El objetivo de esta investigación es profundizar en la comprensión del papel de la vasculatura pancreática tanto en la biología pancreática normal como en el desarrollo de la enfermedad. Al enriquecer con éxito la fracción endotelial, buscamos identificar vías específicas dentro de la vasculatura que gobiernan las funciones pancreáticas, que potencialmente pueden dirigirse para restaurar y mejorar las funciones pancreáticas en entornos de enfermedades. Recientemente, se ha puesto cada vez más énfasis en el papel de la disfunción de las células endoteliales en las patologías pancreáticas.
La identificación de la heterogeneidad de las poblaciones de células endoteliales en el páncreas ha permitido comprender cómo las interacciones endoteliales del páncreas luchan o protegen contra las enfermedades. Los enfoques ómicos, como la secuenciación de ARN de una sola célula o de un solo núcleo, la proteómica y la genómica, se están utilizando para estudiar el páncreas a nivel celular. Para obtener información a nivel espacial o de tejidos, se están implementando nuevas plataformas que utilizan enfoques imparciales y basados en sondas, como Visium y Xenium.
En este protocolo, describimos una técnica de disociación suave que minimiza las enzimas pancreáticas endógenas para disminuir la viabilidad celular y un procedimiento de clasificación celular magnética para enriquecer selectivamente las células endoteliales. La estrategia de disociación y enriquecimiento de nuestro protocolo permitirá una mayor comprensión tanto de los marcadores de superficie celular como del transcriptoma de las células endoteliales pancreáticas que anteriormente estaba poco explorado debido a limitaciones técnicas. Para comenzar, coloque el ratón sacrificado en la mesa de operaciones.
Estira las extremidades del ratón y asegúralas con alfileres. Con unas tijeras quirúrgicas, haga una pequeña incisión en la línea media a través de la piel y el peritoneo desde la zona abdominal inferior y extiéndala hacia la región torácica. Corta a través del diafragma y levanta la caja torácica para exponer el corazón.
Inserte una aguja de calibre 25 a 30 conectada a una jeringa que contenga PBS estéril helado en el ventrículo izquierdo del corazón. Perfunde el corazón a una velocidad de cinco a 10 mililitros por minuto y detente después de inyectar 10 mililitros. Luego, con tijeras de disección y fórceps, extraiga el páncreas con cuidado.
Transfiera el páncreas a un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS helado, junto con el inhibidor de tripsina y coloque el tubo en hielo. Para empezar, obtenga el páncreas murino en una placa de Petri que contenga PBS helado. Con tijeras quirúrgicas y pinzas, retire con cuidado el exceso de tejido.
Transfiera el páncreas recortado a un tubo de cinco mililitros que contenga un mililitro de solución de disociación. Con unas tijeras de disección, pica los tejidos pancreáticos en trozos finos, manteniendo el tubo en hielo. Transfiera el lisado a un tubo de 50 mililitros colocado sobre hielo.
Agregue dos mililitros de solución de colagenasa al tubo de cinco mililitros para eliminar cualquier tejido pancreático residual y transfiéralo al tubo de 50 mililitros. Incubar el tubo en un baño de agua templado a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Coloque el tubo con homogeneizado de tejido sobre hielo y deje que se asiente por gravedad.
A continuación, pase el sobrenadante a través de un filtro de 70 micrómetros y añada cinco mililitros de solución de parada de disociación. Con una aguja de calibre 27, triture el pellet restante con un mililitro adicional de solución de disociación y páselo por el filtro como antes. Girar la suspensión celular a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y volver a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lavado.
Incube una vez 10 a la potencia de siete células con un microlitro de anticuerpo anti-CD31 biotina en un rotador. Añade 20 microlitros de MicroBeads anti-biotina e incuba durante 40 minutos más. A continuación, coloque un soporte magnético con el soporte del separador de columnas y aplique la columna.
Después de equilibrar la columna, agregue la muestra y lave con un total de nueve mililitros de tampón de lavado. Retire la columna del soporte y colóquela en un tubo de 15 mililitros. Agregue cinco mililitros de tampón de lavado a la columna.
Con un émbolo, empuje hacia abajo las células de la columna para recoger la elución que contiene las células endoteliales. Finalmente, gire hacia abajo las fracciones de flujo y elución. Después de volver a suspender, cuente las células y mida la viabilidad.
El análisis cuantitativo de PCR para validar el enriquecimiento de las células endoteliales mostró que las fracciones enriquecidas tenían niveles significativamente más altos de genes marcadores, Pecam1 y Kdr, en comparación con las muestras de flujo. Se observó un nivel más bajo de NK6 homeobox 1, un factor de transcripción en las células endocrinas pancreáticas, en las fracciones enriquecidas. La Western blot mostró fuertes señales de CD31 en el tamaño esperado, confirmando aún más el enriquecimiento de células endoteliales en las fracciones.
