Nos gustaría dar las gracias a Ann Zimmerman Michael Grimm y por la revisión crítica de este manuscrito y Doug Hamilton, por su apoyo técnico.

1. Flujo tangencial de fibra hueca de ultrafiltración Procedimiento <ol><li> Preparación de tampones y soluciones: La elución de soluciones (1 l): Para 1 L de agua de grado reactivo añadir 0,1 g de polifosfato de sodio, 0,1 ml de Tween-80 y 0,01 ml de antiespumante S-30. </li><li> Preparar el conjunto del filtro (Figura 1) en una cabina de seguridad biológica: <ol><li> Inserte Masterflex I / P 73 tubos de laboratorio a través de una Masterflex I / P cabezal de la bomba Carga fácil conectarse a una Masterflex I / P de la unidad sin escobillas de precisión. </li><li> Fijar el tubo a un 0-60 psi, manómetro lleno de glicerina equipado con una rama TNP conector en T aguas arriba de la cabeza de la bomba con una abrazadera de tornillo, y un conector en T HDPE aguas abajo de la cabeza de la bomba. </li><li> Montar la botella retenido por la instalación de un Nalgene 53-B de llenado / venteo tapa con Masterflex L / S tubo de laboratorio de 15 y un conector en T y lo fija en un 1 botella de Nalgene L polipropileno pesada obligación. </li><li> Montar Masterflex L / S 24 tubos won una pizca de la abrazadera (clamp pizca 2) y conectarlo de la botella de polietileno de alta densidad de retenido a la T-conector. </li><li> Conectar el Masterflex L / S 24 tubos de laboratorio del manómetro a la Kasei Asahi Rexeed 25S de alto flujo dializador con una abrazadera de tornillo, y desde el dializador a la botella retenido. Utilice los productos a medida adaptadores DIN diseñadas para dar cabida a ¼ &quot;tubo de ID para conectar la tubería a la ultrafiltro de fibra hueca. </li><li> Montar Masterflex L / S 24 tubos de laboratorio con una pinza de pellizco (pinch clamp 1) y conectarlo a una pipeta de plástico de 10 ml con el tapón de la punta y el algodón eliminado para actuar como la línea de absorción de la muestra y luego conecte el tubo de polietileno de alta densidad a la T- conector. </li><li> Colocar un extremo del tubo Masterflex laboratorio L/S-36 con una rampa de abrazadera y conecte la tubería al puerto efluente situado cerca del extremo de salida del filtro. Coloque el otro extremo en el contenedor de desechos. </li></ol></li><li> Añadir 0,01% (w / v) de polifosfato de sodio a la muestra 10 L de agua y se mezcla durante 3 min. </li><li> Cierre la abrazadera pizca 2y quitar la tapa de ventilación de la botella retenido. Todas las abrazaderas de otros deben estar abiertos. </li><li> Ajuste la dirección de la bomba para mover el fluido desde el conector en T para el manómetro de presión (a la derecha a izquierda Figura siguiente 1). Ajustar la velocidad de la bomba a 25% de la velocidad máxima y activar la bomba. </li><li> Cuando la botella está retenido de 2/3 de la abrazadera, una pizca abierto 2 y volver a colocar rápidamente la tapa de ventilación de la botella retenido. Revise todas las líneas y conexiones para garantizar que no haya fugas. </li><li> Lentamente aumentar la velocidad de la bomba a la tasa de filtración deseada (aproximadamente 1,5 l / min), la comprobación de fugas. Usando un cilindro graduado y un metro temporizador o flujo, comprobar la tasa de filtrado del agua que sale desde la línea de efluente (azul L / S 36 tubos en la Figura 1). Las burbujas de aire típicamente pueden formar en el extremo de salida del filtro por lo que es difícil de lograr una presión estable y la tasa de filtración. Esto se corrige apretando la línea de efluente con la mano por un momento. Esta accióngeneralmente coaxial la burbuja de aire al puerto filtrado y para salir a través de la línea de efluente. Repita cuantas veces sea necesario, teniendo en cuenta que las burbujas de aire del tamaño de guisante son a menudo inevitables. </li><li> Supervisar el proceso de filtración. Medir y registrar la presión y la velocidad de filtración según sea necesario. La presión no debe exceder los 20 psi. Se recomienda que la tasa de filtración no debe exceder de 2,0 L / min. Es importante que el volumen de agua en la botella retentato ser controlados para asegurar que nunca se vacía. Es normal que el volumen para aumentar o disminuir ligeramente. Si el volumen de agua retenido en la botella cae por debajo de 1/3 lleno, a continuación, retire la tapa de ventilación y una pizca cerca de la abrazadera 2 en la línea de botella retenido. Llevar el volumen de nuevo a cerca de 2/3 de su capacidad, abra la pinza y volver a colocar rápidamente la tapa de ventilación, lo que garantiza un cierre hermético. Si el volumen retenido en la botella se cae de forma rápida y continua, a continuación, asegurar la tapa de la botella retenido es escaso y la tapa de ventilación es segura en su lugar, y que el tubing es todavía en contacto con la muestra de agua. Si estas cuestiones no se están produciendo, entonces es probable que el sello en la tapa de la botella retenido es malo y debe ser reemplazado. </li><li> Cuando el recipiente de la muestra está vacía, la abrazadera pellizco inmediatamente cerrar 1, reducir la velocidad de la bomba a 20% de su máximo, retirar la tapa de ventilación de la botella retenido y cerrar la pinza rampa. </li><li> Ajuste el volumen de la muestra en la botella de retenido hasta aproximadamente 200 ml por apretar o aflojar la abrazadera de la rampa. Después de que el volumen es de aproximadamente 200 ml, apretar la abrazadera de la rampa de los pasos de elución (1.11 a 1.12). </li><li> Añadir 500 ml de solución de elución para el contenedor de muestras y enjuagar el interior del recipiente. Colocar la pipeta 10 ml conectada a la línea de absorción de la muestra en el recipiente que contiene la solución de elución. Asegúrese de que la abrazadera de la rampa está cerrada. Pinza sujetar una pinza y una pizca cerca de 2 por un momento de elaborar la solución de elución. </li><li> Después de los 500 ml de solución de elución se redacta, Cerca de una abrazadera de apriete y la abrazadera pizca abierto 2. Dejar que la solución de elución para circular durante 5 minutos con una velocidad de bombeo de 20% de su valor máximo. </li><li> Ajustar el volumen de la muestra en la botella retenido a aproximadamente 100 ml por apretar o aflojar la abrazadera rampa en la línea de efluente. Apretar la abrazadera rampa y dejar que la muestra a circular durante 1 minuto. Evite tirar del aire en el tubo, asegurando el volumen de la muestra en la botella retenido es lo suficientemente alta para cubrir la L / S 15 tubos de entrar en la botella retenido. </li><li> Invertir la dirección de la bomba que obliga a la muestra en la botella retenido. Permitir que la bomba funcione en sentido inverso durante 20 segundos resultantes en un total de ~ 225 ml en la botella retenido. Apague la bomba. </li><li> Retire el Masterflex I / P 73 tubo de la cabeza de la bomba y desconectar el medidor de presión. Desconecte el Masterflex L / S 24 tubos de salida de la ultrafiltro de fibra hueca. Mantener la tubería por encima de la botella retenido para obligar a cualquier muestra restante en elretenido botella. </li><li> Desconecte todos los tubos de la botella y coloque la tapa de ventilación con una tapa no-ventilación. </li><li> Continuar con el procedimiento de IMS / IFA con el ~ 225 ml de retenido. </li></ol> 2. Procedimiento de separación inmunomagnética <ol><li> Preparación de tampones y soluciones: <ol><li> Permitir que los topes incluidos en las Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia kit combinado para alcanzar la temperatura ambiente. </li><li> SL-1X tampón A: Añadir 1 ml de 10X SL-tampón A a 9 ml de agua de grado reactivo. </li></ol></li><li> Transferir la ~ 225 ml de líquido de la botella retenido a una etiqueta 250 ml de tubo de centrífuga cónico. Lavar la botella retenido dos veces con 10 ml de agua de grado reactivo, y añadir los enjuagues para el tubo de centrífuga cónico. Centrifugar la suspensión a 1500 xg durante 15 min a 4 ° C sin freno. </li><li> Aspirar cuidadosamente el sobrenadante de la interfase aire-agua a 5 ml por encima de la pastilla embalado por cada 0,5 ml de volumen de precipitado (es decir aspirado a 15 ml por encima de un volumen de pellets de 1,3 ml, y aspirado a 5 ml de una pastilla de 0,5 ml o menos). </li><li> Fondo resuspender el sedimento en el sobrenadante por vórtex y / o una pipeta de mezcla. Transferir cada volumen de 5 ml del líquido a la cara plana Dynal L10 tubo que contiene 1 ml de cada uno de 10X tampón de SL-A y SL-10X tampón B. Lavar el tubo de centrífuga cónico dos veces con 2,5 ml de agua y añadir el reactivo de enjuague para el tubo L10, con lo que el volumen total en el tubo ml L10 a 12, incluyendo los tampones. </li><li> Añadir 100 l cada uno de los bien mezclados Dynabeads resuspendidas contra el Cryptosporidium y Giardia, contra el tubo L10. Girar el tubo L10 a 18 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. </li><li> Coloque el lado plano del tubo L10 contra el imán MPC-6 y la roca suavemente la mano del tubo de extremo a extremo, 180 ° C durante 2 minutos. </li><li> Manteniendo el tubo L10 en el imán MPC-6 con la cara de imán hacia arriba, decantar el sobrenadante lejos de la perla / (oo) quistes complejos bouº al imán. Retirar el tubo L10 del imán y añadir 0,5 ml de 1X SL-tampón A al tubo. Transferir la suspensión mediante dos lavados adicionales de 0,5 ml de 1X SL-tampón A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a cabo en el MPC-S con el imán en la posición vertical. </li><li> Agite suavemente el tubo en el MPC-S del imán 180 ° durante 1 minuto. Con el imán en su lugar, aspirar el sobrenadante utilizando una pipeta Pasteur dirigido a la parte inferior del tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 1 ml de 1X PBS a la parte frontal del tubo de microcentrífuga, eliminar el imán y oscilar suavemente el tubo hasta que las perlas se volvieron a suspender. Sustituir el imán en la posición vertical y mueva suavemente el tubo 180 ° C durante 1 minuto. Aspirar el PBS enjuague, sin perturbar el sedimento talón, utilizando una pipeta Pasteur para eliminar desechos como sea posible. </li><li> Eliminar el imán y añadir 50 l de agua de grado reactivo al lado posterior del tubo de microcentrífuga. Vórtice del tubo a toda velocidad durante 50 segundos,a continuación, se incuba el tubo a 80 ° C durante 10 minutos seguido por un segundo vórtice 30. Sustituir el imán en el MPC-S en la posición inclinada, la unión de las perlas para el imán y dejando los quistes (oo) en el líquido. Aplicar la suspensión del quiste (oo) a una diapositiva SingleSpot bien. </li><li> Repetir paso 2,10, aplicando el líquido al mismo pozo que contiene la primera disociación. Colocar el portaobjetos en una diapositiva 37 ° C más caliente durante 1 hora para secar la suspensión a la diapositiva bien. </li></ol> 3. Tinción y examen <ol><li> Preparación de tampones y soluciones: Solución de trabajo DAPI: Añadir 25 l de solución madre DAPI (2 mg / ml en metanol) a 25 ml de 1X PBS. Tienda de acciones y soluciones de trabajo entre 1 ° C y 10 ° C en la oscuridad. </li><li> Aplicar 50 l de metanol a la diapositiva y así permitir que se seque a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 50 ml de la solución DAPI de trabajo a la diapositiva bien y se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Use un KimwiPE a la mecha de la DAPI del pozo. Aplique 50 l de EasyStain. Incubar a 35 ° C durante 30 minutos. </li><li> Seque la mancha de el pozo con una Kimwipe, y luego, lentamente, añadir 300 l de tampón frío EasyStain fijación, permitiendo que fluya sobre el borde bien. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Use un Kimwipe que absorbe y expulsa el buffer del pozo y aplicar 10 l de medio EasyStain montaje. </li><li> Aplique con cuidado una hoja de cubierta, la eliminación de las burbujas que se producen. Selle la hoja de la cubierta con esmalte de uñas transparente. </li><li> Digitalizar toda la diapositiva utilizando el filtro FITC, en el aumento total de 200X, de ovoides o esférica color verde manzana objetos fluorescentes que se asemejan a un ooquiste o quiste. Examine todos esos objetos con el filtro de DAPI en un aumento total de 1000X y luego con la CID, también en un aumento total de 1000X. Anote el tamaño utilizando un micrómetro ocular calibrado y características morfológicas. </li><li> Documentar los resultados. </li></ol> Nota: información adicionalinformación sobre el procedimiento original se puede encontrar en diciembre de 2005 la versión del método de la EPA 1623 12. El flujo tangencial de fibra hueca de ultrafiltración procedimiento descrito se utiliza en lugar de la sección de 12,0 método EPA 1623. La disociación de calor modifica la Sección 13.3.3 del método EPA 1623. El procedimiento también describe un enjuague adicional PBS durante el proceso de IMS que se puede insertar en la versión de diciembre 2005 Método 1623 después de la sección 13.3.2.16. La lista completa de consumibles, reactivos y equipos utilizados para el método EPA 1623 la inclusión de estas modificaciones se enumeran en la lista de equipo. 4. Los resultados representativos Ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia recuperados a través de los procesos de filtración y separación inmunomagnética se detectan mediante un análisis microscópico. En una ampliación de 200X total, cada organismo exhibe un patrón de tinción típica, el tamaño y la forma como se muestra en la Figura 2 </strong&gt; se observó, además, usando aceite de inmersión con un aumento total de 1000X. Esto permitirá que para la medición y la identificación de cualquiera de las características típicas que definen o características atípicas que descartar una identificación positiva. El Cryptosporidium es un ovoide con objeto esférico de 4 a 6 m de diámetro que exhibe brillantes de color verde manzana de fluorescencia FITC con bordes brillantes señalados (figura 3A ). Con DAPI UV, un ooquiste exhibirá una de las categorías siguientes características típicas: la luz azul que se mancha interna con un borde verde y sin núcleos distintos (DAPI negativo), una intensa coloración interna de azul, o hasta cuatro distintas, de color azul celeste núcleos (DAPI positivo - Figura 3B). Características atípicas incluyen las desviaciones en el color, estructura o DAPI fluorescencia (por ejemplo, núcleos teñidos de más, de color rojo fluorescente las estructuras internas). Si el objeto fluorescente ha cumplido los criterios para la FITC típica y DAPI, se examina por medio de Con interferencia diferencialcontraste (CID). El objeto se examinaron para atípicas características morfológicas externas o internas, tales como la ornamentación de la pared celular, o una o dos grandes núcleos de llenado de la célula. Si las estructuras atípicas no se observan, el objeto se registra en el recuento total de IFA y se categorizan como una estructura amorfa vacío o con uno a cuatro esporozoitos presentes (Figura 3C). Del mismo modo, Giardia-como los objetos son examinados con respecto a la tinción con FITC y DAPI, así como las características de DIC, como axonemas, los organismos de la mediana, y los núcleos de los quistes de Giardia son redondos u ovoides objetos brillantes de color verde manzana, 8 -. 18 micras de largo por 5 - 15 micras de ancho con bordes vivos resaltados (Figura 3D). Con DAPI UV, el quiste de Giardia exhibirá DAPI tinción negativa, o DAPI-positivas características (Figura 3E). El objeto fluorescente es examinado por DIC para las características típicas y atípicas en la misma manera descrita para Cryptosporidium.Si las características atípicas no se observan, el objeto se registra en el recuento total de IFA y la categoría de estructura amorfa que contiene vacíos, o con uno o más tipos de estructuras internas presentes (Figura 3F). Cualquier organismo que se observa que tienen características atípicas no debe ser considerado como un quiste (oo). El análisis microscópico de muestras ambientales puede ser un reto, ya que hay organismos que pueden auto-fluorescentes o de una reacción cruzada con el FITC-conjugado anti-Cryptosporidium y / o anti-Giardia anticuerpos 1. Se recomienda que un analista de estar familiarizado con los microbios acuáticos y decenas de revisión de las diapositivas para ganar experiencia la identificación de Cryptosporidium y Giardia. Por lo menos tres (oo) quistes en la diapositiva de la tinción de control positivo debe ser caracterizado antes de cada período de sesiones en el microscopio. Muestras de control de calidad puede ser enriquecida con (oo) quistes para determinar el por ciento de recOvery para cada protozoo mediante el cálculo: (Oo) quiste porcentaje de recuperación = ((recuento de muestras de control de calidad - Cuenta de la Muestra sin marcar) / Spike) x 100. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Figura 1. Representación gráfica del sistema de ultrafiltración de flujo tangencial de fibra hueca. El tubo está codificada en color para ayudar es el montaje del sistema. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Figura 2. Imagen representativa de fluorescencia de Cryptosporidium y Giardia (oo) quistes. Ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia fueron teñidas con FITC anti-Cryptosporidium / Giardia anticuerpos. Flechas, quistes de Giardia, puntas de flecha, ooquistes de Cryptosporidium. Un total de cuatro ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia seis fueron encontrados en el plano de enfoque. Las muestras observablesed bajo una ampliación de 200X. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . Figura 3 representativas imágenes microscópicas de los ooquistes de Cryptosporidium y quistes Giaridia utilizados para la caracterización de ooquistes de Cryptosporidium (a - c).. Brillante de color verde manzana FITC fluorescencia de objetos esféricos de 4 a 6 micras de diámetro con bordes brillantes resaltados (A) que contiene hasta cuatro distintas, de color azul celeste núcleos con DAPI (B) y de uno a cuatro esporozoitos (S) por ooquistes (C). quistes de Giardia (D - F). Brillante de color verde manzana con FITC fluorescencia de vuelta a los objetos ovoides 8 - 18 micras de largo por 5 a 15 micras de ancho con bordes vivos resaltados (D) que contienen hasta cuatro azul celeste núcleos DAPI (E) y con una o más estructura discernible tales interna como núcleos (N), el cuerpo de la mediana (M) y axonemas o (A) (F). Las flechas blancas y brillantes manzanas verdes ooquistes de Cryptosporidium y tinción de fluorescencia quistes de Giardia walls, puntas de flecha blanca, núcleos DAPI positivas. Las muestras se observa bajo magnificación 1000X.

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La Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos a través de su Oficina de Investigación y Desarrollo en colaboración con la Oficina de Agua Subterránea y Agua Potable del Centro de Apoyo Técnico ha financiado la investigación que se describe aquí. Todo el trabajo fue apoyado en el sitio de la EPA de los EE.UU., Cincinnati, Ohio. Aunque la información descrita en este artículo ha sido financiado en su totalidad o en parte por la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos bajo contrato (Contrato PE-C-06-031) a Shaw Ambiental y de Infraestructura, Inc, no reflejan necesariamente los puntos de vista de la Agencia y ningún endoso oficial debe ser deducido. Se ha sometido a una revisión Agencia y aprobado para su publicación.

De flujo tangencial de fibra hueca de ultrafiltración es una técnica alternativa y eficaz para la concentración inicial de los ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia de agua. Ultrafiltración de fibra hueca es menos costoso que los filtros tradicionales. Puesto que tiene la capacidad de concentrar ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia de una variedad de matrices de agua diferentes, es una alternativa útil para las técnicas de filtración actuales utilizados para el método de la EPA 1623. Como con la mayoría de los otros métodos de filtración, ultrafiltración de fibra hueca es propenso a la suciedad con muestras extremadamente turbios. Presión de agua de alta resultaría de las incrustaciones de filtro, por lo tanto se recomienda para controlar la presión durante la carrera de filtración. Además de ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia, de fibra hueca de ultrafiltración ha demostrado ser capaz de concentrar las bacterias y los virus 1-3,5,8. De fibra hueca de ultrafiltración outlined en este método puede utilizarse para concentrar múltiples organismos en una sola muestra. Es de notar que la obtención de un volumen final entre 200 y 250 ml es el paso crítico final en el procedimiento de concentración para que los pasos de centrifugación extra, que puede provocar la pérdida quiste (oo), se evitan (paso 2,2). Sin embargo, lo que permite que el volumen de la botella a caer demasiado bajo, puede tener efectos desfavorables en las recuperaciones, ya que no será suficiente volumen de líquido para obligar a todos los ooquistes y quistes en la botella retenido. Por lo tanto se recomienda mantener un volumen final entre 200 y 250 ml. El calor de disociación es una alternativa a la etapa de disociación ácida en el Método 1623. Este paso alternativo se ha demostrado que mejora la recuperación de ooquistes de Cryptosporidium y reducir la variación del método, cuando sea aislado de agua de río o reactivo 9. Una comparación lado a lado de ácido y los métodos de calor de disociación demostrado que el uso de calor a la disociaciónte los organismos de las bolas inmunomagnéticas producido las mayores recuperaciones medias de Cryptosporidium y Giardia. Además, la precisión de las recuperaciones de Cryptosporidium y Giardia fue mejor en las muestras procesadas con calor en comparación con la disociación de disociación ácida 9. La incorporación de HFUF como la etapa de concentración permite una mayor flexibilidad al proporcionar la capacidad de concentración de múltiples organismos. Además, es una alternativa menos costosa a las opciones actuales método de filtración 1623.

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipos / Reactivo </td><td> Vendedor </td><td> Catálogo # </td></tr><tr><td> Asahi Kasei Rexeed 25 S / R húmedas de fibra hueca ultrafiltros </td><td> Marque Médico </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73 (Masterflex R-3603), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex curada al platino), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex curada al platino), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex curada al platino), o equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> E / P Precision Drive sin escobillas </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P Easy Load cabeza de la bomba </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Negro T HDPE, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> EE.UU. Plásticos </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-conector L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene pesado pp 1 l botella </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06257 a 10 </td></tr><tr><td> 10 ml pipetas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 a 678-11C </td></tr><tr><td> Nalgene de llenado / venteo de la tapa 1/4 &quot;tubo, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> Manómetro </td><td> Cole Parmer </td><td> Una-680-46-10 </td></tr><tr><td> Acoplamiento recto, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06469 a 18 </td></tr><tr><td> TNP rama de T, natural pp </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30610-75 </td></tr><tr><td> Abrazaderas de manguito, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06833 hasta 00 </td></tr><tr><td> CuStom ajuste DIN adaptadores </td><td> Moldeado Corp Productos </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Anillo de soporte </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> Abrazaderas de soporte de anillo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-769-6Q </td></tr><tr><td> Keck rampa de pinza, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> Polifosfato de sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Sodio tiosulfato pentahidratado </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Antiespumante S-30 emulsión </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L plegable polietileno de alta densidad Cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Centrifugar botellero </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml tubos de centrífuga cónicos </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Embudo desechable </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122-10 </td></tr><tr><td> Botella de lavado </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06252-40 </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Cubo del rotor basculante </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> Centrifugar adaptadores de cubo de 250 tubos cónicos </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 l puntas de pipeta de gran diámetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> Filtro VacuShield </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> Pipetas de 5 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit </td><td> YoDexx </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> 50 ml tubos de centrífuga cónicos </td><td> Halcón </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 tubos caras planas </td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Temporizador </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6 imán </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml pipetas </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1,5 ml de baja adherencia tubos de microcentrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 l pipeta y consejos correspondientes barrera </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 l de pipeta y puntas correspondientes de barrera </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 pulgadas de pipetas Pasteur </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S del imán </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Vórtice </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads mezclador de los rotadores </td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Calor bloque </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Laboratorio de perlas Armor </td><td> Laboratorio de armadura </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Termómetro digital </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Fosfato-tampón salino 1X pH 7,4 (PBS 1X) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Diapositivas individuales al contado </td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Cierre de vidrio </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> EasyStain kit directa </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> L 10 de pipeta y puntas correspondientes de barrera </td><td> Gilson </td><td> P10 y DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-Diamidino-2-fenil indol dihidrocloruro (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Esmalte de uñas transparente </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> El metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Boekel Scientific </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> deslice más cálido </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Aceite de inmersión, Tipo A ND = 1,515 </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> Nikon 90i microscopio con capacidades de DIC </td><td> Nikon </td><td> MBA 77000 </td></tr><tr><td> Plan de APO 100X objetivo de aceite </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Planifique Achro 20X </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> Filtro FITC </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> Filtro de DAPI </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-Cite iluminador de fluorescencia </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Lente de papel </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Bolsa desechable Biohazard </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard recipiente para objetos afilados </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> 3% de peróxido de hidrógeno </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Lejía </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.

Especies de Cryptosporidium y Giardia son dos de los más comunes los protozoos que causan brotes de enfermedades diarreicas transmitidas por el agua en todo el mundo. Para caracterizar mejor la prevalencia de estos patógenos, el Método EPA 1623 fue desarrollada y utilizada para controlar los niveles de estos organismos en el agua potable EE.UU. suministra 12. El método consta de tres partes principales: la primera es la concentración de la muestra en el que se filtra al menos 10 L de agua de la superficie en bruto. Los organismos y restos atrapados se eluyen a continuación del filtro y se centrifuga para concentrar aún más la muestra. La segunda parte del método utiliza un procedimiento de separación inmunomagnética donde se aplica la muestra de agua concentrada a perlas inmunomagnéticas que se unen específicamente a los ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia permitiendo la eliminación específica de los parásitos de los escombros se concentró. Estos quistes (oo) luego se desprende de las partículas magnéticas por un procedimiento de disociación del ácidoDuré. La parte final del método consiste en la tinción de inmunofluorescencia y la enumeración, donde (oo) quistes se aplicó a un portaobjetos, se tiñe y se enumeran con el microscopio. Método 1623 tiene cuatro sistemas de concentración de la muestra lista para capturar los ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia en el agua: Los filtros de Envirochek (Pall Corporation, de Ann Arbor, MI), Envirochek filtros Pall Corporation (AT), filtros Filta-Max (IDEXX, Westbrook, MA), o centrifugación de flujo continuo (Haemonetics, Boston, MA). Sin embargo, Cryptosporidium y Giardia (oo) quistes recuperaciones han variado considerablemente en función de la matriz de las fuentes de agua y los filtros utilizados 1,14. Un nuevo flujo tangencial de fibra hueca de ultrafiltración (HFUF) del sistema se ha demostrado recientemente para ser más eficiente y más robusta a la recuperación de los ooquistes de Cryptosporidium Los quistes de Giardia y de diferentes matrices de agua y, además, es menos costosa que la opción de cápsula de otro filtros, y se pueden concentrar los agentes patógenos de forma simultánea 1-3,5-8,10,11. Además, estudios previos realizados por Hill y sus colegas demostraron que la HFUF mejoró significativamente la recuperación de ooquistes de Cryptosporidium cuando se compararon directamente con los filtros Envirochek AT 4. Las modificaciones adicionales a los actuales métodos también han sido reportados para mejorar el funcionamiento del método. Sustitución del ácido procedimiento de disociación con calor disociación ha demostrado ser más eficaz en la separación de Cryptosporidium de las perlas magnéticas en algunas matrices de 9,13. Este protocolo describe un método modificado 1623 que utiliza el sistema de filtración HFUF nuevo con el calor paso disociación. El uso de HFUF con este método modificado es una alternativa menos costosa que las actuales opciones de filtrado método EPA 1623 y ofrece más flexibilidad al permitir la concentración de múltiples organismos.

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A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Este protocolo se describe el uso de un flujo tangencial de fibra hueca sistema de ultrafiltración concentración de la muestra y una disociación calor como pasos alternativos para la detección de vías acuáticas<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Y<em&gt; Giardia</em&gt; Las especies que utilizan el método EPA 1623.

Una modificación de la EPA Método 1623 que utiliza el flujo tangencial de fibra hueca de ultrafiltración y la Plaza de calor de disociación para detectar a base de agua<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Y<em&gt; Esp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

a-modified-epa-method-1623-that-uses-tangential-flow-hollow-fiber

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

20.3K vistas.  Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency. Este protocolo se describe el uso de un flujo tangencial de fibra hueca sistema de ultrafiltración concentración de la muestra y una disociación calor como pasos alternativos para la detección de vías acuáticas Cryptosporidium Y Giardia Las especies que utilizan el método EPA 1623.

Video: A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocolo Chelex simple para la extracción de ADN a partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

Alto y Bajo Rendimiento pantallas con nematodos- Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Flujo de ácido nucleico cerrado Citometría de fluorescencia In situ</emHibridación> (LNA flujo-FISH): un método para la detección de bacterias pequeñas de ARN

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

Los filtros de lana de vidrio para la concentración de virus transmitidas por el agua y la agricultura patógenos zoonóticos

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Un método simple y eficiente para detectar la activación del factor nuclear en neutrófilos humanos por citometría de flujo

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Imagen basada en Citometría de Flujo Técnica para evaluar los cambios en función de los granulocitos<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Una referencia Caldo método de microdilución para Dalbavancina<em&gt; In Vitro</em&gt; Pruebas de Susceptibilidad de bacterias que crecen en aerobiosis

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...