Este trabajo fue apoyado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud a través de un catalizador de Co-infecciones y la concesión co-morbilidades. Los eritrocitos humanos fueron proporcionados por el Centro Hospitalario de l&#39;Université Laval banco de sangre.

Nota: Los experimentos con el VIH-1 y Plasmodium falciparum se debe realizar en el adecuado nivel de laboratorios de bioseguridad (BSL2 para los parásitos, y BSL3 para el VIH-1 y coinfecciones) y la precaución se debe tener especial cuando se utiliza la sangre humana potencialmente infectados. 1. Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) Purificación (Basado en 8 y 9) <ol><li> Comienza con sangre humana fresca de donantes sanos (500 ml) tratadas con anticoagulantes (heparina, citrato, ácido dextrosa citrato o citrato fosfato dextrosa). El uso libre de endotoxinas reactivos cuando la purificación y aislamiento de CMSP y en el resto del protocolo. </li><li> Desinfecte la bolsa de sangre, incluyendo el tubo, con el 70% de etanol, cortar el tubo y transferir cuidadosamente la sangre en un frasco T150. </li><li> Preparar 16 tubos con 15 ml de medio de separación linfocitos (Ficoll) por cada 50 ml tubo cónico (asegúrese de que Ficoll ha alcanzado la temperatura ambiente).Con cuidado, la capa de 30 ml de sangre fresca en la parte superior. </li><li> Se centrifuga a 400 xg durante 30 min a 20 ° C con rompe. </li><li> Durante la centrifugación, preparar 8 x 50 ml tubos cónicos con 25 ml de solución salina equilibrada de la temperatura ambiente de Hank (HBSS) por tubo. </li><li> Cuidadosamente transferir el anillo de células nublado en la interfase (contiene PBMC) al tubo de 50 ml que contiene el HBSS (piscina 2 anillos de células por tubo). Completar volúmenes de hasta 50 ml con HBSS. </li><li> Se centrifuga a 150 xg durante 15 min a 20 ° C con saltos en. </li><li> Durante la centrifugación del anillo de células nublado, recoger la capa superior amarilla de la etapa de Ficoll, la piscina de plasma para llenar un tubo cónico de 50 ml. Inactivar el complemento en el plasma mediante el calentamiento del tubo de 50 ml a 56 ° C durante 30 min y 10 min a girar 1.800 x g. Mantener el sobrenadante (contiene plasma autólogo diluyó que se puede utilizar como suplemento de medio en pasos posteriores). </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante y resuspensiónd el sedimento celular desde el paso de 1,7 en 25 ml de HBSS y 2 piscina gránulos por tubo de 50 ml. Gira a 300 xg durante 8 minutos a 20 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante con cuidado y volver a suspender los pellets en 10 ml de HBSS y piscina en un tubo de 50 ml. </li><li> Tomar una alícuota, lleve a cabo la exclusión azul tripán para evaluar la mortalidad y luego contar PBMC. </li><li> Volumen completo a 50 ml con HBSS y centrifugado 10 min a 300 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI 1640 a 5x10 6 células / ml (se debe obtener alrededor de 400 a 500 x 10 6 PBMC de 500 ml de sangre). </li></ol> 2. Los monocitos-macrófagos derivados (MDM) Diferenciación (Basado en 8 y 9) <ol><li> Semillas de aproximadamente 1,25 x 10 8 PBMC en 15 platos cm con medio RPMI 1640 (25 ml / placa). </li><li> Que las células se adhieran durante 1-2 horas a 37 ° C con 5% atmósfera de CO 2. </li><li> Transferir las células no adheridas en un matraz de nuevo y se lava la placa con 15 ml dos veces endotoxina libre de PBS (5min, 300 xg). Las células adheridas son monocitos aislados. </li><li> Para permitir que los monocitos recién aisladas de diferenciarse en MDM, añadir 20 ml de medio RPMI 1640 suplementado con 5% de plasma autólogo (del paso 1,8). Añadir humana recombinante de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, 25 ng / ml) y solución de penicilina / estreptomicina (PS, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina). Incubar durante 2 días, cambie a medio e incubar 2-3 días adicionales a 37 ° C en 5% atmósfera de CO 2. </li><li> Retire medio viejo y lavar con endotoxina libre de una vez PBS, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. Para separar MDM totalmente diferenciado, tratar las células con ~ Accutase 7 ml (Accutase, una mezcla comercialmente disponible de las proteasas y la actividad colagenolítica que permiten el desprendimiento de células de la placa de plástico) durante 15-20 min a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera, el rock suave a media hora. </li><li> Agregar 3.5 ml de plasma autólogo (del paso 1.8) en cada plato (para ayudar a proteger las células, mientras queraspando). </li><li> Raspe suavemente las células que hacen que ese medio cubre las células de todos los tiempos y la transferencia de la piscina / en un tubo de 50 ml. </li><li> Lavar las placas con PBS libre de endotoxina para recuperar mayor cantidad de células posible. </li><li> Gira de 5 minutos a 200 xg, desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento en 5 ml de medio de cultivo MDM (RPMI 1640 suplementado con complemento inactivado por 10% de suero fetal bovino (OFI), PS, HEPES 25 mM) y cuentan las células (MDM producen generalmente 2-8% del total de CMSP). Nota: una parte alícuota de MDM podrían tomarse en este paso para evaluar la pureza de la población de células por citometría de flujo, por lo general 99% de las MDM obtenido expresa CD14. </li><li> Semilla 1x10 5 MDM en 600 l de medio de cultivo MDM por pocillo en placas de 24 pocillos. </li><li> Incubar durante una noche a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera antes de infecciones. </li></ol> 3. Producción y cuantificación de VIH-1 en las poblaciones virales <ol><li> Producir reservas de virus utilizando la transfección de fosfato de calcio en las células HEK293T Folloala el protocolo de Fortín et al. 10. </li><li> Con el fin de obtener virus individuales del ciclo que contienen el gen informador de luciferasa-codificación, co-transfectar células HEK293T con cualquiera de 20 g NL4.3 Luc + Env - R + y 10 g de pHCMV-G, o 15 g de NL4.3 Luc Env + - + R y 15 g de pJRFL env. Utilizar 30 g de NL4.3 Luc + Env - I + para generar control deficientes glicoproteína-virus. Para que el virus replicativa completamente, usar 30 g de NL4.3Bal env. Los vectores pHCMV-G y env pJRFL codificar las glicoproteínas de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) y de un CXCR5-trópico VIH-1 (diferente de NL4.3Bal env), respectivamente. Información adicional sobre los plásmidos se pueden obtener a partir de 8. Los plásmidos se pueden obtener a través de la Investigación y el Programa de SIDA de los NIH de referencia (NIAID, NIH). </li><li> Cuantificar todas las poblaciones virales por ELISA para la proteína de la cápside del VIH-1 p24 11, Y verificar su potencial infeccioso antes de su uso. Evaluamos la capacidad infecciosa de las poblaciones de nuestros virus a través del uso de células indicadoras TZM-BL 12. </li></ol> 4. Cultura de los parásitos Plasmodium falciparum (Basado en 13) 4.1 La cultura general y el mantenimiento de los parásitos <ol><li> Mantener P. falciparum 3D7 parásitos etapa asexual en eritrocitos humanos (grupo sanguíneo O +) en un hematocrito 4% en RPMI 1640 (tamponada con HEPES 25 mM y 25 mM NaHCO 3) suplementado con Albumax 0,5% (w / v) de II, 25 ug / ml de gentamicina e hipoxantina 370μM a 37 ° C en una mezcla de gas de 1% de oxígeno / 5% de dióxido de carbono en nitrógeno. </li><li> Parasitemia se puede controlar mediante una capa delgada de la cultura y la tinción con una solución de Giemsa 15%. </li><li> Siempre mantener un células no infectadas rojas de la sangre (uRBC) plato de cultivo en las mismas condiciones que los parásitos de usar como un control. Para obtener parasit última etapaes (trofozoitos o esquizontes primeros), sincronizar los parásitos de la siguiente manera: </li></ol> 4.2 Parásitos de sincronización <ol><li> Por la mañana, la cosecha de la cultura parásito, giro 5 minutos a 300 xg y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el pellet en 5 volúmenes de células empaquetadas con 5% (w / v) de D-sorbitol e incubar 5 min a 37 ° C. </li><li> Gira de 5 minutos a 300 x g, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 30 ml de medio de cultivo y volver a poner en la incubadora. </li><li> Aproximadamente 8 horas más tarde, repita los pasos 4.2.1 a 4.2.3 a fin de obtener los parásitos bien sincronizados. Los parásitos de la etapa tardía (trofozoitos o esquizontes primeros), entonces se puede cosechar a la mañana siguiente para llevar a cabo el experimento. Antes de la purificación, realizar la tinción de Giemsa para confirmar la etapa del ciclo de vida. </li></ol> 4.3 Plasmodium falciparum-los glóbulos rojos infectados (iRBC) purificación <ol><li> Esterilizar el separador VarioMacs (soporte y un imán) con un 70% de etanol y pencaje que bajo el capó biológica. </li><li> Fije la llave de tres vías de fondo de la columna CS. </li><li> Cortar el extremo del protector de aguja de plástico con el cortador Miltenyi especial y fijar la aguja a la parte inferior llave de paso. </li><li> Bloqueo de la columna en el imán con cuidado. </li><li> Eliminar todas las burbujas de aire en la columna por inyectando lentamente 10 ml de medio de cultivo MDM con la jeringa-kit cerrado atornillado en el lado izquierdo de la llave de paso. </li><li> Lavar la columna con ~ 20 ml de medio de cultivo MDM. </li><li> Cosecha de glóbulos rojos de la placa de cultivo, se lava una vez con 10 ml de medio de MDM (300 xg, 5 min) y resuspender el precipitado de glóbulos rojos en 12 ml de medio de cultivo MDM. Añadir lentamente a la columna y dejar que el flujo de suspensión a través de (sólo infectadas células rojas de la sangre que contienen parásitos en el trofozoíto o etapa esquizonte será retenido por el campo magnético debido a la presencia de cristales hemozoína). </li><li> Lavar una vez con 20 ml de medio y detener el flujo de líquido cuando alcanza el disco blanco en la parte superior de la columna. </li><li>Quitar la columna del imán y iRBC eluyen en un tubo limpio estéril con 12 ml de medio de cultivo MDM. </li><li> Frotis de una alícuota de la iRBC recuperó y realizar la tinción de Giemsa para confirmar la etapa del ciclo de vida. </li><li> Cuente recuperó iRBC utilizando un hemocitómetro (aislado RBC son 100% iRBC). </li><li> Las células de pellets (300 xg, 5 min), desechar el sobrenadante y tratar las células con 500 l fresca AB + suero humano (opsonización paso 14). </li><li> Incubar durante 30 min a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Lavar una vez con 10 ml de medio de cultivo MDM (300 x g, 5 min), y volver a suspender iRBC a la concentración deseada. Por lo general, una parasitemia 10% 15 cm placa de cultivo más o menos da ~ 0.5-1x10 8 iRBC bien sincronizados. </li></ol> 5. La exposición de los MDM a Plasmodium falciparum <ol><li> Para exponer la MDM para uRBC o iRBC, las células deben ser resuspendidas en medio de cultivo MDM con el fin de obtener una relación de uRBC / iRBC: MDM de 75:1. En previamentepreparadas placas de 24 pocillos que contienen MDM, añadir un volumen adecuado de suspensión de glóbulos rojos a cada pocillo. Lleve a cabo todos los experimentos por triplicado. </li><li> Incubar co-cultivos de 4 horas a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera. </li><li> Se lavan las células con 600 l de PBS libre de endotoxinas 3 veces, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. </li><li> Para el resto de lisar glóbulos rojos, lavar los pocillos añadiendo 200 l de helado de agua estéril durante 20 segundos y aspirado. </li><li> Añadir 600 l medio de la cultura MDM e incubar 24 horas a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera. </li></ol> 6. Infección de MDM con un replicativa completamente VIH-1 <ol><li> A fin de evaluar el efecto de P. falciparum en la replicación del VIH-1 en MDM, añadir, según el esquema descrito en la Figura 1A, 10 ng de p24 (en 300 l de MDM medios de comunicación) de NL4.3Bal virus env en la apropiada pozos; añadir sólo medio MDM en los pocillos de control . </li><li> Incubar 2 horas a 37 ° C en un 5% Atmósfera de CO 2. </li><li> Se lavan las células con PBS libre de endotoxinas 3 veces, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. Añadir 600 l de medio fresco por MDM así. </li><li> Incubar a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Al día 3, 6, 9 y 12 después del comienzo de la infección viral, la cosecha 200 l de cada sobrenadante, añadiendo 200 ul de medio fresco MDM posteriormente. Mantener los sobrenadantes recogidos a -20 ° C para la cuantificación de los principales del VIH-1 proteína p24 de la cápsida por ELISA tras Fortín et al. 10. </li></ol> 7. La infección de MDM con luciferasa de la codificación ciclo del virus <ol><li> Con el fin de determinar el impacto del parásito sobre el VIH-1 la expresión génica en MDM, añadir, según el esquema descrito en la Figura 1B, 10 ng de p24 (en 300 l de medio MDM) de cualquiera de NL4.3 Luc + Env - R + ( VSV-G), NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) o Luc NL4.3 +ENV - I + virus en los pocillos correspondientes. </li><li> Incubar 2 horas a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Se lavan las células con 600 l de PBS libre de endotoxinas 3 veces, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. Añadir 600 l de medio fresco por MDM así. </li><li> Incubar a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. </li><li> Retire el medio de la infección 72 horas siguientes y añadir 200 l de tampón de lisis 1X (suministrado con el kit de ensayo de la luciferasa). Que las células lisar a temperatura ambiente con agitación suave. Almacenar a -20 ° C. </li><li> Descongele la placa y transferir 40 l del lisado a una placa de luminómetro 96-así, añadir 100 l de sustrato de luciferasa (suministrado con el kit de ensayo de luciferasa) y medir la luciferasa (luciferasa de luciérnaga) actividad en un luminómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. </li></ol> 8. Los resultados representativos Utilizando el modelo de co-infección, se muestra que exposure de P. falciparum a MDM disminuye su susceptibilidad a la infección VIH-1. De hecho, una disminución significativa (p &lt;0,05; 2 ANOVA, el día 12) en la liberación de partículas virales, medida por el VIH-1 proteína de la cápside p24 en el sobrenadante, se observa en MDM previamente con parásitos (Figura 2A). Esta observación se confirma en las células infectadas por virus que codifica un gen de la luciferasa-reportero. La infección con los virus de este tipo MDM albergan ya sea exógeno VSV-G o glucoproteínas del VIH-1 lleva a significativamente (p &lt;0,05, t de Student-test) la producción de luciferasa menos en las células expuestas a P. falciparum (Figura 2B). Es de notar que VSV-G-pseudotyped virus producido actividad mucho mayor que sus contrapartes luciferasa JRFLenv; esto es debido a la eficiencia infección mayor de VSV-G partículas pseudotyped 15. Dado que los parásitos la exposición a los impactos MDM ambos tipos de virus, esto sugiere que influye en algún paso en la ex gen viraldepresión (Figura 2B). También es importante mencionar que la viabilidad celular no se vio afectada por la exposición a MDM iRBC (datos no presentados), lo que indica que la inhibición observada es específica y no debido a la mortalidad celular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" /> Figura 1. A) Placa de régimen para la infección con un virus MDM replicativa totalmente Falsa. Células no infectadas. uRBC: las células expuestas a los glóbulos rojos no infectados. iRBC: las células expuestas a Plasmodium falciparum infectados por los glóbulos rojos. Bal: células infectadas con NL4.3Bal env Bal / uRBC:. Las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3Bal env Bal / iRBC:.. Las células expuestas a iRBC e infectadas con NL4.3Bal env b) Régimen placa para la infección con MDM solo ciclo de la luciferasa de codificación de virus de la Falsa. células no infectadas. uRBC: las células expuestas a los glóbulos rojos no infectados. iRBC: las células expuestas a Plasmodium falciparum-infected glóbulos rojos. Δenv: células infectadas con NL4.3 Luc + Env - I + JRFL:. Células infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). VSV-G: las células infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G) Δenv / uRBC:.. las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC: las células expuestas a iRBC e infectados con NL4.3 Luc + Env - I + JRFL / uRBC: las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env).. JRFL / iRBC: las células expuestas a iRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G): vsv-g/iRBC. las células expuestas a iRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/&gt; Figura 2. . A) Efecto de Plasmodium falciparum en el VIH-1 en la producción viral MDM MDM fueron expuestos a uRBC o iRBC en una proporción 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) durante 4 horas y se lavó extensamente. Las células fueron infectadas con 10 ng de NL4.3Bal p24 durante 2 horas env. La producción viral fue supervisado por ELISA para VIH-1 p24 en el sobrenadante libre de células en diferentes puntos temporales después de la infección viral inicial. Un representante experimento se muestra B) Efecto de Plasmodium falciparum en el VIH-1 de transcripción viral en MDM MDM fueron infectados con uRBC o iRBC en una proporción de 75:1 (uRBC / iRBC:.. MDM). Las células fueron infectadas con 10 ng de p24 del virus de un solo ciclo (ya sea NL4.3 Luc + Env - R +, NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) o NL4.3 Luc + Env - R + (VSV- g)). Luciferase expresión se evaluó en lisados ​​celulares 72 horas después de la infección inicial del virus. Un experimento representativo se muestra.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network.">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos ilustrado aquí dos enfoques diferentes para analizar el impacto del parásito de la malaria sobre el VIH-1 ciclo viral, es decir, ya sea mediante el análisis de la expresión genética viral o la producción de progenie y replicación del virus en macrófagos derivados de monocitos. Métodos similares han sido utilizados para la otra VIH-1-parásito co-infecciones 16. Sin embargo, estos nuevos datos son un paso adelante en la investigación de la malaria, el VIH-1 co-infecciones. . De hecho, Diou et al 8 estudiaron el efecto de hemozoína, los parásitos no en vivo, sobre el VIH-1 de replicación, de acuerdo con nuestros resultados, se observó que hemozoína era suficiente por sí misma para inhibir la producción viral por MDM, y no MDM. Usando el diseño experimental descrito, se observó que P. falciparum ejerce un claro efecto perjudicial sobre el ciclo de replicación del VIH-1 en los macrófagos: una inhibición significativa de la producción viral se observa en los macrófagos pre-expuestas a los parásitos (Figure 2A) y un impacto específico del parásito en la transcripción viral se ilustra en la Figura 2B. Sin embargo, no podemos dejar de lado los efectos adicionales del parásito en la entrada del virus o de fusión (decapsidation), o en los mecanismos de integración post-, tales como la síntesis de proteínas o de ensamble de partículas víricas y en ciernes. Además, es posible que un impacto diferente en la replicación del VIH-1 se obtendría si el parásito se añadieron o bien al mismo tiempo o infección MDM siguiente con el virus. Nuestra in vitro co-infección del modelo proporciona una herramienta poderosa para llevar a cabo investigaciones detalladas de VIH-1 / P. interacciones falciparum en la célula huésped. Por ejemplo, la combinación de este diseño experimental con otras técnicas tales como cuantitativo PCR en tiempo real, que puede atacar y cuantificar los pasos específicos en retrotranscripción viral y la integración del genoma viral al genoma de la célula huésped, son bastante factible y debe producir más INSIghts en los mecanismos involucrados en la co-infecciones. Además, los ensayos específicos para evaluar los primeros pasos del ciclo viral (la unión del virus, decapsidation, cuantificación entrada) se puede aplicar a este protocolo básico para analizar aún más el efecto sobre la replicación viral. Estas modificaciones muestran la flexibilidad de este protocolo es sobre el VIH-1 y la cuantificación de detección: de hecho, incluso el VIH-1 estándar ensayos de cuantificación de la transcriptasa inversa utilizando tritio nucleótidos marcados posiblemente podría sustituir a la prueba ELISA para VIH-1 p24. Además de las MDM, esperamos que nuestro sistema para poder adaptarse a otros tipos de células relevantes para la interacción del VIH-1-malaria, como los monocitos y células dendríticas. El hecho de que MDM son células adherentes facilita su manipulación, lo que permite fácil lavado de iRBC que no se han tomado en, o que están en contacto con MDM, sin eliminar cualquier macrófagos. Tal ventaja no se aplicaría a las células dendríticas y monocitos, que son cultivadas en suspensión, lo que complica la SEparación de iRBC uRBC y libre con dichas células y estamos tratando este asunto. Nuestro sistema también podría ser útil para estudiar las interacciones más complejas tales como los efectos de Plasmodium expuestos a las células derivadas de monocitos en el ciclo viral del VIH-1 en otras células del sistema inmune, tales como CD4-positivas las células T en los experimentos de co-cultivo. Finalmente, el protocolo podría ser adecuado para los experimentos que buscan en el efecto de P. falciparum iRBCs sobre la reactivación del VIH-1 en PBMC de VIH-1 en individuos infectados. Ética declaración PBMC humanas fueron obtenidas de la sangre de donantes sanos, de acuerdo con las directrices del Comité de Bioética del Centro Hospitalario de la Centro de Investigación de la Universidad Laval. Un escrito el consentimiento se obtuvo de todos los donantes de sangre.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Multicell </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-endotoxinas </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Wisent </td><td> 080-150 </td><td> Inactivado por calor a 56 ° C durante 30 min </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> Disuelto en RPMI 1640, esterilizada por filtración </td></tr><tr><td> Medio de separación de linfocitos </td><td> Multicell </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> Las placas blancas luminómetro </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> Mac CS separación columms </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> VarioMacs separador </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina solución </td><td> Wisent </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> Rascador de la célula (25 cm) </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1830 </td><td></td></tr><tr><td> 24 y placas de cultivo celular </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 20 mm placa de cultivo </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> Genscript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> Suero humano AB + </td><td> Valle Biomédica </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Wisent </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hipoxantina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO $ 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de ensayo Luciferase </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> Las células rojas de la sangre </td><td></td><td></td><td> Obtenido purificada a partir de banco de sangre chul. </td></tr></tbody></table>

an in vitro co-infection model to study plasmodium falciparum-hiv-1 interactions in human primary monocyte-derived immune cells

Plasmodium falciparum, el agente causante de la forma más mortal de la malaria y el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) se encuentran entre los problemas de salud más importantes del mundo, siendo responsable de un total de 4 millones de muertes al año 1. Debido a su amplia coincidencia en las regiones en desarrollo, especialmente en el África subsahariana, las coinfecciones con el paludismo y el VIH-1 son comunes, pero la interacción entre las dos enfermedades es poco conocida. Informes epidemiológicos han sugerido que la infección malárica transitoriamente aumenta la replicación del VIH-1 y aumenta la carga viral del VIH-1 en individuos co-infectados 2,3. Debido a que esta viremia se mantiene alta durante varias semanas después del tratamiento con antipalúdicos, este fenómeno podría tener un impacto en la progresión de la enfermedad y la transmisión. Los mecanismos inmunológicos celulares detrás de estas observaciones se han estudiado sólo casi. Los pocos estudios in vitro investigTES DE OPERAR EL impacto de la malaria sobre el VIH-1 han demostrado que la exposición a antígenos solubles de malaria puede aumentar la infección VIH-1 y la reactivación de las células inmunes. Sin embargo, estos estudios se utilizaron extractos de células enteras de P. falciparum esquizontes parásitos en el estadio y las células mononucleares de sangre periférica (CMSP), lo que hace que sea difícil de descifrar qué componente de malaria (s) fue el responsable de los efectos observados y cuáles son las células huésped objetivo eran 4,5. Trabajos recientes han demostrado que la exposición de las células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos en el pigmento de la malaria hemozoína aumentado su capacidad de transferir el VIH-1 a células T CD4 + 6,7, sino que disminuyó el VIH-1 de macrófagos 8. Para arrojar luz sobre este complejo proceso, un análisis sistemático de las interacciones entre el parásito de la malaria y el VIH-1 en diferentes poblaciones humanas relevantes de células primarias es críticamente necesario. Existen varias técnicas para investigar el impacto de HIV-1 en la fagocitosis de los microorganismos y el efecto de tales patógenos en la replicación del VIH-1 se han descrito. Damos a conocer un método para investigar los efectos de P. por P. falciparum-eritrocitos infectados en la replicación del VIH-1 en humanos primarios derivados de los monocitos macrófagos. El impacto de la exposición parásito sobre el VIH-1 transcripción / traducción eventos se controla mediante el uso de virus individuales ciclo pseudotyped en el que un gen informador de luciferasa ha sustituido el gen Env mientras que el efecto sobre la cantidad de virus liberado por los macrófagos infectados se determina midiendo el VIH-1 proteína de la cápside p24 por ELISA en sobrenadantes de células.

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An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Hemos desarrollado un<em&gt; In vitro</em&gt; La malaria-VIH-1 la co-infección modelo para estudiar el impacto de la<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; En el ciclo de replicación del VIH-1 en humanos primarios derivados de los monocitos macrófagos. Este sistema versátil se puede adaptar fácilmente a otros tipos de células primarias susceptibles a la infección por VIH-1.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

13.6K vistas.  CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada. Hemos desarrollado un In vitro La malaria-VIH-1 la co-infección modelo para estudiar el impacto de la Plasmodium falciparum En el ciclo de replicación del VIH-1 en humanos primarios derivados de los monocitos macrófagos. Este sistema versátil se puede adaptar fácilmente a otros tipos de células primarias susceptibles a la infección por VIH-1.

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Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Investigación

Inmunología e Infección

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.