Usando este procedimiento de purificación y microinyección de esporozoíto, esencialmente cualquier microbio huésped puede ser estudiado en cualquier sistema de órganos derivados del tejido. Usando esta técnica, podemos controlar la cantidad de esporozoítos puros inyectados en el lumen organoide o en el lado apical del organoide. Para purificar los esporozoitos de C.parvum, transfiera el ócicle a un tubo de 15 mililitros y resuspendir las células a una multiplicación por 10 al séptimo ócicle por mililitro de concentración media.
Después de 60 a 90 minutos a 37 grados Celsius, mezcle 14 mililitros de una solución de lavado adecuada con los ovocitos, y sedimente las células por centrifugación. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente para evitar la pérdida de ovocitos y resuspender el pellet esporoico a tres veces 10 al séptimo ovocitos por uno a dos mililitros de concentración DMEM. Para eliminar los ovocitos y conchas restantes, coloque un barril de jeringa de 10 mililitros equipado con un aparato portafiltros de 47 mililitros equipado con un filtro de policarbonato de tres micrómetros de tamaño de poro en un tubo de 15 mililitros a cuatro grados centígrados.
Añadir 7,5 mililitros de la suspensión de esporozoito al conjunto del filtro. Cuando todo el volumen haya pasado a través del colador por gravedad, lave las células restantes a través del colador con otros 7,5 mililitros de DMEM. Cuando todo el lavado haya pasado por el colador, recoja la suspensión de esporozoita filtrada por centrifugación durante 10 minutos y etiquete el pellet en 50 a 100 microlitros de un medio de cultivo organoide apropiado, complementado con un tinte verde 0.05% rápido, y L-glututeno, betaína, L-cisteína, ácido linoleico y tamina que contienen
Para microinjecupar los parásitos en el lado apical de un organoide 3D, utilice primero un tirador de micropipetas para preparar capilares de inyección de vidrio. Utilice fórceps para cortar la punta del capilar a un diámetro de nueve a 12 micrómetros para permitir un flujo fácil de esporozoitos u ovocitos, si decide inyectar ovocitos directamente, y utilice puntas de micro-cargador para llenar cada capilar con un tinte verde rápido etiquetado como ovocitos o suspensión de espozoito. A continuación, cargue el primer capilar lleno de esporozoío en un microinyector y utilice un microscopio invertido con un aumento de 5x y una presión constante a microinyecyject 100 a 200 nanolitros de la suspensión en cada organoide.
El protocolo de excilción da lugar a la liberación de esporozoítos de aproximadamente 70 a 80% de los ovocitos. Por lo tanto, es esencial filtrar las cáscaras de ovocitos restantes a través de una filtración de tres micrómetros. Retire casi el 100% de los ovocitos sin escudrencia.
Además, la adición de un tinte verde ayuda a asegurar la inyección de todos los organoides, y permite la visualización de los organoides inyectados durante al menos 24 horas después de la inyección. Aunque se trata de un método bien practicado, la microscopía electrónica de barrido se puede utilizar para garantizar que el proceso de excistation no dañe a los esporozoítos o a los ovocitos. La inyección de cantidades iguales de ovocitos en el lumen organoide se puede confirmar visualmente mediante imágenes microscópicas simples.
Los ensayos de inmunofluorescencia también se pueden utilizar para explorar los tipos de células infectadas por Cryptosporidium. Después de que los organoides diferenciados se hayan infectado durante cinco días, la presencia de esporozoítos dentro de los ovocitos puede confirmarse secando una porción de los ovocitos en un portaobjetos adhesivo, fijando los ovocitos con metanol y combinando la tinción DAPI con un anticuerpo específico para ovocitos adecuado. Para obtener los máximos resultados, utilice ovocitos frescos, utilice el mismo capilar para todas las inyecciones y cambie los medios todos los días después de la inyección.
Usando esta técnica, varios laboratorios están empezando a usar organoides para estudiar las interacciones huésped-microbio. Estamos estudiando los commensales, así como otros patógenos en entornos de microcultivo organoides similares. Como Cryptosporidium es un parásito humano, es importante realizar estos experimentos de acuerdo con las regulaciones de seguridad de nivel 2.
