이 작품은 촉매 공동 감염 및 공동 morbidities의 부여를 통해 건강 연구의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 인간의 적혈구는 센터 Hospitalier 드 난 Université 라발 혈액 은행에 의해 제공되었다.

주 : HIV-1과 Plasmodium falciparum과 실험이 적절한 biosafety 수준의 실험실에서 수행되어야합니다 (기생충에 대한 BSL2 및 BSL3 HIV-1과 공동 감염)과 잠재적으로 감염된 사람의 혈액을 사용할 때 특별한주의가 납치되어야합니다. 1. 말초혈 Mononuclear 세포 (PBMC) 정화 (8, 9 일 기준) <ol><li> anticoagulants (헤파린, 구연산, 산성 구연산의 덱스 트로 오스 또는 구연산 인산 덱스 트로 오스)로 치료가 건강한 기증자 (500 ML)에서 신선한 인간의 피를 함께 시작합니다. 정화 및 분리 PBMC하고 프로토콜의 나머지 부분에 걸쳐 때 내독소없는 시약을 사용합니다. </li><li> 70 % 에탄올과 함께 튜브를 포함한 혈액 가방, 소독, 튜브를 잘라 조심스럽게 T150 플라스크에 혈액을 전송합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브 (Ficoll는 실내 온도에 도달했음을 확인) 당 15 ML Lymphocytes 분리 매체 (Ficoll) 16 튜브를 준비합니다.위에 신선한 혈액을 조심스럽게 층 30 ML. </li><li> 20시 30 분 400 XG에서 원심 ° 떨어져 휴식 C #. </li><li> 원심 분리하는 동안 튜브 방마다 온도 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 25 ML 8 X 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. </li><li> 조심스럽게 HBSS (튜브 당 수영장이 휴대폰 고리)를 포함하는 50 ML 튜브로 인터페이스에서 흐린 셀 링 (PBMC를 포함) 전송합니다. HBSS로 50 ML에 볼륨을 작성합니다. </li><li> 20 15 분 150 XG에서 원심 °에서 휴식도 C #. </li><li> 흐린 셀 링의 원심 분리하는 동안, Ficoll 단계, 50 ML 원뿔 튜브를 채울 수영장 플라즈마에서 노란색 상위 레이어를 수집합니다. ° C에서 30 분 동안하고 1,800 X g에서 10 분 스핀 56시 50 ML 튜브를 가열하여 플라즈마에 보완 Inactivate. 뜨는 (나중 단계에서 중간 보충으로 사용할 수 있습니다 포함되어 있습니다 희석 autologous 플라즈마)를 유지. </li><li> 조심스럽게 뜨는 및 resuspen를 제거D 50 ML 관 당 HBSS와 수영장이 알약의 25 ML의 1.7 단계에서 세포 펠릿. 20 ° C.에 8 분 300 XG에 스핀 </li><li> 신중하게 뜨는을 제거 한 50 ML 튜브 10 ML의 HBSS와 수영장에서 알약을 resuspend. </li><li> , 나누어지는을 가지고 사망률을 평가하기 위해 trypan 파랑 배제를 수행하고 PBMC를 계산합니다. </li><li> HBSS 300 X g에서 10 분 스핀과 함께 50 ML 완료 볼륨. 표면에 뜨는를 제거하고 (하나는 혈액 500 ML에서 400-500 X 10 6 PBMC 주위를 취득한다) 5x10 6 셀 / ML에 RPMI 1640에서 셀을 resuspend. </li></ol> 2. Monocytes - 유래 Macrophages (MDM) 차별 (8, 9 일 기준) <ol><li> RPMI 1640 (25 ML / 접시)와 15cm 요리의 씨앗 약 1.25 X 10 8 PBMC. </li><li> 세포가 5 % CO 2 분위기로 37 ° C에서 1-2 시간 동안 준수합시다. </li><li> 새로운 플라스크에 비 준수 세포를 전송 15 ML 내독소없는 PBS 회 (5 판을 씻어분, 300 XG). 준수 세포 절연 monocytes 있습니다. </li><li> 갓 격리 monocytes가 MDM으로 차별화하도록하려면 5 % autologous 플라즈마 (단계 1.8부터)와 함께 보충 RPMI 1640 배지의 20 ML에 추가합니다. 인간 재조합 대식 세포의 콜로니 자극 인자 (M-CSF, 25 NG / ML) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 (PS, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신)를 추가합니다. 2 일 품어, 중간을 변경할 37 5퍼센트에서 ° C에서 CO 2 분위기에서 2-3 여분 일 부화. </li><li> 오래된 매체를 제거하고 내독소 무료 PBS로 한 번 씻고, PBS를 부드럽게 추가하고 즉시 기음. 완전히 차별 MDM를 분리하려면, 5 % CO에서 37 ° C에서 15-20 분 ~ 7 ML Accutase (Accutase, 플라스틱 접시에서 세포의 분리를 허용 프로 테아제와 collagenolytic 활동의 상용 믹스)와 세포 치료 이 분위기, 중간 시간에 부드럽게 신난다. </li><li> (세포를 보호하는 데 도움이되는 동안 각 플레이트에 3-5 ML autologous 플라즈마를 (단계 1.8에서) 추가) 부서. </li><li> 부드럽게 매체가 50 ML 튜브의 모든 시간과 전송 / 수영장에서 전지를 다루고 있는지 확인하는 세포가 다쳤어요. </li><li> 가능한 많은 세포로 복구하는 내독소 무료 PBS로 번호판을 씻어. </li><li> 뜨는 삭제, 200 XG에서 5 분 던가. </li><li> 5 ML MDM 문화 매체 (RPMI 1640 10% 보완-inactivated 태아 소 혈청 (iFBS), PS, 25 밀리미터 HEPES와 보충)와 카운트 세포 (MDM 총 PBMC의 보통 2~8%를 얻을)에 Resuspend 펠릿. 참고 : MDM의 나누어지는가 유동세포계측법하여 세포 인구 순결을 평가하기 위해이 단계에서 넘어 수도 있고 보통은 99 % MDM 급행 CD14을 획득하였습니다. </li><li> 24 잘 접시에 잘마다 MDM 문화 매체 600 μl의 씨앗 1x10 5 MDM. </li><li> 감염 전에 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 밤새 품어. </li></ol> 3. HIV-1 바이러스성 주식의 생산 및 Quantitation <ol><li> HEK293T 세포 follo에 칼슘 인산염 transfection을 사용하여 바이러스 주식을 생산Fortin 외의 날개 프로토콜. 10. </li><li> R pHCMV-G의 +와 10 μg, 또는 NL4.3 룩의 15 μg - 중 NL4.3 루크 + 환경을 20 μg으로 루시페라제 인코딩 리포터 유전자를 포함하는 단일 사이클 바이러스, 공동 transfect HEK293T 세포를 얻기 위해 + 유럽 표준안 - R +와 pJRFL 유럽 표준안 중 15 μg. + 제어 당단백질 - 결함 바이러스를 생성 R - NL4.3 루크 + 환경을 30 μg을 사용합니다. 완전 replicative 바이러스의 경우 NL4.3Bal 유럽 표준안의 30 μg을 사용합니다. 벡터 pHCMV-G와 pJRFL 유럽 표준안은 각각 소낭성의 구염 바이러스의 봉투 glycoproteins (VSV-G)를 인코딩 및 CXCR5 - 열대 HIV-1 (NL4.3Bal 유럽 표준안 다를)으로. plasmids에 대한 자세한 내용은 8에서 얻을 수있다. Plasmids는 NIH 에이즈 연구 및 레퍼런스 프로그램 (NIAID, NIH)을 통해 얻을 수있다. </li><li> HIV-1 p24 capsid 단백질 11 엘리사를 사용하여 모든 바이러스 주식을 수량그리고 사용하기 전에 자신의 감염 가능성을 확인합니다. 우리는 TZM-BL 표시기 세포 12 사용을 통해 바이러스 주식의 감염을 평가. </li></ol> 4. Plasmodium falciparum의 기생충의 문화 (13 기준) 기생충 4.1 일반 문화 및 유지 보수 <ol><li> P.를 유지 0.5 % (W / V) Albumax II, 25 μg / ML Gentamicin과 보완 RPMI 1640의 4 % 혈소판 (25 MM HEPES 및 25 밀리미터 NaHCO 3 버퍼)에서 인간의 적혈구 (혈액 그룹 O +)의 falciparum 3D7 성별이없는 무대 기생충 37시 370μM의 Hypoxanthine 질소의 1 % 산소 / 5 % 이산화탄소의 혼합 기체에서 ° C #. </li><li> Parasitemia는 문화의 얇은 얼룩을하고 15 % Giemsa 용액으로 더럽히는 것으로 모니터링할 수 있습니다. </li><li> 기생충은 컨트롤로 사용할으로 항상 동일한 조건에서 감염되지 않은 적혈구 (uRBC) 문화 요리를 유지합니다. 늦은 무대 parasit를 구하려면초밖에 (trophozoites / 조기 schizonts)는 다음과 같이 기생충을 동기화 : </li></ol> 4.2 기생충 동기화 <ol><li> 아침에 300 XG에서 스핀 5 분 기생충 문화를 수확하고 뜨는 버리고. </li><li> 5% (W / V) 37시 D-Sorbitol 및 부화 5 분 ° C. 5 만원 셀 볼륨에 Resuspend 펠릿 </li><li> 300 X g에서 5 분 던가, 30 ML 문화 매체에 뜨는, resuspend 펠릿를 버리고 인큐베이터에 다시 넣어. </li><li> 약 8 시간 후 반복 단단히 동기 기생충을 얻기 위해 4.2.3에 4.2.1 단계를 반복합니다. 늦은 무대 기생충 (trophozoites / 조기 schizonts)은 다음 실험을 수행하기 위해 다음날 아침 수확한 수 있습니다. 이전 정화하기 전 라이프 사이클 단계를 확인하는 Giemsa의 염색법을 수행합니다. </li></ol> 4.3 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구 (iRBC) 정화 <ol><li> 70 % 에탄올과 P로 VarioMacs 분리기 (스탠드와 자석)을 소독생물 학적 후드 밑에 레이스. </li><li> CS 열 아래로 세 방향 꼭지를 수정합니다. </li><li> Miltenyi 특수 커터와 바늘 플라스틱 프로텍터의 끝을 잘라 꼭지 바닥에 바늘을 고정시킨다. </li><li> 신중 자석에 열을 잠금. </li><li> 천천히 꼭지의 왼쪽에 엉망 키트 - 동봉된 주사기로 MDM 문화 매체의 10 ML을 주입하여 열에있는 모든 공기 방울을 제거합니다. </li><li> ~ 20 ML MDM 문화 매체에 칼럼을 씻으십시오. </li><li> 문화 판에서 수확 RBC는 10 ML MDM 매체 (300 XG, 5 분)로 한번 씻어 및 12 ML의 MDM 문화 매체에서 RBC 펠렛을 resuspend. 천천히 열을 추가하고 (trophozoite 또는 schizont 단계에 기생충을 포함하는 유일한 감염된 적혈구 인해 hemozoin 크리스털의 존재에 자기장에 의해 유지됩니다)를 통해 서스펜션 흘러가게. </li><li> 20 ML 매체로 한번 씻어하고 열의 맨 위에있는 흰색 디스크에 도달하면 액체 흐름을 중지합니다. </li><li>12 ML MDM 문화 매체와 깨끗한 무균 튜브에 자석 및 elute의 iRBC에서 열을 제거합니다. </li><li> 비방 회수 iRBC의 나누어지는과 Giemsa은 라이프 사이클 단계를 확인 더럽히는 것 수행합니다. </li><li> 혈구계 (격리된 RBC 100 % iRBC입니다)를 사용하여 복구 iRBC 세어보세요. </li><li> 펠렛 전지 (300 XG, 5 분), 뜨는 버리고 500 μl 신선한 AB + 인간의 혈청 (opsonisation 단계 14)로 세포를 치료. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 30 분 동안 품어. </li><li> 원하는 농도로 iRBC 10 ML MDM 문화 매체 박스 (300 x G, 5 분), 그리고 resuspend에 한번 씻는다. 보통 10 % parasitemia 15cm 배양 접시는 대략 ~ 0.5-1x10 8 단단히 동기 iRBC을 제공합니다. </li></ol> 5. Plasmodium falciparum에 대한 MDM의 노출 <ol><li> 75:1의 MDM : uRBC 또는 iRBC에 대한 MDM을 폭로하기 위해 세포 uRBC / iRBC의 비율을 얻기 위해 MDM 문화 매체에 resuspended해야합니다. 이전에MDM을 포함하는 준비된 24 잘 접시, 각도에 적절한 RBC 서스펜션 볼륨을 추가합니다. 세중의 모든 실험을 수행합니다. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 4 시간을위한 공동 문화를 품다. </li><li> 내독소없는 PBS 3 회 600 μl로 세포를 씻어, 부드럽게 PBS를 추가하고 즉시 기음. </li><li> 나머지 RBC를 lyse하려면 20 초 및 대기음을 위해 얼음처럼 차가운 멸균 물 200 μl를 추가하여 우물을 씻는다. </li><li> 600 μl MDM 문화 매체를 추가하고 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 24 시간을 품어. </li></ol> 6. 완전 Replicative HIV-1과 MDM의 감염 <ol><li> P.의 효과를 평가하기 위해서는 MDM의 HIV-1 복제의 falciparum은 그림 1A, 해당 우물의 NL4.3Bal 유럽 표준안 바이러스의 p24의 10 NG (MDM 미디어 300 μl의)에 명시된 방식에 따라 추가, 컨트롤 우물에서만 MDM 매체를 추가하십시오 . </li><li> 5에서 37 ° C에서 2 시간을 품다% 2 분위기를 공동. </li><li> 내독소없는 PBS 3 회와 세포를 씻어, 부드럽게 PBS를 추가하고 즉시 기음. 잘마다 신선한 MDM 매체 600 μl를 추가합니다. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 품어. </li><li> 일 3, 6, 9 및 12은 수확 후 신선한 MDM 매체 200 μl를 추가, 각 뜨는 200 μl, 바이러스 감염의 시작에 따라. Fortin 외 10. 따라 엘리사하여 주요 HIV-1 p24 capsid 단백질의 quantitation 위해 -20 ° C에서 수확 supernatants 보관하십시오. </li></ol> 7. 단일 사이클 바이러스 인코딩 루시페라제있는 MDM의 감염 <ol><li> R + (- MDM에서 HIV-1 유전자 발현에있는 기생충의 영향을 결정하기 위해서는, 10 NG p24 (MDM 매체 300 μl)을 NL4.3 루크 + 환경을 하나의, 그림 1B에서 설명한 방식에 따라, 추가 VSV-G), NL4.3 루크 + 환경을 - R + (JRFL 유럽 표준안) 또는 NL4.3 루크 +유럽 ​​표준안 - 해당 우물의 R은 + 바이러스. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 2 시간을 품어. </li><li> 내독소없는 PBS 3 회 600 μl로 세포를 씻어, 부드럽게 PBS를 추가하고 즉시 기음. 잘마다 신선한 MDM 매체 600 μl를 추가합니다. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 품어. </li><li> 매체 72 시간 다음과 같은 감염을 제거하고 용해 버퍼 1X (루시페라제 분석 키트와 함께 제공되는) 200 μl를 추가합니다. 세포가 부드러운 진동과 함께 실온에서 lyse하자. -20 ° C.에 저장 </li><li> 접시를 해동하고 96 잘 luminometer 플레이트에 lysate 40 μl를 전송, 루시페라제 기판의 100 μl을 (루시페라제 분석 키트와 함께 제공)을 추가하고 제조 업체의 지침에 따라 luminometer에서 루시페라제 (반딧불 루시페라제) 활동을 측정합니다. </li></ol> 8. 대표 결과 우리의 공동 감염 모델을 사용하여, 우리는 그 exposur를 보여P.의 전자 MDM의 falciparum는 HIV-1 감염에 그들의 자화율을 낮춥니다. 실제로 상당한 감소 (P는 &lt;0.05, 2 방법으로 ANOVA, 하루에 12)와 같은 표면에 뜨는에서 HIV-1 p24 capsid 단백질에 의해 측정된 바이러스 입자의 릴리스는, 기생충 (그림 2A)와 pretreated MDM에서 관찰된다. 이러한 관찰은 루시페라제-리포터 유전자를 인코딩 바이러스에 감염된 세포에 확인됩니다. 외인성 VSV-G 또는 HIV-1 glycoproteins 중 하나를 품고 같은 바이러스와 MDM 감염은 P.에 노출된 세포에서 현저하게 (P &lt;0.05, 학생의 T-테스트) 이하 루시페라제 생산에 이르게 falciparum (그림 2B). 그것은 VSV-G-pseudotyped 바이러스들이 JRFLenv 대응보다 훨씬 큰 루시페라제 활동을 발생한 주목할만한이며 이것은 VSV-G pseudotyped 입자 15보다 감염의 효율성 때문입니다. 기생충 박람회가 MDM의 영향으로 바이러스의 두 유형이 그것이 바이러스성 유전자 전처의 일부 단계에 영향을 미치는 것이 좋습니다 것을 감안할 때pression (그림 2B). 그것은 그 세포 생존 능력이 지켜지 억제가 세포 사망으로 인한 구체적이고 없다는 것을 나타냅니다 iRBC (데이터가 표시되지 않음)으로 MDM 박람회에 의해 영향을받지되었다 언급하는 것도 중요하다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" /> 1 그림. 완전 replicative 바이러스와 MDM 감염) 플레이트 체계 모의 :. 감염되지 않은 세포. uRBC : 감염되지 않은 적혈구에 노출 세포. iRBC : Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구에 노출 세포. 발 :. NL4.3Bal 유럽 표준안 발 / uRBC에 감염된 세포 : 세포 uRBC에 노출하고 NL4.3Bal 유럽 표준안 발 / iRBC 감염 :.. MDM 감염 iRBC 및 NL4.3Bal 유럽 표준안 B로 감염된에 노출된 세포) 플레이트 방식으로 단일 사이클 루시페라제 인코딩 바이러스 모의 :. 감염되지 않은 세포. uRBC : 감염되지 않은 적혈구에 노출 세포. iRBC : 전지는 Plasmodium falciparum-I에 노출적혈구를 nfected. Δenv : NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + JRFL :. NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + (JRFL 유럽 표준안). vsv-G : NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + (vsv-G) Δenv / uRBC :.. 세포 uRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을-R + Δenv / iRBC 감염 : 세포 iRBC에 노출 그리고 NL4.3 루크 + 환경을 감염 - R + JRFL / uRBC : uRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + (JRFL 유럽 표준안).. JRFL / iRBC : iRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + (JRFL 유럽 표준안). vsv-g/uRBC : uRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + (vsv-G) vsv-g/iRBC :. 전지 iRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염 - R + (vsv-G). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/&gt; 그림 2. 4. 시간을 위해 MDM)과 광범위하게 씻겨 : MDM의 HIV-1 바이러스 제작에 대한 Plasmodium falciparum의) 효과 MDM이 비율은 75:1 (uRBC / iRBC에서 uRBC 또는 iRBC에 노출되었다. 세포는 2 시간에 대한 p24 NL4.3Bal 유럽 표준안의 10ng에 감염되었다. 바이러스성 생산 초기 바이러스 감염에 따라 다른 시간 지점에서 셀 - 무료 뜨는에서 HIV-1 p24에 대한 엘리사에 의해 감시되었다. . 대표 실험은 MDM의 HIV-1 바이러스의 전사에 대한 Plasmodium falciparum의 B) 효과를 보이고있다 MDM이 비율은 75:1 (uRBC / iRBC에서 uRBC 또는 iRBC에 감염되었습니다. MDM). 루크 + 환경을 R + (JRFL 유럽 표준안) 또는 NL4.3 - - R + NL4.3 루크 + 유럽 표준안 - 셀 그런 다음 단일 사이클 바이러스의 p24의 10ng (중 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 R + (vsv- G)). 루시페라제 표현이 세포는 초기 바이러스 감염에 따라 72 시간을 lysates에서 평가되었다. 대표 실험이 나타납니다.

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V., Arese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+human+red+blood+cells+by+human+monocytes:+involvement+of+immune+and+nonimmune+determinants+and+dependence+on+parasite+developmental+stage.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage.</a> Blood. 80, 801-808 (1992).</li><li>Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+CD34++cells+with+a+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+retroviral+vector+pseudotyped+with+vesicular+stomatitis+virus+envelope+glycoprotein+G.">High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G.</a> J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).</li><li>Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network.">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리는 바이러스성 유전자 발현이나 단핵구 파생 macrophages의 자손 바이러스 생산과 복제 중 하나를 분석하여 HIV-1 바이러스 사이클, 즉에서 말라리아 기생충의 영향을 분석하는 두 가지 방법을 그림했습니다. 비슷한 접근 방식은 다른 HIV-1-기생충 공동 감염 16에 사용되었습니다. 그러나 이러한 새로운 데이터는 말라리아 - HIV-1 감염의 공동 조사에서 앞으로 단계입니다. . 실제로 Diou 외 8 HIV-1 복제에 hemozoin의 영향 살지 기생충을 연구, 우리의 결과와 합의, 그들은 MDMs hemozoin는 MDM에 의해 바이러스 생산을 억제하기 위해 자체는 충분한 것을 관찰하고, 아닙니다. 설명 실험적 레이아웃을 사용하여, 우리는 관찰 그 P. falciparum은 macrophages의 HIV-1 replicative 사이클에 대한 명확한 해로운 영향을 미치는 : 바이러스성 생산의 중요한 억제가 macrophages 기생충에 미리 노출에서 관찰된다 (Figur전자 2A) 및 바이러스성 전사에 기생충의 구체적인 영향은 그림 2B에 그림 있습니다. 그러나 바이러스성 항목이나 핵융합 기생충의 추가 효과 (decapsidation), 또는 단백질 합성 또는 바이러스성 입자 조립 및 신진 등 사후 통합 메커니즘,에서를 떠날 수 없어요. 또한, 그것은 기생충이 바이러스와 동일한 시간 또는 다음 MDM 감염에 하나 추가된 경우 HIV-1 복제에 다른 영향을받을 것이 가능합니다. 우리는 시험 관내 공동 감염 모델에서 HIV-1 / P. 대한 세부 조사를 수행하는 강력한 도구를 제공합니다 숙주 세포의 상호 작용 falciparum. 예를 들어, 대상 및 바이러스성 retrotranscription와 숙주 세포의 게놈에 바이러스성 게놈 통합에 대한 구체적인 절차를 정할 수있는 정량 실시간 PCR, 같은 다른 기술을 사용하여이 실험적인 레이아웃의 조합은 아주 가능하며 추가 insi를 양보해야공동 감염에 관여하는 메커니즘에 ghts. 또한, 구체적인 assays 더욱 바이러스성 복제에 대한 효과를 분석하는이 기본 프로토콜에 적용할 수있는 바이러스성주기 (바이러스성 융합, decapsidation, 입학 quantitation)의 초기 단계를 평가합니다. 실제로도 표준 HIV-1 반전 transcriptase의 quantitation의 assays는 알만 HIV-1 p24 위해 엘리사를 대체할 수있는 삼중 수소 - 라벨이 세포핵을 사용하여 이러한 수정이 프로토콜은 HIV-1 quantitation 및 검출에 관한 방법에 유연성을 보여줍니다. MDM 이외에도, 우리는 우리의 시스템이 다른 세포 유형과 같은 monocytes와 돌기 세포와 같은 HIV-1-말라리아 상호 작용에 대한 관련성이 높은 적응력을 기대합니다. MDM은 자기편 세포가있다는 사실은 어떤 macrophages를 제​​거하지 않고도에서 촬영되지 않았거나 MDM과 접촉에 그 iRBC 밖으로 세척 용이를 위해 수 있도록, 그들의 조작을 용이하게합니다. 이러한 이점은 SE를 복잡하게, 정직에서 배양해되어 돌기 세포 및 monocytes, 사용자에게 적용되지 않을 것입니다같은 세포가 우리가 현재이 문제를 해결하고있는 uRBC 및 무료 iRBC의 paration. Google 시스템은 또한 이러한 공동 배양 실험에서 CD4 양성 T 세포 같은 다른 면역 세포에서 HIV-1 바이러스의 생리주기에 Plasmodium 노출 단핵구 파생 세포의 효과와 같은 더 복잡한 상호 작용을 연구하는 데 유용할 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 프로토콜은 P.의 효과를 보는 실험에 적합 될 수 HIV-1에 감염된 개인을위한 PBMC에서 HIV-1 재가입에 falciparum의 iRBCs. 윤리 명세서 인간의 PBMC는 센터 Hospitalier 드 난 Université 라발 연구 센터 생명 윤리위원회의 지침에 따라, 건강한 기증자의 혈액에서 얻은되었다. 서면동의 모든 혈액 기증자로부터 얻은 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Multicell </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-내독소 무료 </td><td> 시그마 </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Wisent </td><td> 080-150 </td><td> 30 분 동안 56 ° C에서 열 inactivated </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> RPMI 1640에 녹아있는, 필터 - 살균 </td></tr><tr><td> 림프구 분리 매체 </td><td> Multicell </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> 화이트 luminometer 플레이트 </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> CS Mac에서 분리 columms </td><td> Miltenyi 생명 공학 </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> VarioMacs 분리기 </td><td> Miltenyi 생명 공학 </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 </td><td> Wisent </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스크레이퍼 (25 ㎝) </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1830 </td><td></td></tr><tr><td> 24 음 세포​​ 배양 플레이트 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 X 20mm 배양 접시 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> Genscript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 혈청 AB + </td><td> 밸리 바이오 메디컬 </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Wisent </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hypoxanthine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> 루시페라제 분석 시스템 </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 적혈구 </td><td></td><td></td><td> 획득은 철이 혈액 은행에서 정화. </td></tr></tbody></table>

an in vitro co-infection model to study plasmodium falciparum-hiv-1 interactions in human primary monocyte-derived immune cells

Plasmodium falciparum, 말라리아의 가장 치명적인 형태의 원인이되는 에이전트, 인간 면역 결핍 바이러스 타입 -1 (HIV-1)은 연간 1 천 4 백 사망자의 총 책임이되고, 세계적으로 가장 중요한 건강 문제 중입니다. 특히 개발 지역, 사하라 사막 이남의 아프리카, 말라리아와 HIV-1과 공동 감염은 흔히 있지만,이 두 질환 사이의 상호 작용에서 자신의 광범위한 중복으로 인해이 저조한 이​​해된다. 역학 보고서 말라리아 감염이 transiently HIV-1 복제를 강화하고 공동 감염된 개인 2,3에서 HIV-1 바이러스 부하를 증가 것을 제안했습니다. 이 viremia가 antimalarials 치료 후 몇 주 동안 높은 유지하기 때문에,이 현상은 질병의 진행 및 전송에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 관측 뒤에 세포 면역 메커니즘은 기뻐서 연구되지 ​​않았습니다. 시험 관내 연구 investig의 몇HIV-1에 대한 말라리아의 영향을 ating 것은 용해 말라리아 항원에 대한 노출이 면역 세포에서 HIV-1 감염 및 재활 성화를 높일 수있다는 증명하고있다. 그러나 이러한 연구는 P. 전체 세포 추출물을 사용 falciparum schizont 단계의 기생충 및 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC), 말라리아 구성 요소 (들)이 관찰된 효과와 어떤 대상 호스트 세포가 4,5 줄에 책임이있는 해독하기 어렵다 만들기. 최근 작품은 macrophages 8 HIV-1 감염을 감소하는 말라리아 색소 hemozoin에 미숙 단핵구 파생 돌기 세포의 노출은 CD4 + T 세포 6,7에 HIV-1을 전송하는 능력을 증가하는 입증했지만했다. 이 복잡​​한 과정, 말라리아 기생충과 다른 관련성이 인간의 기본 세포 인구의 HIV-1 사이의 상호 작용의 체계적인 분석에 대해 설명해 주실 매우 필요합니다. H의 영향을 조사하는 몇 가지 기법미생물의 phagocytosis와 HIV-1 복제에 같은 병원균의 효과에 대한 IV-1은 설명했습니다. 우리는 여기서 P.의 효과를 조사할 수있는 방법을 제시 인간의 기본 단핵구 파생 macrophages에서의 HIV-1의 복제에 falciparum에 감염된 적혈구. 감염된 macrophages에 의해 발표된 바이러스의 수량에 대한 효과를 측정에 의해 결정되는 동안 HIV-1 transcriptional / translational 이벤트 기생충 노출의 영향은 루시페라제 리포터 유전자는 환경을 유전자를 교체하였습니다하는 단일 사이클 pseudotyped 바이러스를 사용하여 감시하고 있습니다 셀 supernatants에 엘리사에 의해 p24 HIV-1 capsid 단백질.

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An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

우리는을 개발했습니다<em&gt; 체외에서</em의 영향을 연구하기&gt; 말라리아 - HIV-1 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; 인간의 기본 단핵구 파생 macrophages의 HIV-1 replicative주기에. 이 다재 다능한 시스템은 쉽게 HIV-1 감염에 감염될 다른 일차 전지 종류에 적응하실 수 있습니다.

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

an-vitro-co-infection-model-to-study-plasmodium-falciparum-hiv-1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

13.6K 조회수.  CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada. 우리는을 개발했습니다 체외에서 말라리아 - HIV-1 공동 감염 모델 Plasmodium falciparum 인간의 기본 단핵구 파생 macrophages의 HIV-1 replicative주기에. 이 다재 다능한 시스템은 쉽게 HIV-1 감염에 감염될 다른 일차 전지 종류에 적응하실 수 있습니다.

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Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

연구

면역학 및 감염병학

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.