Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Fritz Thyssen (10.11.2.153 a RK), el Consejo Alemán de Investigación (DFG, KR2119/3-2 y KR2119/8-1 a RK), el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 a RK) y por una beca doctoral de la Fundación Hertie caridad [a LFB]. Damos las gracias a Carolin Obermaier y Westermeier Julia por su apoyo durante la filmación del video.

1. Biopsia de la Piel y el cultivo de fibroblastos humanos <ol><li> La biopsia de piel tiene que ser tomada por un médico experimentado. El procedimiento se lleva a cabo bajo condiciones estériles y se requiere anestesia local. Los sitios típicos para biopsia son el lado interior de la parte superior del brazo, hombro o espalda baja. </li><li> Usted puede tomar muestras diámetro 4x4mm 6x6mm o por biopsia por punción para obtener suficiente tejido para cultivo de fibroblastos humanos. </li><li> Cortar la biopsia de la piel en la igualdad de las piezas pequeñas bajo condiciones estériles para separarlos en 2-4 matraces T25. Cada frasco debe contener 2-3 piezas de epidermis. El medio de cultivo contiene 15% de FCS, 1,1% de piruvato de sodio y 1% de penicilina / estreptomicina en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio. </li><li> Se incuban las células a 37 º C y 5% CO 2. El tiempo de propagación de espera hasta que los fibroblastos primero crecen fuera de la muestra de la epidermis es de 1-2 semanas. Si los problemas de crecimiento se encuentra, usted puede hacer uso de fa de crecimiento de fibroblastosctor (5-10 ng / ml de FGF2) para mejorar el crecimiento de las células. </li><li> Una vez que una confluencia de células de 50-70% se alcanza, los fibroblastos humanos primarios se pueden congelar. El tiempo de hasta 50-70% de confluencia se alcanza, se diferencia entre las líneas celulares. Congelar los fibroblastos en FCS 90% más 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li></ol> 2. Preparación de fibroblastos humanos para microscopía en vivo imágenes de la célula En general, los experimentos con los fibroblastos humanos se debe realizar con pasajes debajo de 10 como la senescencia asociada a alteraciones pueden cambiar las propiedades de las células después de múltiples pases. En caso de duda, beta-galactosidasa ensayos pueden usarse para evaluar la inducción de procesos de envejecimiento en las células respectivas. En general, no utilizan fibroblastos envejecidos (véase más arriba). Además, para comparar varias líneas celulares, trabajar con el número mismo paso de cada línea celular. Comparación de los diferentes pacientes genéticamente homogéneos en comparación con los controles sanos se recomienda. Sin embargo, como a vecespacientes portadores de mutaciones específicas pueden ser raras, esto puede significar que las biopsias de piel de un solo paciente con un número determinado pasaje y las diferentes líneas de control tienen que ser incluidos - aquí es esencial para asegurar el pasaje mismo número de todas las líneas incluidas. Si una célula confluencia de 50-70% que se alcanza pero está previsto ningún experimento, los fibroblastos se debe congelar. <ol><li> En el primer día del experimento, se lavan los fibroblastos adjuntos una vez con PBS. A continuación, liberarlos de la matraz de fondo mediante el uso de una solución de desprendimiento celular de enzimas proteolíticas DNasa (es decir AccuMax). </li><li> Cuenta tus células y semillas de 50.000-70.000 células en cada pocillo de un cubreobjetos de 4 cámaras (1,8 cm 2 área cultural por pocillo). Por consiguiente, para los coverglas 8-cámara, media del número de células o un poco menos es apropiado (0,8 cm 2 área de cultivo por pocillo). Es importante semillas en lugar de un pequeño número de células para llevar a cabo verdadero sola célula de análisis. Sin revestimiento específico para las cámaras is necesario. </li><li> Después de 24-48 hr, el experimento de formación de imágenes en vivo de células se puede realizar. Asegúrese de que el microscopio de células de imágenes en vivo está equipado con una incubadora que controla la temperatura y los niveles de CO 2. Durante la adquisición de la imagen, una atmósfera de 37 ° C y 5% CO 2 debe mantenerse. </li><li> Cada medición de células de imágenes en vivo debe llevarse a cabo en al menos tres experimentos independientes. En total, un mínimo de 50 células por línea celular debería ser reflejado. Los experimentos de formación de imágenes de células vivas, así como el análisis fuera de línea tienen que realizarse de forma ciega para garantizar datos recomendaciones de recogida. </li></ol> 3. Medición de la función mitocondrial en fibroblastos humanos Living Para la medición convencional de la función mitocondrial a través de potencial de membrana mitocondrial (MMP)-dependientes colorantes, clasificación de células activadas fluorescentes (FACS) es el método principal. En el caso de los fibroblastos humanos, celular autofluorescence se observa con frecuencia y puede causar resultados falsos positivos por la interferencia con la señal de tinción real. Autofluorescencia típicamente se hace más pronunciada con números de paso superiores de los fibroblastos. Por lo tanto, se prefiere para evaluar la función mitocondrial de fibroblastos humanos por microscopía en vivo de imágenes de células. <ol><li> 24-48 h después de la siembra, incubar los fibroblastos en 50 nM de la MMP-dependiente colorante tetramethylrodamine éster etílico (TMRE) en medio RPMI. Este medio RPMI debería carecer de rojo de fenol como esto puede afectar negativamente la calidad de imagen. 1,6 M de tinción Hoechst debe añadirse para visualizar los núcleos. </li><li> Se incuban las células en solución de tinción preparado protegido de la luz durante 15 min a 37 ° C y 5% CO 2. </li><li> Reemplazar la solución de tinción con medio RPMI (sin rojo de fenol). Proceder sin una etapa de lavado y de inmediato celdas de imagen. Uso de ampliación 63x y confocal de barrido láser técnica de microscopía (microscopía de fluorescencia utilizando alternativamenteApótoma técnica) para definir una sola capa de células. Aplicar 37 ° C y 5% CO 2 a las células durante el proceso de formación de imágenes. </li><li> Cuando la imagen de los fibroblastos, preste la máxima atención al tiempo de exposición aplicado de luz fluorescente como la tinción TMRE puede blanquear rápidamente. Defina su tiempo de exposición adecuado entre 200 y 300 ms y no exceden este intervalo. La adquisición de la imagen en virtud de ajustes estandarizados es muy importante, como uno sería incapaz de hacer comparaciones basadas en intensidad si la configuración es diferente entre las líneas celulares. </li><li> En un radio definido alrededor de las células con imagen se blanquea a cabo después de la exposición a la luz, mantener el campo visual próximo suficientemente lejos de la sección photobleached. </li><li> Off-line los análisis se realizaron utilizando el software ImageJ (Wayne Rasband; Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.). </li><li> Seleccione la celda de interés mediante el uso de una herramienta de selección. </li><li> Convierte la imagen a 8 bits (Imagen &lt;Escriba &lt;8-bit). </li><li> Reducir el ruido b inespecíficay utilizando el &quot;Limpiar&quot; la función (Proceso &lt;Ruido &lt;Eliminar manchas). </li><li> Elija la opción &quot;tablas de búsqueda - Fire&quot; estado de presentación (Imagen &lt;tablas de búsqueda Fire &lt;). </li><li> Interruptor en el umbral de la función &quot;Más / Menos&quot; Función y ajuste de umbral (Imagen &lt;Ajuste del umbral &lt;). </li><li> Seleccione la opción &quot;analizar partículas&quot;, la cual le dará el valor medio para cada partícula gris mitocondrial detectable (&lt;Analizar analizar partículas). Guarde la lista de resultados dado como una hoja de cálculo Excel. </li><li> Archivo de los resultados en el programa Excel y calcular el promedio del valor de gris medio de las estructuras mitocondriales (indicado como &#39;media&#39; en la lista de resultados dado excel). </li><li> Para crear un gráfico de superficie, elija el plugin &quot;trama de superficie 3D interactivo&quot; en la sección &quot;3D&quot; plugin. En este caso, se puede ajustar más la trama con diferentes opciones de visualización. &quot;Cambio de los colores originales&quot; a &quot;Spectrum LUT&quot; da la barra de la escala de intensidad de la parcela correspondiente. </li><li> Alternativamenteal uso de TMRE para analizar la función mitocondrial de fibroblastos humanos a través de imágenes de células vivas, una combinación de la MMP-independiente colorante Mitotracker FM Green y el colorante Mitotracker MMP-dependiente CM-H 2 Xros se puede utilizar. De nuevo, para los fibroblastos humanos viven microscopía imágenes de células se prefiere, pero, en general, esta alternativa también se ha utilizado usando análisis FACS en otro tipo de células 12. Cuando se utiliza este método alternativo para medir la función mitocondrial en fibroblastos humanos, paso 3.7 de la sección de protocolo 5 &quot;Medición de mitochondrio-lisosomal colocalización de vida fibroblastos humanos&quot; debe ser aplicado. Con ello, la superposición de señales, tanto de positivo mitocondrias para Mitotracker Green FM y Mitotracker CM-H Xros 2 se calcula y se indica la cantidad de mitocondrias funcionales como relación a todos los presentes las mitocondrias. </li></ol> 4. La medición de la morfología mitocondrial en fibroblastos humanos Living <ol><li> 24-48hr después de la siembra, las células se incuban en 200 nM Mitotracker FM Green en medio RPMI (sin rojo fenol) protegido de la luz durante 15 min a 37 ° C y 5% CO 2. 1,6 M de tinción Hoechst se debe utilizar para resaltar los núcleos. Mitotracker Green FM es un colorante MMP-independiente, que tiñe todas las estructuras mitocondriales presentan. </li><li> Lavar suavemente las células una vez con PBS. </li><li> Añadir medio RPMI (sin rojo fenol) a las células e inmediatamente celdas de imagen. Utilice ampliación 63x y el escaneo láser confocal técnica de microscopía (microscopía de fluorescencia utilizando una técnica alternativa apótoma) para definir una sola capa de células. </li><li> Off-line análisis se extraen mediante el uso de software ImageJ. </li><li> Seleccione la celda de interés mediante el uso de una herramienta de selección. </li><li> Convierte la imagen a 8 bits (Imagen &lt;Escriba &lt;8-bit). </li><li> Reducir el ruido no específica mediante la opción &quot;Limpiar&quot; la función (Proceso &lt;Ruido &lt;Eliminar manchas). </li><li> Utilice el filtro de convolución para resaltar mitoconestructuras drial (Proceso &lt;Filtros &lt;convolución). </li><li> Ajuste del umbral de forma que la relación señal-a-ruido es apropiado (Imagen &lt;Ajuste &lt;umbral). </li><li> Mediante el uso de la &quot;analizar partículas&quot; opción, la identificación automática de las estructuras mitocondriales se inicia sobre la base de un tamaño de píxel escogido (&lt;Analizar analizar partículas). Varios parámetros mitocondriales posteriormente se calcula como el área, perímetro, ejes menor y mayor o circularidad. Estas medidas se pueden ajustar individualmente (&lt;Analizar Medidas Set). Guarde la lista de resultados dado como una hoja de cálculo Excel. </li><li> Abrir archivo de resultados en el programa Excel. Con el uso de tales parámetros, el análisis de la morfología mitocondrial puede llevarse a cabo. Esto incluye la definición del factor de forma que indica el grado de ramificación de una red mitocondrial [fórmula: (perímetro 2) / (4 * PI () * área)], así como la relación de aspecto que define la longitud de las mitocondrias (fórmula: major Ejes / ejes menores). </li></ol> 5. Medición de Mitochondrio-lisosomal Colocalización Vivir en fibroblastos humanos <ol><li> 24-48 horas después de la siembra, las células se incuban en 200 nM Mitotracker FM Green y 100 nM Lyostracker Red DND-99 en medio RPMI (sin rojo fenol) protegido de la luz durante 15 min a 37 ° C y 5% CO 2. 1,6 M de tinción Hoechst se utiliza para resaltar los núcleos. </li><li> Sustituir el medio con medio RPMI (sin rojo fenol) que contenía 100 nM Lyostracker Red DND-99. Este colorante tiene que estar presente durante la sesión de formación de imágenes completo. No lave las células después del período de incubación. Inmediatamente imagen de las células. Uso de ampliación 63x y técnica confocal (técnica alternativamente apótoma) para definir capas individuales de células. </li><li> Off-line análisis se extraen mediante el uso de software ImageJ. </li><li> Abra las dos respectivas imágenes que le gustaría analizar en términos de estado de colocalización. </li><li> Convierte la imagen a 8 bits (Imagen &lt;Escriba &lt;8-bit). </li&gt; <li> Reducir el ruido no específica utilizando la opción &quot;Eliminar manchas&quot; en función de las dos imágenes (Proceso &lt;Ruido &lt;Eliminar manchas). </li><li> Elija el plugin &quot;JACOP&quot; como herramienta de análisis de colocalización, que te da los valores de los respectivos canales y calcula el coeficiente de Pearson, coeficiente se superponen y el coeficiente Manders (Plugins &lt;JACOP). </li></ol> 6. Los resultados representativos La función mitocondrial en fibroblastos humanos viviendo se puede evaluar a través de la técnica de imágenes de células en vivo. Para los ensayos funcionales, la señal TMRE fluorescencia se correlaciona con el potencial de membrana mitocondrial (MMP). En condiciones normales de MMP, la fluorescencia TMRE es significativamente mayor (Figura 1A, fila superior) que en condiciones patológicas caracterizadas por una reducción de MMP (Figura 1A, fila inferior). Esta intensidad de fluorescencia se mide calculando la media del valor de gris medio de cada estructura mitocondrial ( <strong 1B&gt; Figura). La intensidad de fluorescencia se puede medir a través de software ImageJ. Aquí, el uso de la opción de &quot;trama superficie interactiva&quot; permite la ilustración de las diferentes intensidades de los picos (Figura 1A, derecha). Junto a la evaluación de la función mitocondrial en fibroblastos humanos, microscopía en vivo de imágenes de células se puede utilizar para definir diferentes parámetros de la morfología mitocondrial. Mediante el uso de la Mitotracker FM Verde estructuras de colorante mitocondrial se visualizan independiente de su MMP respectivo (Figura 2). Esto es importante para garantizar la inclusión de todas las estructuras mitocondriales presentes en los análisis. Usando el software ImageJ, la morfología es analizada sobre la base de cifras binarias, como sólo parámetros aquí morfología mitocondrial puede ser evaluado (Figura 2, &quot;binario&quot;). Ejemplos de análisis de la morfología mitocondrial en términos de factor de forma, así como la relación de aspecto se han publicado recientemente 6, 13. Otra característica importante que se puede medir en fibroblastos humanos vivos es la degradación de las estructuras mitocondriales. El primer paso en este progreso se puede evaluar por mitochondrio-lisosomal colocalización en microscopía en vivo de imágenes de células. Ciertas condiciones patológicas resultan en un aumento de las mitocondrias colocalización con lisosomas (Figura 3A). Una vez más, Mitotracker Green FM se utiliza para teñir estructuras mitocondriales independientes de su respectivo MMP. Además, la tinción con Lysotracker Red DND-99 permite visualizar estructuras lisosomales. Es crítico que el colorante Lysotracker Red está presente durante el proceso de formación de imágenes, como los pasos de lavado reducir la señal que llega a ser demasiado bajo para la visualización. Colocalización está representada por claras señales de fluorescencia amarilla debido a la superposición de la luz verde (Green Mitotracker FM) y rojo (Lysotracker Red DND-99) de tinción (flechas blancas, Figura 3A) y se determinan mediante el cálculo del coe Pearsonfficient (Figura 3B). En general, para el análisis fuera de línea con el software ImageJ, es útil para visualizar una célula por imagen, por lo que la definición de una región específica de interés (ROI) puede ser evitado. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1.jpg" /> Figura 1. Medición de la señal de fluorescencia TMRE indique el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en sala de fibroblastos humanos mediante la técnica de formación de imágenes en vivo de células. (A) es un TMRE fluorescente MMP-dependiente colorante, cuya intensidad de fluorescencia se correlaciona con la MMP. Colorante Hoechst se usó para teñir los núcleos (azul). En condiciones normales de MMP (fila superior), la fluorescencia TMRE es significativamente mayor que en condiciones patológicas caracterizadas por una reducción de MMP (fila inferior). La intensidad de fluorescencia se muestra adicionalmentecomo argumento intensidad superficie. La barra de escala indica 10 m. (B) Los análisis estadísticos de los fibroblastos de ejemplo mostrada en (A). En condiciones patológicas, una fluorescencia TMRE disminución de las mitocondrias se mide en comparación con la condición de MMP normal. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig2.jpg" /> Figura 2. Medición de la morfología mitocondrial en fibroblastos humanos vivos por la técnica de formación de imágenes en vivo de células. Mitotracker FM Green (verde) se utiliza para visualizar las estructuras mitocondriales, para que sea independiente de la MMP. Colorante Hoechst se usó para teñir los núcleos (azul). El uso del software ImageJ, la morfología se puede analizar en cifras binarias. La barra de escala indica 10 m. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig2large.jpg" target="_blank">Click</a><html> aquí para ampliar la figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3.jpg" /> Figura 3. Medición de la colocalización de las mitocondrias con lisosomas en los fibroblastos humanos vivos por la técnica de formación de imágenes en vivo de células. (A) Mitotracker FM Green (verde) se usa para teñir estructuras mitocondriales, Lyostracker Red DND-99 (rojo) visualiza estructuras lisosomales. Colorante Hoechst se usó para teñir los núcleos (azul). Colocalización con éxito bajo condiciones patológicas se indica por una señal de color amarillo debido a la superposición de Red Lysotracker y tinción Mitotracker Green (flechas blancas). La barra de escala indica 10 m. (B) Los análisis estadísticos de los fibroblastos de ejemplo mostrada en (A). Un mayor grado de colocalización resultados mitochondrio-lisosomales en un valor elevado coeficiente de Pearson./ 4228/4228fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ampliar la figura.

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	<li>de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+in+Europe:+A+collaborative+study+of+population-based+cohorts.">Prevalence of Parkinson's disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts.</a> Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).</li><li>Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+ubiquitinates+the+alpha-synuclein-interacting+protein,+synphilin-1:+implications+for+Lewy-body+formation+in+Parkinson+disease.">Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease.</a> Nature. 7, 1144-1150 (2001).</li><li>Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease:+one+biochemical+pathway+to+fit+all+genes.">Parkinson's disease: one biochemical pathway to fit all genes.</a> Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).</li><li>Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. 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F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+the+mitochondrial+chaperone+mortalin+in+Parkinson's+disease:+functional+impact+of+disease-related+variants+on+mitochondrial+homeostasis.">Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson's disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis.</a> Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).</li><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Nguyen, H. 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No hay conflictos de interés declarado.

Fibroblastos de la piel del paciente como modelos ex vivo representan una herramienta importante para caracterizar la enfermedad asociada a defectos genéticos. Además, la piel derivados de fibroblastos son fácilmente accesibles y se pueden expandir en cultivo. Por lo tanto, las células primarios obtenidos de pacientes portadores de PD asociadas a mutaciones genéticas son preferibles a la utilización de líneas de células tumorales, ya que contienen no sólo el endógeno gen causante de enfermedad, pero t...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo no. </td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 52400-025 </td></tr><tr><td> Medio RPMI 1640, sin rojo de fenol </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-063 </td></tr><tr><td> Dulbecco salina tamponada con fosfato (DPBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) </td><td> PeproTech </td><td> 100-18B </td></tr><tr><td> AccuMax (solución desapego) </td><td> PAA </td><td> L11-008 </td></tr><tr><td> Lab-TekTMII de cámara cubres </td><td> Nalge Nunc Internacional </td><td> 115382 </td></tr><tr><td> Tetramethylrodamine etil éster (TMRE) </td><td> Invitrogen </td><td> T-669 </td></tr><tr><td> Mitotracker Green FM </td><td> Invitrogen </td><td> M-7514 </td></tr><tr><td> Mitotracker CM-H2XRos </td><td> Invitrogen </td><td> M-7513 </td></tr><tr><td> Lyostracker Red NOM-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L-7528 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H-3570 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos y equipos específicos.

the use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of parkinson's disease

Enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno del movimiento más común y afecta a 1% de las personas mayores de 60 1. Debido a que el envejecimiento es el factor de riesgo más importante, los casos de PD aumentará durante las próximas décadas 2. Al lado de plegamiento de proteínas patológicas y deteriorados vías de degradación de proteínas, alteraciones de la función mitocondrial y la morfología fueron señalados como sello distintivo adicional de la neurodegeneración en la EP 3-11. Después de años de investigación en células de cáncer murino y humano como en modelos in vitro para diseccionar las vías moleculares de parkinsonismo, el uso de fibroblastos humanos de pacientes y controles apropiados como modelos ex vivo se ha convertido en una valiosa herramienta de investigación, si se consideran posibles salvedades. Aparte de modelos celulares inmortalizadas, más bien artificiales, fibroblastos primarios de los pacientes portadores de enfermedades asociadas a mutaciones aparentemente reflejan importantes características patológicas of la enfermedad humana. Aquí delinear el procedimiento de toma de biopsias de piel, los fibroblastos humanos cultivo y el uso de protocolos detallados para esenciales técnicas microscópicas para definir los fenotipos mitocondriales. Estos fueron usados ​​para investigar las características diferentes asociados con la EP que son relevantes para la función mitocondrial y la dinámica. Ex vivo, las mitocondrias pueden ser analizadas en términos de su función, la morfología, la colocalización con lisosomas (los orgánulos degradantes mitocondrias disfuncionales) y la degradación a través de la vía lisosomal . Estos fenotipos son altamente relevantes para la identificación de los signos iniciales de la EP y puede preceder a los síntomas clínicos de motor en genes humanos portadores de enfermedades. Por lo tanto, los ensayos presentados aquí pueden ser utilizados como herramientas valiosas para identificar las características patológicas de la neurodegeneración y ayudar a definir nuevas estrategias terapéuticas en la EP.

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Los fibroblastos de pacientes portadores de mutaciones causantes de la enfermedad en el Parkinson genes representan un fácil acceso<em&gt; Ex vivo</emModelo&gt; para estudiar las enfermedades asociadas a fenotipos. Imágenes de células vivas da la oportunidad de estudiar los parámetros morfológicos y funcionales en las células vivas. Aquí se describe la preparación de fibroblastos humanos y posterior seguimiento de fenotipos mitocondriales.

El uso de fibroblastos humanos primarios para la Supervisión de fenotipos mitocondriales en el campo de la enfermedad de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

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Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

16.7K vistas.  DZNE. Los fibroblastos de pacientes portadores de mutaciones causantes de la enfermedad en el Parkinson genes representan un fácil acceso Ex vivo para estudiar las enfermedades asociadas a fenotipos. Imágenes de células vivas da la oportunidad de estudiar los parámetros morfológicos y funcionales en las células vivas. Aquí se describe la preparación de fibroblastos humanos y posterior seguimiento de fenotipos mitocondriales.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Generación experimental de carcinoma asociada a los fibroblastos (CAF) a partir de fibroblastos humanos mamarios

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Investigación

Medicina

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our understanding of the mechanisms underlying parkinsonian symptoms, since it recapitulates the changes in basal ganglia circuitry and pharmacology observed in parkinsonian patients1-4. However, the precise cellular and molecular changes occurring at cortico-striatal synapses of the output pathways within the striatum, which is the major input region of the basal ganglia remain elusive, and this is believed to be site where pathological abnormalities underlying parkinsonian symptoms arise3,5.
In PD, understanding the mechanisms underlying changes in basal ganglia circuitry following degeneration of the nigro-striatal pathway has been greatly advanced by the development of bacterial artificial chromosome (BAC) mice over-expressing green fluorescent proteins driven by promoters specific for the two striatal output pathways (direct pathway: eGFP-D1; indirect pathway: eGFP-D2 and eGFP-A2a)8, allowing them to be studied in isolation. For example, recent studies have suggested that there are pathological changes in synaptic plasticity in parkinsonian mice9,10. However, these studies utilised juvenile mice and acute models of parkinsonism. It is unclear whether the changes described in adult rats with stable 6-OHDA lesions also occur in these models. Other groups have attempted to generate a stable unilaterally-lesioned 6-OHDA adult mouse model of PD by lesioning the medial forebrain bundle (MFB), unfortunately, the mortality rate in this study was extremely high, with only 14% surviving the surgery for 21 days or longer11. More recent studies have generated intra-nigral lesions with both a low mortality rate &gt;80% loss of dopaminergic neurons, however expression of L-DOPA induced dyskinesia11,12,13,14 was variable in these studies. Another well established mouse model of PD is the MPTP-lesioned mouse15. Whilst this model has proven useful in the assessment of potential neuroprotective agents16, it is less suitable for understanding mechanisms underlying symptoms of PD, as this model often fails to induce motor deficits, and shows a wide variability in the extent of lesion17, 18.
Here we have developed a stable unilateral 6-OHDA-lesioned mouse model of PD by direct administration of 6-OHDA into the MFB, which consistently causes &gt;95% loss of striatal dopamine (as measured by HPLC), as well as producing the behavioural imbalances observed in the well characterised unilateral 6-OHDA-lesioned rat model of PD. This newly developed mouse model of PD will prove a valuable tool in understanding the mechanisms underlying generation of parkinsonian symptoms.

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson&#039;s Disease

A protocol for performing unilateral 6-OHDA lesions of the medial forebrain bundle in mice is described. This method has a low mortality rate (13.3 %) with 89% of the surviving animals showing &#62;95% loss of striatal dopamine and 90.63&#177;-4.02 % ipsiversive rotational bias towards the side of the lesion.

Desarrollo de una manera unilateral-lesionado 6-OHDA modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

Imagen de Espectrometría de Masas MALDI de neuropéptidos en la enfermedad de Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

Piel biopsia en sacabocados explante cultura para Derivación de fibroblastos humanos primarios

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

Aislamiento de oligómeros de PrP soluble e insoluble en el cerebro humano normal

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

El trasplante ortotópico aórtica en los ratones para el Estudio de la Enfermedad Vascular

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Modelos De Interacción Gen-Ambiente Para Desenmascarar Los Mecanismos De Susceptibilidad En La Enfermedad De Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Controlling Parkinson's Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time according to fluctuating disease and medication state. In the present realization of adaptive DBS we record and stimulate from the DBS electrodes implanted in the subthalamic nucleus of patients with Parkinson&#39;s disease in the early post-operative period. Local field potentials are analogue filtered between 3 and 47 Hz before being passed to a data acquisition unit where they are digitally filtered again around the patient specific beta peak, rectified and smoothed to give an online reading of the beta amplitude. A threshold for beta amplitude is set heuristically, which, if crossed, passes a trigger signal to the stimulator. The stimulator then ramps up stimulation to a pre-determined clinically effective voltage over 250 msec and continues to stimulate until the beta amplitude again falls down below threshold. Stimulation continues in this manner with brief episodes of ramped DBS during periods of heightened beta power.
Clinical efficacy is assessed after a minimum period of stabilization (5 min) through the unblinded and blinded video assessment of motor function using a selection of scores from the Unified Parkinson&#39;s Rating Scale (UPDRS). Recent work has demonstrated a reduction in power consumption with aDBS as well as an improvement in clinical scores compared to conventional DBS. Chronic aDBS could now be trialed in Parkinsonism.

Controlling Parkinson&#039;s Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) is effective for Parkinson&#8217;s disease, improving symptoms and reducing power consumption compared to conventional deep brain stimulation (cDBS). In aDBS we track a local field potential biomarker (beta oscillatory amplitude) in real time and use this to control the timing of stimulation.

El control de la enfermedad de Parkinson con Adaptive estimulación cerebral profunda

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time ...

Developing Neuroimaging Phenotypes of the Default Mode Network in PTSD: Integrating the Resting State, Working Memory, and Structural Connectivity

Complementary structural and functional neuroimaging techniques used to examine the Default Mode Network (DMN) could potentially improve assessments of psychiatric illness severity and provide added validity to the clinical diagnostic process. Recent neuroimaging research suggests that DMN processes may be disrupted in a number of stress-related psychiatric illnesses, such as posttraumatic stress disorder (PTSD).
Although specific DMN functions remain under investigation, it is generally thought to be involved in introspection and self-processing. In healthy individuals it exhibits greatest activity during periods of rest, with less activity, observed as deactivation, during cognitive tasks, e.g., working memory. This network consists of the medial prefrontal cortex, posterior cingulate cortex/precuneus, lateral parietal cortices and medial temporal regions.
Multiple functional and structural imaging approaches have been developed to study the DMN. These have unprecedented potential to further the understanding of the function and dysfunction of this network. Functional approaches, such as the evaluation of resting state connectivity and task-induced deactivation, have excellent potential to identify targeted neurocognitive and neuroaffective (functional) diagnostic markers and may indicate illness severity and prognosis with increased accuracy or specificity. Structural approaches, such as evaluation of morphometry and connectivity, may provide unique markers of etiology and long-term outcomes. Combined, functional and structural methods provide strong multimodal, complementary and synergistic approaches to develop valid DMN-based imaging phenotypes in stress-related psychiatric conditions. This protocol aims to integrate these methods to investigate DMN structure and function in PTSD, relating findings to illness severity and relevant clinical factors.

This protocol describes the complementary neuroimaging techniques of resting state structural connectivity, task-induced deactivation, and structural connectivity analyses to examine the default network in post-traumatic stress disorder. The use of synergistic methods could potentially lead to improved diagnostics and assessments of severity, outcome, and other relevant clinical factors.

El desarrollo de Neuroimagen fenotipos del modo de red por defecto en el TEPT: Integrando el estado de reposo, la memoria de trabajo, y la conectividad estructural

Complementary structural and functional neuroimaging techniques used to examine the Default Mode Network (DMN) could potentially improve assessments of ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

El uso de ultra-alta MRI Field en Modelos pequeño roedor de la enfermedad renal poliquística para<em&gt; En Vivo</em&gt; Fenotipificación de Drogas y Vigilancia

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...