El metabolismo mitocondrial es un regulador esencial de la durabilidad y la memoria de las células T. Por lo tanto, medir la respiración mitocondrial proporciona información importante sobre las propiedades de las células T. La máquina Seahorse puede medir varios elementos de la respiración mitocondrial, en tiempo real, en linfocitos T primarios humanos vivos, sin necesidad de ningún etiquetado.
Este método es muy adecuado para monitorear la aptitud de las células T y el potencial de memoria, que son predictores importantes del éxito de la inmunoterapia contra el cáncer. Para comenzar, lave las perlas CD3 / CD28 transfiriendo 12.5 microlitros de cuentas por millón de células a un tubo de microcentrífuga y agregando 12.5 microlitros de PBS por cada 12.5 microlitros de las cuentas en el tubo. Luego, coloque el tubo de la microcentrífuga en un imán adecuado durante un minuto, deseche el tampón y vuelva a suspender las perlas en el volumen original del medio de células T.
A continuación, agregue 12.5 microlitros de cuentas por millón de células en una proporción de una a dos cuentas por células, y divida las células en dos condiciones con alrededor de cinco millones de células en cada una. Luego, agregue el volumen correcto de citoquinas a cada condición y transfiera las células a placas de múltiples pocillos. Incubar las células durante tres días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Después de tres días de incubación, prepare un medio de células T frescas con el doble de concentración de citoquinas. Resuspend y divida las células transfiriendo la mitad del volumen de cada pozo a un nuevo pozo. Luego, agregue el mismo volumen de medio de células T recién preparado a cada pozo.
Para el ensayo de flujo extracelular, prepare una solución de recubrimiento que contenga bicarbonato de sodio, Cell-Tak e hidróxido de sodio. Luego, abra una placa de cultivo celular XF fresca y agregue 12 microlitros de la solución de recubrimiento recién preparada a cada pozo, asegurando una distribución uniforme de la solución de recubrimiento en el fondo de todos los pozos. Incubar la placa a temperatura ambiente con la tapa puesta durante 30 minutos.
Luego, deseche la solución líquida restante de todos los pozos. Lave el plato con 200 microlitros de agua estéril y deseche el líquido. A continuación, lave la placa con 200 microlitros de PBS estéril de grado de cultivo celular.
Después de desechar el líquido, deje que la placa se seque durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para colocar células T en la placa de cultivo celular XF, prepare 50 mililitros de medios de ensayo mezclando medios XF RPMI adecuados con glucosa, piruvato y glutamina de acuerdo con la configuración experimental. Caliente los medios preparados a 37 grados Celsius en una incubadora no regulada por dióxido de carbono y ajuste el pH a 7.4.
Asegúrese de que haya suficientes medios para plantar células y preparar las soluciones de oligomicina y FCCP. A continuación, diseñe un diseño de placa con un número creciente de celdas por pozo para la optimización o ejecución del ensayo. Use cuatro pozos llenos de medios e inyectados con medios para mediciones de fondo.
Después de contar las células T preparadas anteriormente, pipetee un número apropiado de células a cada pocillo de la placa de cultivo de células XF previamente recubierta de acuerdo con el diseño de la placa. Para adherir las células T a la superficie recubierta, centrífuga la placa de cultivo de células XF. Luego, lave las células con 200 microlitros de medios de ensayo.
Deseche los medios y agregue 180 microlitros de medios de ensayo frescos. Después de asegurarse de que las células estén unidas y distribuidas uniformemente a través de la superficie del pozo, incube la placa de cultivo celular XF a 37 grados Celsius en el gabinete de calefacción no regulado por dióxido de carbono durante 30 minutos. Para la ejecución de optimización, prepare soluciones de trabajo de oligomicina y FCCP en medios de ensayo.
Luego, cargue las soluciones de trabajo de oligomicina o FCCP en los puertos de inyección del cartucho del sensor. Asegúrese de que ningún puerto de inyección contenga solo aire. Llene todos los puertos vacíos con medios de ensayo.
Luego, elimine las burbujas potenciales en los puertos de inyección golpeando suavemente los bordes de la placa sobre la mesa. Para la ejecución del ensayo, prepare una solución de antimicina A de 20 micromolares. Luego, de acuerdo con el diseño de la placa, cargue 20 microlitros de oligomicina o FCCP en el puerto de inyección A del cartucho del sensor y agregue 22 microlitros de antimicina A al puerto de inyección B de todos los pozos.
En una ejecución representativa de optimización de oligomicina, se alcanza una meseta en la tasa de consumo de oxígeno, o OCR, cuando la concentración acumulativa alcanza un micromol. A partir de esta concentración, el OCR no se redujo más. Para las células tratadas con concentraciones crecientes del desacoplador FCCP, los niveles de OCR aumentaron hasta 0,2 fccP micromolares y luego alcanzaron una meseta, lo que indica que se obtuvo un desacoplamiento completo.
En una ejecución representativa de optimización de la concentración celular, el OCR inicial para una ejecución con 200, 000 células es aproximadamente la mitad de eso, con 400, 000 células. Después del tratamiento con FCCP, el OCR máximo es de 61,6 picomoles por minuto para 200.000 células y 190,4 picomoles por minuto para 400.000 células. Después del tratamiento con oligomicina, el OCR en la carrera con 200, 000 células colapsa en un solo dígito y es más bajo que el de la carrera con 400, 000 células.
La investigación del efecto de las citoquinas interleucina-2 e interleucina-15 en el metabolismo de las células T reveló que las células cultivadas con interleucina-15 poseían una mayor respiración máxima y capacidad respiratoria excedente. Sin embargo, la respiración basal y la producción de ATP no se vieron afectadas. El estudio del metabolismo mitocondrial en las células T humanas da pistas importantes sobre su durabilidad y potencial de supervivencia.
Esto da como resultado un mayor conocimiento de la aptitud de las células T y, en última instancia, puede mejorar las tasas de respuesta a la inmunoterapia contra el cáncer.
