeks), and numerous available tools for genetic manipulation and molecular analysis. The most common approach for conducting aging studies in C. elegans, including survival analysis, involves culturing populations of tens to hundreds of animals together on solid nematode growth media (NGM) in Petri plates. While this approach gathers data on a population of animals, most protocols do not track individual animals over time. Presented here is an optimized protocol for the long-term culturing of individual animals on microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) devices called WorMotels. Each device allows up to 240 animals to be cultured in small wells containing NGM, with each well isolated by a copper sulfate-containing moat that prevents the animals from fleeing. Building on the original WorMotel description, this paper provides a detailed protocol for molding, preparing, and populating each device, with descriptions of common technical complications and advice for troubleshooting. Within this protocol are techniques for the consistent loading of small-volume NGM, the consistent drying of both the NGM and bacterial food, options for delivering pharmacological interventions, instructions for and practical limitations to reusing PDMS devices, and tips for minimizing desiccation, even in low-humidity environments. This technique allows the longitudinal monitoring of various physiological parameters, including stimulated activity, unstimulated activity, body size, movement geometry, healthspan, and survival, in an environment similar to the standard technique for group culture on solid media in Petri plates. This method is compatible with high-throughput data collection when used in conjunction with automated microscopy and analysis software. Finally, the limitations of this technique are discussed, as well as a comparison of this approach to a recently developed method that uses microtrays to culture isolated nematodes on solid media.

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Presented here is an optimized protocol for culturing isolated individual nematodes on solid media in microfabricated multi-well devices. This approach allows individual animals to be monitored throughout their lives for a variety of phenotypes related to aging and health, including activity, body size and shape, movement geometry, and survival.

Cultivo a largo plazo y monitorización de Caenorhabditis elegans aislada en medios sólidos en dispositivos multipocillos

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

C. elegans Maintenance

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and even physical phenomena. In order to use C. elegans to its full potential, proper care and attention to the basic maintenance of this powerful organism is essential.
In this video you will learn the basic housing and feeding requirements of C. elegans, how to correctly handle and manipulate worms using a worm pick and how to freeze and recover important worm stocks. Towards the end of the video we will visit a few applications of modifying the housing, feeding and manipulation of these important animals.

Maintenance of Caenorhabditis elegans

Mantenimiento de C. elegans

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and ...

El cultivo

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video