El retículo endoplasmático contiene un dominio tubular dinámico que interactúa continuamente con el citoesqueleto sufre un movimiento y reordenamiento constantes. La forma en que el ERE genera y mantiene esta organización aún no se entiende completamente. Aquí presentamos una cuestión conveniente para formar un modelo de orgánulo estructural de abajo hacia arriba para la sala de emergencias, que consiste en un sistema de membrana libre de proteínas de apoyo sólido que se puede transferir a redes complejas de nanotubos lipídicos.
La hidrófila es un compuesto orgánico para la energía. No se requiere purificación de proteínas ni extracción de proteínas. Los únicos componentes esenciales son el sustrato sólido y los fosfolípidos que proporcionan el modelo de ER más básico.
Transfiera las soluciones de lípidos disueltos en un matraz invertido en forma de pera de 10 mililitros, sumando una cantidad total de 3.000 microgramos de lípidos y 300 microlitros de cloroformo. A continuación, conecte el matraz a un evaporador giratorio y colótelo con una inclinación de 45 grados. Gire el matraz a 24 RPM dentro de un baño de agua a 23 grados Celsius durante seis horas con presión de aire reducida para eliminar lenta y completamente el cloroformo.
Comience a reducir la presión justo después de iniciar la rotación por pasos de 20 kilopascales cada dos minutos hasta que la presión alcance los 20 kilopascales. Después de seis horas, detenga la rotación y aumente la presión del aire de nuevo gradualmente por pasos de 20 kilopascales cada dos minutos hasta llegar a 100 kilopascales. Retire el matraz del evaporador rotativo y añada tres mililitros de PBS y 30 microlitros de glicerol.
Gire suavemente el matraz para disolver el glicerol. Utilice un tapón de vidrio hermético para sellar el matraz que contiene los lípidos. Guarde el matraz en el refrigerador a cuatro grados centígrados durante la noche para la rehidratación e hinchazón de las películas de lípidos.
Al día siguiente, sonicar los lípidos con un baño de agua ultrasónica a temperatura ambiente y a 35 kilohercios de frecuencia hasta lograr una suspensión uniforme de lípidos ligeramente turbios. La sonicación puede tardar entre 10 y 30 segundos. La sonicación prolongada produce calor y es perjudicial para la formación vesical.
Estos pasos producen una suspensión que contiene dos tipos de estructuras vesiculares. Vesículas multilamelares y vesículas unilamelares gigantes. Para el almacenamiento, divida la suspensión de lípidos en 100 alícuotas de microlitros utilizando un total de 30 tubos de microcentrífuga.
Almacene las alícuotas en un congelador a menos 20 grados centígrados. La congelación repentina con nitrógeno líquido no es necesaria. Descongelar la suspensión lipídica y transferir una gota de cuatro microlitros de suspensión a un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio o a un resbalón de cubierta.
Después de 20 minutos de desicación, la gota colapsará en una película circular plana de lípidos que es visible para el ojo. Rehidratar la película lipídica con un mililitro de tampón HEPES durante 3 minutos. Preparar la cámara de observación con una tapa abierta para permitir el intercambio de búferes mediante una pipeta automática, que se requiere para iniciar la transformación de ER como se detalla en el protocolo de texto.
Después de retirar la losa DE PDMS curada con una espátula, utilice un bisturí para cortar el marco en las dimensiones y geometría adecuadas para la abertura disponible en la etapa del microscopio. Las dimensiones de 1,5 por 1,5 por 0,5 centímetros son adecuadas para la mayoría de las configuraciones. Ponga el lado liso del marco PDMS en contacto con el lado activo de la superficie donde reside la película de óxido de aluminio y aplique suavemente presión para empujar el marco y la superficie entre sí para que se adhieran.
Llene inmediatamente la cámara de observación con tampón de calcio HEPES. No llene todo el volumen de la cámara para permitir la adición de los lípidos rehidracionados en el paso siguiente. Coloque la cámara en la etapa del microscopio confocal.
Transfiera el material lipídico rehidrado, ahora una suspensión que contiene vesículas gigantes, a la cámara con una pipeta de pastos de plástico. Espere de 10 a 20 minutos para dejar que las vesículas se adhieran al sustrato y se extiendan por la superficie. La propagación comienza inmediatamente después de la deposición de lípidos en la superficie.
Antes de que los lípidos se propaguen, el intercambio tampón debe realizarse tan suavemente como sea posible, eliminando rápidamente o la adición rápida del tampón perturba las estructuras lipídicas en la superficie. Después de observar múltiples diseminaciones de lípidos, retire lentamente el tampón ambiental a través de la pipeta automática. De tal manera que sólo una película tampón delgada permanece en la parte inferior.
Tenga cuidado de evitar la eliminación rápida. Proceda al intercambio de búfer ambiente llenando lentamente la cámara de observación con el búfer HEPES del quelante utilizando una pipeta automática. Evite la adición abrupta.
El paso final produce redes nanotubulares dinámicas formadas como resultado del despinning y retracción inducidas por el quelante del DLBM a las vesículas multilamelares. Aquí se muestran micrografías de las redes de nanotubos obtenidas en el protocolo. En esta imagen, las regiones rojas brillantes continuas son la fracción retraída del DLBM, que está marcada con una línea discontinua azul.
Aquí se muestra, es un micrográfico de una red tubular que se ha invertido para aumentar el contraste. Aquí, la reducción de la densidad tubular se muestra en una región de membrana en el transcurso de tres horas y 20 minutos. La disminución de la densidad tubular se produce debido a la despinning gradual seguida de la retracción del DLBM de la superficie.
Las ubicaciones de los puntos de fijación mediados por calcio se pueden establecer como los puntos donde los tubos tienen giros terminales o agudos. Los giros afilados se conocen como uniones v o puntos de giro debido al cambio repentino en la dirección de la alineación de los tubos. El punto final representa el término de la sonda que impide que el tubo se retraiga.
Si la propagación continúa durante períodos prolongados, la tensión de la membrana aumenta dando lugar a rupturas. Dado que los lípidos están etiquetados fluorescentemente, la ruptura se puede observar directamente. Un indicador clave de la ruptura es la disminución significativa de la intensidad de la fluorescencia en la región rota.
Una deshidratación completa de la muestra o un intercambio rápido de tampones causa perturbación, rotura o deformación de los parches. La complejidad del modelo se puede construir mediante la adición de componentes asociados a ER, como proteínas lipídicas. Y este modelo también puede ser implícito para estudiar el autoensambleo, los nanofluídicos, el flujo de marangoni y los fenómenos de transporte.
El cloroformo es tóxico y altamente volátil que siempre debe ser manejado bajo una campana de humos y con el equipo de protección personal asociado incluyendo guantes de laboratorio de acetato de polivinilo, abrigo de laboratorio, y gafas de seguridad.
