La enfermedad de Huntington, HD, es una patología neurodegenerativa incurable causada por una mutación en el gen que codifica la proteína huntingtina. La huntingtina se asocia principalmente con vesículas y microtúbulos, y probablemente está involucrada en procesos de transporte dependientes de microtúbulos. Para estudiar la influencia de la huntingtina mutante en el dinamismo de los microtúbulos, utilizamos la visualización in vivo de la proteína EB3, que regula las propiedades dinámicas de los microtúbulos doblando y estabilizando los extremos superiores en crecimiento.
Para cargar EB3 marcado fluorescentemente en fibroblastos de piel humana, aplicamos transfección por plásmidos. Se utilizó el cultivo primario de fibroblastos para obtener de la biopsia de piel del paciente EB3 para este estudio. Entregue la biopsia al laboratorio en unas pocas horas en medio DMEM, complementado con 15 microgramos por mililitro de penicilina y 50 unidades por mililitro de estreptomicina.
Coloque el tejido de la biopsia en una placa de Petri de seis centímetros, junto con una pequeña cantidad de medio. Usando un bisturí estéril, corte la muestra de biopsia en pedazos de aproximadamente 0.5 a un milímetro de tamaño. Coloque uno, dos fragmentos obtenidos en una placa de Petri de 3,5 centímetros y coloque un resbalón de cubierta estéril sobre las piezas de biopsia.
Agregue lentamente 1.5 mililitros de un medio de crecimiento. Cultive los chorros de fibra en el medio de crecimiento en una incubadora de CO2, en un 5% de CO2 que es de siete grados centígrados, 80% de humedad. Después de cuatro, siete días, primero los queratinocitos, luego los fibroblastos comienzan a migrar del tejido al fondo del plato.
Cultivo celular. Para la visualización de la transfección, se deben usar platos de placa confocal de vidrio, platos confocales. Cubra el fondo del plato con una solución de gelatina al 0,1% en autoclave preparada en agua destilada.
Incubar durante 15 minutos. Preparar el medio de cultivo. Mezcle bien, almacene alto a más de 4 centígrados.
Calentar el medio a más 37 centígrados, antes de añadirlo a las células. Evaluar el cultivo bajo el microscopio. Retire el medio y lave las células con un DPBS estéril.
Agregue un mililitro de solución de tripsina al 0,25% precalentada a las células. Revise las células bajo el microscopio si se desprenden completamente del sustrato. Desactivar la tripsina con un mililitro del medio de cultivo.
Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 200 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender la paleta celular en un mililitro del medio de cultivo.
Cuente el número de celda. Calcule el número requerido de celdas. Dessiembrarlos con una densidad de ocho a 15, multiplicado por 10 a la potencia de tres, pasado por un centímetro.
Esto se divide en mililitros del medio de cultivo. Retire la solución de gelatina de la placa de cultivo preparada para la inoculación e inmediatamente agregue dos mililitros de la suspensión celular. Cultive fibroblastos a más de 37 grados centígrados en una incubadora de CO2.
Refresque el medio cada dos, cuatro días. Para los experimentos, use las células de cuatro, 11 pasajes. En el momento de la transfección, la confluencia no debe ser más del 70, 80%Reemplace el medio de cultivo por uno fresco 24 horas antes de la transfección.
Prepare un complejo ADN-lípido, basado en el área y la densidad de la siembra celular. Se utilizó el agente de transfección liposomal, y la densidad de la siembra celular de una, multiplicada por 10 a la potencia de cuatro células, pasadas por un centímetro. Agregue tres microlitros de reactivo comercial a 125 microlitros de Opti-MEM, que no contengan antibiótico.
Sin tocar las paredes del tubo, resuspenda suavemente. ADN plásmido diluido, GFP-EB3, agregando un microgramo del ADN plásmido a 125 microlitros de OptiMEM. Resuspendir suavemente.
Agregue ADN plásmido diluido a cada tubo de reactivo de transfección diluido, una a una proporción. Incubar durante 30 minutos. Agregue el complejo lipídico de ADN a la placa de Petri de seis centímetros con células.
Mezclar con un columpio cruciforme durante 30 segundos. Incubar las células con un agente de transfección durante 24 horas, luego cambiar el medio a uno fresco. Analice la eficiencia después de la inspección en 24 y 48 horas.
Preparación para la obtención de imágenes. Antes de obtener imágenes en vivo de las células, cambie el medio de cultivo a un medio sin colorante indicador de pH para reducir la autofluorescencia. Aplique cuidadosamente aceite mineral a la fase de celda media para cubrir completamente el medio, aislándolo del entorno externo para reducir la penetración de O2 y la evaporación del medio.
Use una lámpara macro y toda la imagen en una lente de objetivo de 60 veces y 100 veces con alta apertura numérica para tomar la imagen. Para las observaciones in viva, el microscopio debe estar equipado con una incubadora para mantener las condiciones necesarias para que las células, incluido el golpeo de la mesa óptica, y la lente pase 37 grados centígrados, una cámara cerrada fue el suministro de CO2 y el soporte de nivel de humedad. Coloque el plato confocal con las células en el soporte del microscopio antes de obtener imágenes.
Asegúrese de que el plato y la cámara estén bien conectados al soporte para evitar la deriva mientras se toman imágenes. Configuración de los parámetros de imagen. Elija los valores de exposición bajos, ya que la diapositiva induce el daño celular, reacciona con los espacios de oxígeno.
Para estudiar la dinámica de los microtúbulos en fibroblastos de la piel humana, seleccionamos una exposición de 300 milisegundos. Centrarse en el objeto de interés. Para las imágenes de lapso de tiempo prolongado, el sistema de estabilización de enfoque automático, el sistema de enfoque perfecto es necesario, ya que puede haber un cambio a lo largo del eje establecido y, por lo tanto, el objeto de interés estará fuera de foco.
Elija las condiciones óptimas de imagen, dependiendo de la fotosensibilidad de la célula y la velocidad de desvanecimiento del cromo de destello. Dado que los microtúbulos son estructuras altamente dinámicas, se puede seleccionar un tiempo razonablemente corto a su vez, y la velocidad de fotogramas debe ser lo suficientemente alta. Para investigar la dinámica de los microtúbulos en los fibroblastos de la piel, utilizamos una frecuencia de un fotograma por segundo, durante tres, cinco minutos.
Al seleccionar el siguiente objeto para obtener la imagen, aléjese del área ya fotografiada, ya que bajo la influencia de la luz, hay un foto-sangrado que transcurre. Dado que utilizamos una frecuencia de imagen relativamente alta, el obturador no se cerró entre las imágenes, y la lámpara llegó tarde durante todo el período de imágenes, que se está desvaneciendo. Elija los videos óptimos para estudiar visualmente la dinámica de los microtúbulos, teniendo en cuenta la calidad de la transfección, la calidad de las imágenes de los microtúbulos, la relación óptima señal-ruido y la ausencia de deriva de la célula analizada.
Utilice los videos seleccionados para estudiar la dinámica de los microtúbulos más-extremos, trussándolos en el programa de Fiji. El paso más crítico en el protocolo es la transfección, asegurando una expresión suficiente de proteínas. Una buena relación señal-ruido, la ausencia de fotoblanqueo de microtúbulos y la ausencia de deriva celular son fundamentales para la obtención de imágenes.
La visualización in vivo de la dinámica de los microtúbulos proporciona información vital sobre las propiedades de la huntingtina mutante. Nuestro protocolo se puede aplicar a estudios de otras enfermedades, cuya patología implica propiedades dinámicas del citoesqueleto.
