Este trabajo fue apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes (HHMI), Premio de la Innovación Colaborativa. LAM fue apoyada por la Señalización Celular y el Reglamento del Instituto Nacional de Salud la formación de subvención (T32 GM008759) y el NIH Ruth L. Kirschstein Pre-Doctoral Fellow (CA165349-01). Nos gustaría dar las gracias al profesor Michael Stowell (CU Boulder), Rees Prof. Douglas y el Prof. Rob Phillips (Caltech) por sus valiosos comentarios.

1. Preparación de liposomas <ol><li> Recuperar un vial de 20 ml de vidrio con una tapa de teflon. </li><li> Limpiar todo el material de vidrio y jeringas con cloroformo antes de su uso para evitar la contaminación. </li><li> Transferir 100 l de cloroformo grado reactivo en el vial de vidrio utilizando un 250 l hermético jeringa de vidrio. </li><li> Añadir 30 l de metanol de grado reactivo en el vial de vidrio utilizando un mismo 100 l hermético jeringa de vidrio. </li><li> Para preparar un 2 mM 7:1.5:1.5 fosfatidilcolina (POPC): fosfatidiletanolamina (PAPA): solución de lípidos colesterol, transferir 216 l de 10 mg / ml POPC, 42 l de 10 l mg / ml PAPA y 20 de 11 mg / ml Las soluciones de colesterol en CHCl 3 al vial de vidrio de 20 ml. </li><li> Se evaporan los disolventes orgánicos utilizando flujo lento de argón o gas nitrógeno hasta una fina película de lípidos se observa en la parte inferior del vial. </li><li> Coloque el vial de vidrio sin capuchón en un desecador de vacío durante al menos 30 minutos para eliminar el disolvente residual. </li><li> Transfer 2 ml de tampón, previamente pasados ​​por un filtro de 0,2 micras, a la ampolla de cristal para hidratar los lípidos. </li><li> Incubar la mezcla a 4 ° C durante la noche y utilizar dentro de las 48 horas. </li></ol> 2. Congelación-descongelación y: en los tamaños de liposomas de 30 - 100 nm Sólo <ol><li> Congelar suspensión de liposomas en nitrógeno líquido durante 15 segundos. </li><li> Descongele suspensión de liposomas utilizando un bloque de calentamiento a 42 ° C de temperatura durante aproximadamente 3 minutos. </li><li> Repetir los pasos 2.1 y 2,2 para un total de 5 ciclos. </li></ol> 3. Extrusión Siga las instrucciones para ensamblar Avestin correctamente la Liposofast LF-50 extrusora, utilizando el esquema de instrumentos en su libro guía. <ol><li> Colocar la pantalla agujero apoyo grande (con agujeros circulares) en la base de soporte del filtro, seguido por el plato circular sinterizado (sin agujeros), un disco de drenaje (25 mm de diámetro), y una membrana de policarbonato (25 mm de diámetro). </li><li> Coloque el negro pequeño,Junta tórica en la parte superior de la membrana para fijarla a la base de soporte del filtro. </li><li> Coloque la extrusora filtro superior apretando los 4 tornillos en los 4 agujeros correspondientes. </li><li> Montar la unidad de filtro a la extrusora debajo del tambor del extrusor grande. Añadir la solución de liposomas a la camisa del cilindro. Coloque el siguiente en la parte superior del cilindro de extrusión en orden: circular grande junta tórica, la tapa estrecho, circular grande junta tórica, la tapa circular. </li><li> Conecte el regulador de gas en la parte superior barril de la extrusora y cerrar todas las válvulas para evitar fugas de aire, incluyendo la válvula de alivio de presión. Colocar un vial de vidrio de 20 ml o 50 ml Erlenmeyer debajo de la unidad extrusora filtro. Una válvula de seguridad está conectado al regulador y liberará si la presión excede 600 psi. Encienda el gas nitrógeno y abrir la válvula de gas conectado a la extrusora. </li><li> Aumentar la presión de nitrógeno a 25 psi para 400 nm liposomas, 125 psi de 100 nm, liposomas y 400-500 psi de 30 nm liposomas. </li><li> Vea el liposoma suspna pensión como se expulsa en el recipiente mientras siendo empujado por el nitrógeno. Mantener la corriente de nitrógeno hasta que ya no observar cualquier líquido que pasa a través del filtro extrusora en el vial de vidrio. </li></ol> 4. La dispersión de luz dinámica (DLS) Análisis <ol><li> Preparar 50 l de una solución 20 mM de liposomas. </li><li> Encienda la fuente de alimentación y la fuente de la lámpara. </li><li> Abra el software DynaPro. </li><li> Configure el software para el modelo de algoritmo de MS / X para detectar los liposomas de 30 nm y 100 nm y MS800 modelo algoritmo para detectar&gt; 100 nm liposomas. </li><li> Conectar con el hardware. </li><li> Pipetear 14 ml de muestra de liposomas en la cubeta de cuarzo y de inserción en el soporte de la célula. </li><li> Presione comenzar. </li><li> Pulse para después de ~ 20 - 30 adquisiciones. </li><li> Analizar los picos promedio de liposomas de diámetro grabados en el histograma. </li></ol> 5. Nanopartículas de análisis de seguimiento (NTA) <ol><li> Preparar una l 500, 0,1 mM de liposomassolución. </li><li> Lavar el compartimento de la muestra con agua y etanol. </li><li> Seque el compartimiento de la muestra con una toalla de papel sin pelusa. </li><li> Encienda la fuente de potencia del láser y la computadora. </li><li> Entregar 300 L de solución 0,1 mM de liposomas para el compartimiento de la muestra. </li><li> Abra el control de la temperatura y el software de seguimiento de las nanopartículas de análisis. </li><li> Pulse Capturar para activar el láser. </li><li> Utilice los ajustes horizontales y verticales para mover el escenario y ajustar el enfoque del microscopio. </li><li> Ajuste la temperatura deseada (20 ° C) y tiempo de grabación (por lo menos 30 segundos). </li><li> Pulse el botón de grabación para tomar múltiples marcos de foto de las partículas de liposomas para una cantidad especificada de tiempo. Analizar los picos correspondientes a los tamaños de diámetro de los liposomas en el histograma como se rastrea el movimiento de cada partícula. </li></ol> 6. Los resultados representativos Un esquema de esbozar el método de extrusión es presentido en la Figura 1. Para obtener resultados óptimos, la preparación de liposomas con diámetros de 30 nm requiere una alta presión de ~ 500 psi y diámetros de 100 nm requiere una presión de 125 psi para lograr una tasa de filtro rápido. Para diámetros de 400 nm, una baja presión de ~ 25 psi se recomienda para lograr una velocidad más lenta de filtro, que permite que las vesículas para alargar y formar grandes, liposomas homogéneos. Hemos llevado a cabo una serie de experimentos para determinar la presión óptima para la producción consistentes tamaños sub-micrón vesícula. Se varió la presión, así como el número de extrusión pasa a través de filtros de policarbonato con poros de tamaños de 30, 100 y 400 nm y descubrió presión adecuada para cada tamaño deseado. Durante 30 nm poros, la presión por debajo de 500 psi se reducirá la velocidad de flujo, provocando alargamiento y por lo tanto los tamaños más grandes vesículas. Por los poros de 100 nm, un flujo constante se alcanzó a 125 psi. Por 400 nm poros, de baja presión (25 psi) permite las vesículas para alargar s en la vesícula más grandeiza. Un lento goteo de filtración de flujo es el óptimo para crear mayor sub-micrón vesículas 13. Se realizó DLS para determinar los tamaños de liposomas extruídos a través de tres tamaños diferentes diámetros, es decir, 30, 100 y 400 nm. DLS es un método establecido que recoge la luz dispersada para determinar el diámetro de las partículas. Nosotros, los liposomas extruidos hidratadas de 2 mM a través de una membrana de policarbonato 30 nm a 500 psi con 5 pasadas a través del poro del filtro; un 100 nm membrana de policarbonato a 125 psi con 5 pasadas a través del poro del filtro y una membrana de policarbonato de 400 nm a 25 psi con 2 pasa a través del poro del filtro. Los diámetros de los liposomas y medidos por DLS para 30, 100 y 400 nm tamaños de poro fueron de 66 ± 28, 138 ± 18 y 360 ± 25 nm (Figura 2). Una suspensión de 50 perlas de poliestireno nm fue utilizado como un estándar de calibración como se muestra en la Figura 2, donde se registró un diámetro de 47 ± 16 nm. El polydispe cientoUnive muestra que no hay superposición dentro de los tamaños de los liposomas. Es típico observar diámetros superiores a 30 nm mediante el análisis de DLS, debido a la tendencia conocida de este instrumento tiene en relación con las partículas más grandes 12. Intensidades de luz de dispersión de partículas grandes y pequeñas se recogen de forma simultánea desde un método de detección y por lo tanto más difíciles de resolver liposomas en suspensión 12. A pesar de esta limitación instrumental, la curva de calibración se describe una correlación lineal cerca. NTA es una nueva tecnología que mide el tamaño de cada partícula de la observación directa de la difusión en un medio líquido, independiente del índice de refracción de partículas o densidad. Esta técnica de alta resolución se puede utilizar como complemento a la medición de liposomas con DLS. La NTA registraron diámetros de 95 ± 48 y 356 nm ± 51 nm, dos 100 y 400 nm soluciones de poliestireno se utiliza para la calibración. Las soluciones de lípidos de 30 nm y 100 nm se observa que tienen un borrador más<html> diámetro de cultivo en relación con el DLS como se muestra en la Figura 3, produciendo tamaños promedio de 29 ± 14, 95 ± 17 y 359 ± 73 nm. La NTA puede ser una técnica de caracterización más general para cuantificar las partículas microscópicas desde su sensibilidad le permite medir las partículas de 50 a 1000 nm. La curva de calibración muestra una correlación lineal entre los poros de la membrana de policarbonato frente a la registrada diámetro de NTA. <table border="1"><tbody><tr><td> Tamaños de liposomas </td><td> Umbral de detección </td><td> Mínima esperada Tamaño de partícula (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Parámetros NanoSight. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Diagrama de flujo del método de extrusión, que describe cómo la presión y el flujo de nitrógeno controla la homogeneidad de diferentes diámetros de liposomas. Después de la hidratación de liposomas, vesículas unilaminares de diferentes tamaños son extruidos a través de diferentes policarbonato poros del filtro de membrana a diferentes presiones. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Figura 2. Dinámica de dispersión de luz (DLS) los datos que describen las dimensiones cuantitativas de liposomas después de la extrusión. (A) Los gráficos de barras se muestran para describir los diámetros de las tres muestras de liposomas. Un patrón de calibración de 50 nm de poliestireno (PS) las perlas se utilizó como una referencia. Los diámetros medios de liposomas se indican por encima de la barra para cada muestra. El eje X se describen los tamaños de poro de que las soluciones se extruye a través. El eje y describe el diámetro grabada por DLS. Aunque los 30 nm y 100 nm de registro tamañosed valores superiores a sus tamaños de poros, mientras que el mayor tamaño de 400 nm registró un tamaño ligeramente menor, la curva de calibración (b) muestra una correlación casi lineal, donde el eje x expresa los tamaños de poro de membrana de policarbonato, y el eje y describe el registró diámetro de los liposomas a través de DLS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Figura 3. Nanopartículas Análisis de seguimiento (NTA) los datos que describen el tamaño de los liposomas después de la extrusión. (A) Los gráficos de barras que representa el diámetro de cada muestra de liposomas. El eje X se describen los tamaños de poro de que las soluciones se extruye a través. El eje y describe el diámetro de tamaño registrada por la NTA. Los diámetros medios de liposomas son etiquetados por encima de cada muestra. (B) La curva de calibración NTA muestra una correlación más lineal de la curva de calibración DLS entre los tamaños de poro del filtro de membrana versus el diámetro grabado. El eje X se describen los tamaños de poro de membrana de policarbonato. El eje y describe el diámetro grabada liposoma por NTA. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Figura 4. Tinción negativa de transmisión de microscopía electrónica (TEM) imágenes que muestran cada tamaño de liposomas (500 mM), seguido por extrusión. Carbono Formvar rejillas de malla se descargaron negativamente antes de la tinción de la muestra, donde 1% de acetato de uranilo en agua se utiliza para teñir las muestras antes del secado y de imagen con un aumento de x 34.000. Tamaños 30, 100 y 400 nm son claramente distintos entre sí. El aumento se estableció a 25.000 aumentos. La barra de escala representa 0,5 micras. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Figura 5. Un experimento tiempo-curso se llevó a cabo con tres tamaños de liposomas. Dispersión de luz dinámica (DLS) se midió para cada solución de liposomas siguiendo inmediatamente la extrusión. Todas las soluciones de liposomas se almacenaron en 4 °C durante la noche. Sus diámetros fueron registrados por el DLS después de una incubación durante la noche. Poco o ningún cambio se observó después de un período de incubación de 16 horas.

<ol>
	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca(2+)-regulated+fusion.">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li><li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size.">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li><li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+polymorphism:+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases.">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li><li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes.">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li><li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems.">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li><li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting.">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li><li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li><li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Usando el Avestin Liposofast LF-50 Extrusora, hemos demostrado cómo de pequeño tamaño, los liposomas sintéticos se preparan a través de un sistema controlado por presión. Es importante señalar que las vesículas multilamelares se forman espontáneamente después de la hidratación de liposomas, que puede conducir a la producción de pequeñas nanopartículas. Estas vesículas multilamelares pequeñas inevitablemente fluirá a través del mayor tamaño de poro de membrana de policarbonato, causando la heterogeneid...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> Estabilizadores 95% </td></tr><tr><td> El metanol de alto grado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 Extrusora </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Los fosfolípidos </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Los poros de policarbonato </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td> 25 mm de diámetro </td></tr><tr><td> Escurrir los discos PE </td><td> Avestin, Inc. </td><td> 230600 </td><td> 25 mm de diámetro </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Los liposomas son vesículas preparadas artificialmente que consisten en fosfolípidos naturales y sintéticas que se utilizan ampliamente como una membrana celular imitando plataforma para estudiar proteína-proteína y lípidos interacciones proteína-3, la entrega del monitor fármaco 4,5, y la encapsulación 4. Los fosfolípidos naturalmente crear bicapas lipídicas curvadas, distinguiéndose de una micela. 6 Los liposomas son tradicionalmente clasificados por tamaño y número de bicapas, es decir, vesículas unilaminares grandes (LUVs), las pequeñas vesículas unilaminares (SUVs) y vesículas multilamelares (MLV) 7. En particular, la preparación de liposomas homogéneos de diversos tamaños es importante para el estudio de curvatura membrana que juega un papel vital en la señalización celular, endo y exocitosis, la fusión de membranas, y el tráfico de proteínas 8. Varios grupos de analizar cómo las proteínas se utilizan para modular los procesos que involucran a la curvatura de la membrana y por lo tanto preparar liposomas de diámetro &lt;100 - 400nm a estudiar su comportamiento en 3 funciones celulares. Otros se centran en la encapsulación en liposomas de drogas, el estudio de los liposomas como vehículos para llevar y entregar un fármaco de interés 9. Encapsulación de fármacos se puede lograr como se informó durante la formación del liposoma 9. Nuestra etapa de extrusión no debe afectar el fármaco encapsulado por dos razones, es decir, (1) encapsulación del fármaco debe lograrse antes de esta etapa y (2) liposomas deben conservar su estabilidad biofísico natural, de forma segura la realización del fármaco en el núcleo acuoso. Estos objetivos de la investigación sugieren además la necesidad de un método optimizado para el diseño estables de sub-micrones vesículas lipídicas. Sin embargo, las tecnologías actuales de preparación de liposomas (10 sonicación, congelación-descongelación y la 10, la sedimentación) no permiten la preparación de los liposomas con una superficie muy curvada (es decir, un diámetro &lt;100 nm) con una alta consistencia y eficiencia 10,5, lo que limita la biofísica estudios de un EMERGIcampo ng de detección de curvatura de la membrana. Aquí, presentamos un método de preparación sólida para una variedad de liposomas biológicamente relevantes. Extrusión manual utilizando Jeringas de gas y las membranas de policarbonato 10,5 es una práctica común pero heterogeneidad se observa a menudo cuando se utiliza tamaños de poro menores de 100 nm debido a debido a la variabilidad de la presión manual aplicada. Se empleó una constante presión controlada aparato de extrusión para preparar liposomas sintéticos cuyos diámetros varían entre 30 y 400 nm. Dispersión de luz dinámica (DLS) 10, 11 y microscopía electrónica de análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA) 12 fueron utilizados para cuantificar los tamaños de liposomas como se ha descrito en el protocolo, con poliestireno comercial (PS) las perlas se utilizan como un estándar de calibración. Se observó una correlación lineal cerca se observó entre los tamaños de poro y los trabajadores liposomas determinados experimentalmente, lo que indica una alta fidelidad de nuestra presión controlada preparación de liposomas se reunióHod. Además, hemos demostrado que este método de preparación de vesículas de lípidos es aplicable en general, independiente de los diversos tamaños de liposomas. Por último, también hemos demostrado en un estudio de evolución en el tiempo que estos liposomas preparados fueron estables durante hasta 16 horas. Un representante de tamaño nanométrico protocolo de preparación de liposomas se demuestra a continuación.

Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Este protocolo describe un método de extrusión para preparar vesículas lipídicas de tamaños sub-micra con un alto grado de homogeneidad. Este método utiliza un sistema de presión controlada con tasas controladas de nitrógeno de flujo para la preparación de liposomas. La preparación de lípidos<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Extrusión de los liposomas, y caracterización tamaño se presenta en este documento.

Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K vistas.  University of Colorado Boulder. Este protocolo describe un método de extrusión para preparar vesículas lipídicas de tamaños sub-micra con un alto grado de homogeneidad. Este método utiliza un sistema de presión controlada con tasas controladas de nitrógeno de flujo para la preparación de liposomas. La preparación de lípidos 1,2, Extrusión de los liposomas, y caracterización tamaño se presenta en este documento.

Video: Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Investigación

Bioingeniería

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Un método mejorado para la preparación de colágeno tipo I De Piel

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

La extrusión de película<em&gt; Abyssinica Crambe</em&gt; / Gluten de trigo Mezclas

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Análisis constante de resorte molecular mediante espectroscopia de sonda de fuerza de biomembrana

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...