Bu çalışma Catalyst Co-enfeksiyonlar ve Co-morbiditeler hibe yoluyla Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. İnsan eritrosit Merkezi Hospitalier de l&#39;Université Laval kan bankası tarafından temin edildi.

Not: HIV-1 ve Plasmodium falciparum ile deneyler uygun biyogüvenlik düzeyi laboratuarlarda yapılmalıdır (parazitler için BSL2 ve BSL3 HIV-1 ve ko-enfeksiyon) ve potansiyel enfekte insan kanı kullanırken özel önlem alınmalıdır. 1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) Arınma (8 ve 9 dayanarak) <ol><li> Antikoagülan (heparin, sitrat, asit sitrat, dekstroz ya sitrat fosfat dekstroz) ile muamele sağlıklı donörlerden (500 ml) taze insan kanı ile başlar. Arındırıcı ve tecrit PBMC ve protokol geri kalanı boyunca ne zaman endotoksin ücretsiz reaktifler kullanın. </li><li> % 70 etanol ile tüp dahil olmak üzere kan torbası, dezenfekte, tüpü kesip dikkatli bir T150 balona kan aktarın. </li><li> 50 ml konik tüp (Ficoll oda sıcaklığına ulaştığını emin olun) başına 15 ml Lenfositler Ayırma Orta (Ficoll) 16 tüpleri hazırlayın.Üstüne taze kan dikkatlice tabakası 30 ml. </li><li> 20 30 dakika için 400 xg&#39;de Santrifüj ° off sonları ile C. </li><li> Santrifüj içinde, tüp başına oda sıcaklığında Hank&#39;in dengeli tuz Çözelti (HBSS) 25 ml ile 8 x 50 ml konik bir tüp hazırlanır. </li><li> Dikkatle HBSS (tüp başına havuzu 2 hücre halkalar) içeren 50 ml tüp için arayüzünde bulutlu hücre halkası (PBMC içerir) aktarın. HBSS ile 50 ml&#39;ye birimleri tamamlayın. </li><li> 20 az 15 dakika boyunca 150 xg&#39;de Santrifüj ° molalar C. </li><li> Bulanık hücre halkasının santrifüjleme sırasında, Ficoll adımı, bir 50 ml konik bir tüp doldurmak için havuz plazmadan sarı bir üst katman toplayabilir. ° C&#39;de 30 dakika süre ile 1800 x g&#39;de 10 dakika dönmeye 56 at 50 ml tüp ısıtarak plazmada tamamlayıcı inaktive. Supernatant (aşamadan sonra orta takviyesi olarak kullanılabilir içeren seyreltilmiş otolog plazma) tutun. </li><li> Dikkatle süpernatan ve resuspen kaldırmakd 50 ml tüp başına HBSS ve havuz 2 pelet 25 ml adım 1.7 &#39;den hücre peleti. 20 ° C&#39;de 8 dk boyunca 300 xg&#39;de Spin </li><li> Dikkatle süpernatantı ve bir 50 ml tüp içinde 10 ml HBSS ve havuzdaki peletler tekrar süspansiyon. </li><li> , Bir kısım atın ölüm değerlendirmek için tripan mavi dışlama gerçekleştirmek ve sonra PBMC sayarız. </li><li> HBSS ve 300 x g hızında 10 dakika döndürme ile 50 ml tam hacim. Süpernatant kaldırmak ve (bir 500 ml kan 400-500 x 10 6 PBMC yaklaşık almalıdır) 5x10 6 hücre / ml &#39;de RPMI 1640 içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol> 2. Monositler-Türetilmiş Makrofajlar (MDM) Farklılaşma (8 ve 9 dayanarak) <ol><li> RPMI 1640 (25 ml / çanak) ile 15 cm yemekleri Tohum yaklaşık 1.25 x 10 8 PBMC. </li><li> Hücreler% 5 CO2 atmosfer ile 37 ° C&#39;de 1-2 saat boyunca izin yapışır. </li><li> Yeni bir balon içerisinde olmayan yapışık hücreleri aktarın ve 15 ml endotoksin içermeyen PBS iki kez (5 plaka yıkayındak, 300 x g). Yapıştırılır hücreler izole monositler vardır. </li><li> Taze izole monositler MDM içine ayırt etmek için izin vermek için,% 5 otolog plazma (adım 1.8) ilave edilmiş RPMI 1640 ortamında, 20 ml ekleyin. Rekombinant insan makrofaj koloni stimüle edici faktör (M-CSF, 25 ng / ml) ve penisilin / streptomisin çözeltisi (PS, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin) eklenir. 2 gün boyunca inkübe, orta değiştirmek ve 37% 5 ° C CO 2 atmosferinde 2-3 ekstra gün inkübe edin. </li><li> Eski orta çıkarın ve endotoksin içermeyen PBS bir kez yıkayın, PBS yavaşça ekleyin ve hemen emdiriniz. Tamamen ayırt MDM ayırmak için, bir% 5 CO 37 ° C&#39;de 15-20 dakika için ~ 7 ml Accutase (Accutase, plastik çanak gelen hücrelerinin ayrılması izin proteaz ve kollajenolitik aktivitesinin bir ticari olarak temin karışımı) ile muamele hücreleri 2 atmosfer, orta zaman hafifçe sallayın. </li><li> (Hücrelerin korunmasına yardımcı olmak için ise her plaka 3-5 ml otolog plazma (Adım 1.8) ekle) kazıma. </li><li> Yavaşça orta 50 ml&#39;lik bir tüp içinde her zaman ve transfer / havuzda hücrelerini kapsayan emin hücreleri kazıyın. </li><li> Mümkün olduğunca çok hücre kurtarmak için endotoksin içermeyen PBS ile plakalar durulayın. </li><li> Süpernatant atmak, 200 xg&#39;de 5 dakika Spin. </li><li> 5 ml MDM kültür ortamı (RPMI 1640% 10 tamamlayıcı-inaktive edilmiş fetal bovin serumu (iFBS), PS, 25 mM HEPES ile desteklenmiş) ve sayım hücreleri (MDM toplam PBMC genellikle 2-8 verim:%) içinde Pastör pipetiyle pelet. Not: MDM bir kısım akım sitometri ile hücre popülasyonu saflık değerlendirmek için bu adımı alınabilecek; genellikle% 99 MDM ekspres CD14 aldı. </li><li> 24-iyi plaka iyi başına MDM kültür ortamı 600 ul Tohumculuk 1x10 5 MDM. </li><li> Enfeksiyonların önce bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. </li></ol> 3. HIV-1 viral Stoklar Üretim ve kantitasyonu <ol><li> HEK293T hücreleri Follo kalsiyum fosfat transfeksiyon kullanarak viral stoklar üretinFortin ve ark kanat protokolü. 10. </li><li> R pHCMV-G + ve 10 ug veya NL4.3 Luc 15 ug - ya NL4.3 Luc + Env 20 ug ile lusiferaz kodlama raportör genini içeren tek bir döngü virüsler, ko-transfekte HEK293T hücreler elde etmek için + Env - R + ve pJRFL env 15 g. + Kontrol glikoprotein eksikliği olan virüsler üretmek için Ar - NL4.3 Luc + Env 30 mikrogram kullanın. Tam replikatif virüsü için NL4.3Bal env 30 ug kullanın. Vektörler pHCMV-G ve pJRFL env sırasıyla, veziküler stomatit virüs zarf glikoprotein (VSV-G) kodlamak ve CXCR5-tropik HIV-1 (NL4.3Bal env farklı) bir. Plazmit ile ilgili ek bilgi 8 elde edilebilir. Plazmidler NIH AIDS Araştırma ve Referans Programı (NIAID, NIH) ile elde edilebilir. </li><li> HIV-1 p24 kapsid proteini 11 için ELISA yöntemi ile tüm viral stokları ölçmekVe kullanmadan önce bunların potansiyel bulaşıcı doğrulayın. Biz TZM-bl göstergesi hücrelerin 12 kullanımı yoluyla virüs stoklarının enfektivite değerlendirmek. </li></ol> 4. Plasmodium falciparum Parazitler Kültür (13 dayanarak) Parazitlerin 4.1 Genel kültür ve bakım <ol><li> P. koruyun % 0.5 (w / v) Albumax II, 25 ug / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640% 4&#39;lük bir hematokrit (25 mM HEPES ve 25 mM NaHCO 3 ile tamponlanmış) de, insan eritrositleri (O kan grubuna +) içinde falciparum 3D7 asexual aşaması parazitler 37 ve at 370μM Hipoksantin azot içinde% 1 oksijen /% 5 karbon dioksit gazı, bir karışımı içinde ° C. </li><li> Parazitemi kültürünün ince yayma yapma ve% 15 Giemsa solüsyonu ile boyanarak izlenebilir. </li><li> Parazitler bir kontrol olarak kullanmak için her zaman olduğu gibi aynı koşullarda bulaşmamış kırmızı kan hücreleri (uRBC) kültürü çanak tutmak. Geç dönem parasit elde etmek içines (trofozoit / erken şizont), aşağıdaki gibi parazitler senkronize: </li></ol> 4.2 Parazit senkronizasyon <ol><li> Sabah, 300 xg&#39;de, spin 5 dk parazit kültürü hasat ve supernatant atın. </li><li> % 5 (a / h) 37 ° D-sorbitol ve inkübe 5 dakika ile 5 ° C hematokrit in Pastör pipetiyle pelet </li><li> 300 x g hızında 5 dakika çevirin, 30 ml kültür ortamı içinde yüzen, Pastör pipetiyle pelet atmak ve inkübatör geri koyun. </li><li> Yaklaşık 8 saat sonra, tekrar sıkıca senkronize parazitleri almak için 4.2.3 4.2.1 adımları yineleyin. Geç evre parazitler (trofozoit / erken şizont) sonra deney gerçekleştirmek için ertesi sabah hasat edilebilir. Önce arıtma için, yaşam döngüsü aşamasında onaylamak için Giemsa boyama gerçekleştirin. </li></ol> 4.3 Plasmodium falciparum bulaşmış kırmızı kan hücreleri (iRBC) arıtma <ol><li> % 70 etanol ve p VarioMacs ayırıcı (stand ve mıknatıs) sterilizebiyolojik başlık altında dantel. </li><li> CS sütunun altına üç yollu Fix. </li><li> Miltenyi özel kesici iğne plastik koruyucusu sonunda kesin ve musluk altına iğne düzeltmek. </li><li> Dikkatli bir mıknatıs içine sütun kilitleyin. </li><li> Yavaş stopcock sol tarafında vidalı kiti-ekteki şırınga ile MDM kültür ortamı 10 ml enjekte edilerek sütundaki tüm hava kabarcıkları çıkarın. </li><li> ~ 20 ml MDM besiyeri ile sütun yıkayın. </li><li> Kültürü plakası ile hasat alyuvar, 10 ml MDM ortamı (300 x g, 5 dakika) ile bir kez yıka, 12 ml MDM kültür ortamında RBC pelletini. Yavaşça sütun eklemek ve (trofozoit veya şizont aşamada parazit içeren enfekte kırmızı kan hücreleri nedeniyle hemozoin kristallerinin varlığı manyetik alan tarafından muhafaza edilecektir) ile süspansiyon akmasına izin ver. </li><li> 20 ml besiyeri ile bir kez yıkayın ve sütun üstüne beyaz disk ulaştığında sıvı akışı durur. </li><li>12 ml MDM kültür ortamı ile temiz bir steril bir tüp içinde manyetik ve elüt edilmesi iRBC den Sütun çıkarın. </li><li> Smear, bir geri iRBC bir tablet ve Giemsa yaşam döngüsü aşamasında onaylamak için boyama gerçekleştirin. </li><li> Bir haemocytometer (izole RBC% 100 iRBC vardır) kullanılarak geri iRBC sayın. </li><li> Pelet hücreleri (300 xg, 5 dk), süpernatant atın ve 500 ul taze AB + insan serum (opsonisation adım 14) ile hücre tedavisi. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Istenen konsantrasyonuna iRBC 10 ml MDM kültür ortamına (300 x g, 5 dakika), ve Pastör pipetiyle ile bir kez yıka. Genellikle,% 10 parazitemi 15 cm kültür çanak kabaca ~ 0.5-1x10 8 sıkıca senkronize iRBC verir. </li></ol> 5.. Plasmodium falciparum için MDM Pozlama <ol><li> 75:1 MDM: uRBC ya iRBC için MDM ortaya çıkarmak için, hücreler uRBC / iRBC bir oranı elde etmek için MDM kültür ortamı içinde tekrar süspanse edilmesi gerekir. Daha önce deMDM içeren hazırlanmış 24-iyi plakaları, her kuyuya uygun eritrosit süspansiyonu hacmi ekleyin. Üç nüsha halinde tüm deney yapın. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de 4 saat süreyle inkübe co-kültürler. </li><li> Endotoksin içermeyen PBS 3 kez 600 ul hücreleri yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. </li><li> Geriye kalan eritrosit lyse için, 20 sn ve aspirasyon için buz steril su, 200 ul ilave edilerek kuyu yıkanır. </li><li> 600 ul kültür ortamı MDM ekleyin ve bir 5% 2 CO atmosferinde 37 ° C &#39;de 24 saat inkübe edilir. </li></ol> 6. Bir Tam Replikatif HIV-1 ile MDM Enfeksiyon <ol><li> P. etkisini değerlendirmek için MDM HIV-1 çoğaltma falciparum, Şekil 1A, uygun kuyulara NL4.3Bal env virüslerin p24 ve 10 ng (MDM ortam 300 ul içinde) belirtilen şemasına göre, eklemek; kontrolü kuyu sadece orta MDM ekleme . </li><li> Bir 5 içinde 37 ° C&#39;de 2 saat inkübe% 2 atmosfer CO. </li><li> Endotoksin içermeyen PBS 3 kez hücre yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. De başına taze MDM orta 600 ul ekleyin. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Gün 3, 6, 9 ve 12 hasat daha sonra taze MDM orta 200 ul ekleyerek, her bir 200 ul süpernatan, viral enfeksiyonun başlangıç ​​takiben. Fortin ve ark. 10 takiben, ELISA ile büyük HIV-1 kapsid p24 proteini kantitatif için -20 ° C &#39;de hasat edilmiş süpernatanlar tutmak. </li></ol> 7. Tek Döngü Virüs Kodlama Lusiferaz ile MDM Enfeksiyon <ol><li> R + (- MDM HIV-1 gen ifadesi üzerindeki etkisi parazit belirlemek amacıyla, 10 ng p24 (MDM orta 300 ul içinde) NL4.3 Luc + Env birinin, Şekil 1B özetlenen şemasına göre, ekleme VSV-G), NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) veya NL4.3 Luc +Env - ilgili kuyularda R + virüsler. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de 2 saat inkübe. </li><li> Endotoksin içermeyen PBS 3 kez 600 ul hücreleri yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. De başına taze MDM orta 600 ul ekleyin. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Orta 72 saat aşağıdaki enfeksiyonu temizlemek ve lizis tamponu 1X (lusiferaz kit ile birlikte) 200 ul ekleyin. Hücreler nazik çalkalama ile oda sıcaklığında lyse edelim. -20 ° C de saklayınız </li><li> Plaka çözülme ve 96-iyi luminometre plakasına lizatı 40 ul aktarmak; lusiferaz substrat 100 ul (lusiferaz kit ile birlikte) ekleyin ve üreticinin talimatlarına bir luminometreye lusiferaz (Ateşböceği lusiferaz) aktivitesini ölçmek. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Co-enfeksiyon modeli kullanarak, bu exposur göstermekP. e MDM için falciparum HIV-1 enfeksiyonu onların duyarlılık azalır. Gerçekten de, önemli bir azalma (p &lt;0.05; 2 yönlü ANOVA, günde 12) olarak süpernatant HIV-1 p24 kapsid proteini ile ölçülen viral parçacıkların, sürümünde, parazitler (Şekil 2A) ile ön tedavi MDM görülmektedir. Bu gözlem, bir lusiferaz-raportör gen kodlayan virüsler tarafından enfekte olmuş hücrelerin içinde onaylanır. Eksojen VSV-G veya HIV-1 glikoprotein ya barındıran bu tür virüsleri ile MDM enfeksiyonu P. maruz kalan hücrelerdeki düşük (p &lt;0.05, Student t-testi) daha az lusiferaz üretime yol açar falciparum (Şekil 2B). Bu VSV-G-pseudotyped virüsler bunların JRFLenv muadilleri den çok daha büyük lusiferaz aktivitesi vermiştir dikkati çekmektedir; Bu VSV parçacıkları-G pseudotyped 15 arasında daha büyük verimlilik enfeksiyonu nedeniyle. Parazit fuar MDM etkileri virüsler, her iki tür, bu viral gen eski bazı adımı etkilediğini düşündürmektedir göz önüne alındığındapression (Şekil 2B). Bu kadar hücre canlılığı gözlenen inhibisyon hücre ölüm nedeniyle belli değil, belirten, iRBC (veriler gösterilmemiştir) MDM fuar etkilenmedi söz etmek de önemlidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" /> Şekil 1.. Tam replikatif virüs MDM enfeksiyonu için) Levha şeması Mock:. Olmayan hücrelerde. uRBC: Enfekte olmayan kırmızı kan hücreleri maruz kalan hücreler. iRBC: Plasmodium falciparum bulaşmış kırmızı kan hücrelerinin maruz kalan hücreler. Bal:. NL4.3Bal env Bal / uRBC ile enfekte hücreler: Hücre uRBC maruz kalan ve NL4.3Bal env Bal / iRBC ile enfekte:.. MDM enfeksiyon için iRBC ve NL4.3Bal env B ile enfekte maruz kalan hücreleri) Levha şeması ile tek çevrim lusiferaz kodlama virüs Mock:. olmayan hücrelerde. uRBC: Enfekte olmayan kırmızı kan hücreleri maruz kalan hücreler. iRBC: hücreleri Plasmodium falciparum-i maruzkırmızı kan hücreleri nfected. Δenv: NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücreler - R + JRFL:. NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücreler - R + (env JRFL). vsv-g: NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (vsv-g) Δenv / uRBC:.. hücreleri uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC ile enfekte: hücreleri iRBC maruz ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte - R + JRFL / uRBC: uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (JRFL env.). JRFL / iRBC: iRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (vsv-g) vsv-g/iRBC:. hücreleri iRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte - R + (VSV-g). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/&gt; Şekil 2. . 4 saat MDM) ve yaygın yıkanmış: A MDM HIV-1 viral üretim Plasmodium falciparum ile) Etkisi MDM bir oran 75:1 (uRBC / iRBC az uRBC veya iRBC maruz bırakıldı. Hücreler 2 saat boyunca p24 NL4.3Bal env 10ng ile enfekte edilmiştir. Viral üretimi başlangıç ​​viral enfeksiyon sonrası farklı zaman noktalarında hücre içermeyen yüzer kısım, HIV-1 p24 için ELISA ile takip edildi. . Bir temsilci deney MDM HIV-1 viral transkripsiyon üzerine Plasmodium falciparum B) etkisi gösterilmiştir MDM bir oran 75:1 (uRBC / iRBC az uRBC veya iRBC ile enfekte edildi. MDM). Luc + Env R + (JRFL env) veya NL4.3 - - R +, NL4.3 Luc + Env - Hücreler daha sonra tek çevrim virüs p24 ile 10ng (ya NL4.3 Luc + Env ile enfekte olan R + (vsv- g)). Lusiferaz ifade hücre ilk virüs enfeksiyonunu takiben 72 saat lizatları değerlendirildi. Temsili bir deneyde gösterilmiştir.

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2005).</li><li>Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+concentration+of+HIV-1-RNA+in+the+blood+of+adults+in+rural+Malawi:+a+prospective+cohort+study.">Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study.</a> Lancet. 365, 233-240 (2005).</li><li>Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-malaria+co-infection:+effects+of+malaria+on+the+prevalence+of+HIV+in+East+sub-Saharan+Africa.">HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).</li><li>Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+antigen-induced+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+is+mediated+through+induction+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha.</a> J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).</li><li>Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+malaria+antigens+renders+mononuclear+cells+susceptible+to+HIV+infection+and+re-activates+replication+of+endogenous+HIV+in+cells+from+HIV-infected+adults.">Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults.</a> Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).</li><li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+derived+from+hemozoin-loaded+monocytes+display+a+partial+maturation+phenotype+that+promotes+HIV-1+trans-infection+of+CD4++T+cells+and+virus+replication.">Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication.</a> J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).</li><li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+hemozoin+modulates+susceptibility+of+immature+monocyte-derived+dendritic+cells+to+HIV-1+infection+by+inducing+a+mature-like+phenotype.">Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype.</a> Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).</li><li>Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+the+malaria+pigment+hemozoin+renders+human+macrophages+less+permissive+to+HIV-1+infection.">Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection.</a> Virology. 395, 56-66 (2009).</li><li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+macrophages.">Isolation and culture of human macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).</li><li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity.">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li><li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4(+)-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue,+a+major+site+of+replication+in+vivo.">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li><li>Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+(T-20)+monotherapy.">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193, 673-675 (1976).</li><li>Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+human+red+blood+cells+by+human+monocytes:+involvement+of+immune+and+nonimmune+determinants+and+dependence+on+parasite+developmental+stage.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage.</a> Blood. 80, 801-808 (1992).</li><li>Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+CD34++cells+with+a+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+retroviral+vector+pseudotyped+with+vesicular+stomatitis+virus+envelope+glycoprotein+G.">High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G.</a> J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).</li><li>Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network.">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz viral gen ekspresyonu veya monosit kökenli makrofajlar döl virüs üretim ve çoğaltma ya da analiz ederek, HIV-1 viral döngüsü, yani üzerinde sıtma parazit etkisini analiz etmek için burada iki farklı yaklaşım gösterdik. Bu yaklaşım, diğer HIV-1-parazit co-enfeksiyonların 16 için kullanılmıştır. Ancak, bu yeni veriler sıtma, HIV-1 co-enfeksiyonların soruşturma ileri bir adımdır. . Nitekim, Diou ark 8 HIV-1 çoğaltma hemozoin etkisi, canlı değil parazitler, okudu; bizim sonuçlarımız ile anlaşarak, onlar MDMs hemozoin MDM viral üretimini önlemek için tek başına yeterli olduğu gözlendi, değil. Açıklanan deney düzeni kullanarak, gözlenen P. falciparum makrofajlarda HIV-1 replikatif döngüsü net bir zararlı etki gösterir: viral üretimin önemli bir inhibisyon makrofajlar parazitleri için önceden maruz görülmektedir (Figüre 2A) ve viral transkripsiyon üzerine parazit belirli bir etkisi Şekil 2B &#39;de gösterilmiştir. Ancak, viral giriş veya füzyon üzerinde parazit Ek etkileri (decapsidation), ya da protein sentezi veya viral partikül montaj ve tomurcuklanma gibi post-entegrasyon mekanizmalarının üzerinde terk edemez. Dahası, parazit virüs ile de aynı zamanda ya da aşağıdaki MDM enfeksiyon ya da ilave edildi halinde HIV-1 replikasyon üzerinde farklı bir etki elde edilebilir olasıdır. Bizim in vitro ko-enfeksiyon modelinde HIV-1 / P. detaylı incelemeler gerçekleştirmek için güçlü bir araç sağlar konak hücre içinde falciparum etkileşimleri. Örneğin, hedef ve viral retrotranscription ve konak hücrenin genomu için viral genomun entegrasyon spesifik basamakları ölçmek için niceliksel gerçek zaman PCR, diğer teknikler ile, bu deney düzeni kombinasyonu oldukça mümkün olan ve daha da insi vermelidirco-enfeksiyonları dahil mekanizmalarına ghts. Ayrıca, özel testler ile viral replikasyon üzerindeki etkisini analiz etmek için bu temel protokolü uygulanabilir viral döngüsü (viral füzyon, decapsidation, giriş kantitatif) erken adımları değerlendirmek. Hatta çok standart HIV-1 revers transkriptaz kantitatif testler tasavvur HIV-1 p24 için ELISA yerini alabilir trityum etiketli nükleotidleri kullanarak: Bu değişiklikler bu protokol, HIV-1 kantitatif ve algılama ile ilgili nasıl esnek göstermektedir. MDM ek olarak, bizim sistemin diğer hücre türleri, monositler ve dendritik hücreler gibi HIV-1-sıtma etkileşimleri, ilgili adapte olmasını bekliyoruz. MDM yapışmış olan hücrelerin olması, herhangi bir makrofajlar ortadan kaldırmadan, içinde alınmadığı veya MDM ile temas halinde olduğunu iRBC dışarı yıkama kolay izin veren, onların manipülasyon kolaylaştırır. Böyle bir avantaj se komplike, süspansiyon kültürlenmiştir dendritik hücreler ve monositler için geçerli değildirBu tür hücre ve şu anda bu sorunu ele alıyor ile uRBC ve ücretsiz iRBC elde edilmesine. Sistemimizde, aynı zamanda bu gibi co-kültürü deneylerinde CD4-pozitif T-hücreleri gibi diğer bağışıklık hücreleri, HIV-1 viral döngüsünde Plasmodium-maruz monosit-türetilmiş hücrelerden etkiler gibi daha karmaşık etkileşimler incelemek için yararlı olabilir. Son olarak, iletişim kuralı P. etkisini bakarak deneyler için uygun olabilecek HIV-1 ile enfekte bireyler için PBMC HIV-1 reaktivasyonu üzerine falciparum iRBCs. Etik beyanı İnsan PBMC Merkezi Hospitalier de l&#39;Université Laval Araştırma Merkezi Biyoetik Komitesi kurallarına uygun olarak, sağlıklı donörlerin kan elde edildi. Bir yazılı izni tüm kan vericilerden elde edildi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Çok hücreli </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-endotoksin ücretsiz </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Wisent </td><td> 080-150 </td><td> 30 dakika boyunca 56 ° C&#39;de ısıyla inaktive edilmiş </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> RPMI 1640 içinde çözülmüş, filtre ile sterilize </td></tr><tr><td> Lenfosit ayırma orta </td><td> Çok hücreli </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> Beyaz luminometre plakaları </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> CS Mac&#39;ler ayırma columms </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> VarioMacs ayırıcı </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin solüsyonu </td><td> Wisent </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kazıyıcı (25 cm) </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1830 </td><td></td></tr><tr><td> 24-İyi Hücre Kültür Tabaklar </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 20 mm kültür kaplarına </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> Genscript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan serum AB + </td><td> Vadi Biyomedikal </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Wisent </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hipoksantin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Lusiferaz Test Sistemi </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan kırmızı kan hücreleri </td><td></td><td></td><td> Elde edilen Chul kan bankası arınmış. </td></tr></tbody></table>

an in vitro co-infection model to study plasmodium falciparum-hiv-1 interactions in human primary monocyte-derived immune cells

Plasmodium falciparum, sıtma ölümcül formu etkeni ve insan immün yetmezlik virüsü tip-1 (HIV-1) yılda 1 4 milyon ölümlerin toplam sorumlu olmak, dünyadaki en önemli sağlık sorunları arasındadır. Özellikle gelişmekte olan bölgelerde, Sahra-altı Afrika&#39;da, sıtma ve HIV-1 ile ortak enfeksiyonları sık görülür, ama iki hastalık arasındaki etkileşim içinde onların geniş örtüşme nedeniyle yeterince bilinmemektedir. Epidemiyolojik raporları sıtma enfeksiyonu geçici HIV-1 replikasyonunu artırır ve co-enfekte kişilerde 2,3 HIV-1 viral yükü artırdığını ileri sürmüşlerdir. Bu viremi antimalaryaller tedavisinden sonra birkaç hafta boyunca yüksek kalır çünkü, bu fenomeni hastalığın ilerlemesini ve şanzıman üzerinde bir etkisi olabilir. Bu gözlemlerin arkasında hücresel immunolojik mekanizmalar güçlükle çalışılmıştır. In vitro çalışmalar investig içinde birkaçHIV-1 sıtma etkisi ating çözünür sıtma antijenlere maruz bağışıklık hücreleri, HIV-1 enfeksiyonu ve reaktivasyonu artırabilir göstermiştir. Ancak bu çalışmalar P. tam hücre ekstreleri kullanılır falciparum şizont sahne parazitler ve periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC), sıtma bileşen (ler) gözlenen etkileri ve ne hedef ana hücreleri 4,5 olduğu için sorumlu olduğu deşifre etmek zorlaşacak. Son çalışmalar bu makrofajların 8 HIV-1 enfeksiyonu azaldığı sıtma pigment hemozoin için olgunlaşmamış monosit türevli dendritik hücreler maruz CD4 + T hücreleri 6,7 HIV-1 aktarabilme yeteneğine arttırdı, ama oldu. Bu karmaşık süreç, sıtma parazit ve farklı ilgili insan birincil hücre popülasyonlarının HIV-1 arasındaki etkileşimin sistematik bir analizini ışık tutacak eleştirel gereklidir. H etkisini araştırmak için çeşitli tekniklerMikro-organizma fagositozunu ve HIV-1 replikasyon böyle patojenlerin etkisi IV-1 tarif edilmiştir. Burada P. etkilerini araştırmak için bir yöntem sunmak insan birincil monosit kökenli makrofajlar HIV-1 çoğaltma falciparum-enfekte eritrosit. Enfekte makrofajlar tarafından yayımlanan virüs miktarına etkisi ölçülerek belirlenir ise, HIV-1 transkripsiyon / translasyon olayları parazit maruz kalmanın etkisi bir lusiferaz raportör gen Env gen yerini aldığı tek çevrim pseudotyped virüsler kullanılarak izlenir Hücre süpernatanlar ELISA ile p24 HIV-1 kapsid proteini.

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells at JoVE.com

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Biz geliştirdik<em&gt; In vitro</emEtkisini incelemek için&gt; sıtma, HIV-1 ko-enfeksiyon modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Insan birincil monosit kökenli makrofajlar HIV-1 replikatif çevrimi. Bu çok yönlü sistem kolayca HIV-1 enfeksiyonu duyarlı diğer birincil hücre tiplerine adapte edilebilir.

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

an-vitro-co-infection-model-to-study-plasmodium-falciparum-hiv-1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

13.6K Görüntüleme.  CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada. Biz geliştirdik In vitro sıtma, HIV-1 ko-enfeksiyon modeli Plasmodium falciparum Insan birincil monosit kökenli makrofajlar HIV-1 replikatif çevrimi. Bu çok yönlü sistem kolayca HIV-1 enfeksiyonu duyarlı diğer birincil hücre tiplerine adapte edilebilir.

Video: An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.