Name: live confocal imaging of developing arabidopsis flowers
Uploaded: 2017-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers at JoVE.com

El autor desea agradecer al Prof. Elliot M. Meyerowitz por su apoyo y comentarios sobre el manuscrito, así como Ann Lavanway en el Dartmouth College y el Dr. Andres Collazo en la Instalación de imágenes biológicas en Caltech, por su ayuda en la solución de problemas técnicos con el imagen confocal en vivo. El trabajo de Nathanaël Prunet es apoyada por los Institutos Nacionales de Salud a través de subvención R01 GM104244 a Elliot M. Meyerowitz.

1. Medios y preparación platos <ol><li> Preparar la disección de platos rellenando cajas redondo de plástico (de aproximadamente 6 cm de ancho, 2 cm de profundidad) a 0,5 cm con 2% de agarosa. </li><li> Preparar la formación de imágenes platos. <ol><li> Para un microscopio confocal en posición vertical, llenar rectangular de plástico cajas de bisagras (aproximadamente 7 cm de largo, 4,5 cm de ancho, 3 cm de profundidad) a 0,5 cm con medio de formación de imágenes (véase la sección 1.3, &quot;medio Imaging&quot;; Figura 1F). </li><li> Para un microscopio confocal invertido: llenar pequeña placa de Petri (aproximadamente 3,5 cm de ancho, 1 cm de profundidad) exactamente hasta el borde con medio de formación de imágenes (véase la sección 1.3, &quot;medio Imaging&quot;; Figura 1G). </li></ol></li><li> Preparar medio formador de imágenes. <ol><li> Para la imagen de un solo punto, utilizar 1% de agarosa. </li><li> Para los experimentos de lapso de tiempo, utilizar un medio de crecimiento vértice (0.5x mezcla de sal basal de Murashige y Skoog sin vitamina, 1% de sacarosa, 0,8% de agarosa, pH 5,8 con hidróxido de potasiosolución e, suplementado con vitamina [0,01% de mio-inositol, ácido nicotínico 0,0001%, hidrocloruro de piridoxina 0,0001%, 0,001% de hidrocloruro de tiamina, 0,0002% de glicina] y citoquinina [500 nM N6-benciladenina]) 15. </li></ol></li></ol> 2. Crecimiento de Plantas <ol><li> Siembre semillas esterilizadas en placas MS (0.5 o de la mezcla de sal basal de Murashige y Skoog 1x sin vitamina, 0,8% de agar, pH 5,8 con solución de hidróxido de potasio) con selección apropiada. placas lugar en día largo (16 h de luz) o días continuos, 16-22 ° C Condiciones de durante dos semanas. </li><li> plantas de semillero de trasplante Onto suelo con una separación suficiente para permitir el desarrollo robusto. Coloque las plantas de día corto, 16-22 ° C CONDICIONES durante tres semanas. NOTA: Las plantas que crecen en condiciones de día largo o continuas día directamente después del transplante resultados en floración prematura e inflorescencias que son menos vigorosos, y mucho más difícil de diseccionar. Del mismo modo, dejando las plantas bajo Condit día cortoiones durante más de tres semanas los resultados en día floración longitud independiente e inflorescencias que son menos vigorosa. </li><li> plantas de transferencia a largo días (16 h de luz) o días continuos, 16-22 ° C Condiciones de hasta que la flor. ápices son más fáciles de diseccionar cuando la inflorescencia es de 2-10 cm de largo. </li></ol> 3. La disección de la Shoot Apex <ol><li> Opcional: El uso de una piedra de afilar fina y una gota de aceite ligero, afilar fórceps bajo el microscopio estereoscópico para que sean de tipo cuchilla, no puntual. </li><li> Retire silicuas, capullos de las flores mayores y las inflorescencias secundarias de la inflorescencia principal, empujando la base de los pedúnculos con las pinzas hasta que se rompen. Eliminar como muchas flores como sea posible sin aumento (Figura 1, comparar A y B). </li><li> El uso de pinzas, Pierce un agujero vertical en la agarosa de un plato de disección, corte los últimos 0,5 cm de la inflorescencia y pegarlo verticalmente en la agarosa. El restantecapullos de flores deben estar por encima de la superficie de agarosa. </li><li> Llenar el plato de imagen con agua estéril, desionizada de modo que el ápice del brote se sumerge por completo. Coloque el plato de disección bajo el microscopio estereoscópico, y eliminar el aire atrapado alrededor del ápice del brote mediante la creación de chorros de agua con una pipeta de 1000 l (Figura 1, comparar C y D). </li><li> Bajo el microscopio estereoscópico, utilice el fórceps para eliminar los brotes de flor que no están en ser fotografiado empujando sobre la base del pedúnculo o la parte superior de la yema hasta que se rompe el pedúnculo (Figura 1E). Es importante que los pedúnculos romper limpiamente en la unión con el tallo, como pedúnculos sobrantes dificultan la eliminación de las yemas florales jóvenes. </li><li> Si de imagen sólo los brotes de flor de la etapa 5 y más joven (Figura 2A), eliminar el agua antes de la disección de la etapa 6-8 capullos de flores. Si los brotes de flor de imágenes de la etapa 5 años o más, proceden a la ablación sépalo (ver sección 5.1). De lo contrario, ProCeed al paso 3.7. </li><li> El uso de pinzas, perforar un agujero vertical en el medio de un plato de formación de imágenes, y se adhieren los rectos ápice diseccionado en el medio, de modo que sólo el meristemo apical y sus alrededores capullos de flores están por encima de la superficie del medio. Dependiendo de la yema (s) de flores son en ser fotografiado, puede ser necesario inclinar ligeramente la muestra, como capullos de flores no están necesariamente orientadas exactamente igual que el vástago (Figura 2A). </li><li> Proceder a la tinción de la muestra si es necesario. Si no las manchas y / o imágenes de la muestra de inmediato, añadir agua y cerrar el plato de imagen para evitar la deshidratación. Si se utiliza un microscopio invertido, colocar el plato de formación de imágenes en una caja de plástico transparente y cerrarla. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig1.jpg" /> Figura 1: Preparación de los ápices de vástagos para formación de imágenes confocal en vivo. (A - E) Disección de undisparar ápice para la imagen. Inflorescencia antes (A) y después (B) la eliminación de las silicuas y flores mayores. (C - D) ápice del brote sumerge en agua en el plato de la disección, con una burbuja de aire atrapada en la punta (C) y después de la eliminación de la burbuja de aire (D). (E) el ápice del brote en el plato de la disección, después de la disección de los botones florales mayores de la etapa 5. (F - G) Vista de ápices en el plato de imagen, en el escenario de un microscopio confocal vertical (F) e invertida (G) . En (F), una lente de inmersión en agua 40X se coloca encima de uno de los vértices, con la punta de la lente se sumerge en agua. En (G), el ápice del brote se coloca al revés por encima de la lente de inmersión en agua 40X, con una columna de agua que conecta el medio de formación de imágenes a la punta de la lente. El panel más pequeño en (F) muestra una higsu vista ampliación de la zona en el rectángulo rojo, con un ápice del brote insertada en un medio de formación de imágenes; líneas rojas y azules indican la superficie del medio y el agua, respectivamente. (H - I) Los ejemplos de los productos a medida que permiten la adición de más agua en la punta de la lente-inmersión en agua: un manguito de caucho de silicio a partir de un casquillo de la bujía (H), y un manguito improvisada a partir del dedo de un guante de látex sin polvo (G). Barras de escala = 0,5 cm de (A) y (B), 0,1 cm de (C) y (D), y 100 micras de (E). Esta cifra se publicó inicialmente en referencia 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 4. La tinción NOTA: Las paredes celulares o membranas de plasma se pueden teñir con yoduro de propidio o FM4-64, respectivamente, para lograr la resolución celulardurante la exploración. Alternativamente, las líneas reportero con proteínas fluorescentes etiquetados a la membrana plasmática se pueden utilizar 6, 16. <ol><li> Eliminar el agua del plato de formación de imágenes, y asegurar que la superficie del medio es seco para evitar la dilución del colorante. </li><li> Bajo el microscopio estereoscópico, se aplican de 20 a 30 l de cualquiera de las soluciones de yoduro de propidio ml, o 80 mg solución 1 mg / / mL FM4-64 al ápice diseccionado con una pipeta de 10 mL. Asegúrese de que toda la muestra está cubierto de tinte para asegurar una tinción homogénea. </li><li> Mancha durante 2 min si se utiliza yoduro de propidio, o 20 min si se utiliza FM4-64. </li><li> Enjuague dos veces con agua estéril, desionizada. </li></ol> 5. Sepal ablación NOTA: En la etapa 4, primordios de sépalos comenzar a cubrir la FM. A medida que crecen, que filtran la fluorescencia a partir del tejido subyacente, y dificultan el proceso de formación de imágenes. Sépalos o bien pueden ser retirados manualmente usando un mounte metal pind en un pin-tornillo de banco, o se impide que crezca el uso de la ablación con láser en los primordios de sépalos emergente. Alternativamente, es posible en algunos casos a utilizar mutantes tales como apetala1-1, en los que los sépalos no aparecen o están reemplazados por órganos en forma de hoja que no cubren la FM mientras que la parte central de la flor se desarrolla normalmente (Figura 2F) 17. <ol><li> Ablación Sepal en capullos de flores de la etapa 5 y mayores utilizando un pin-tornillo de banco que sostiene una aguja de metal recta (Figura 2, E1-E2) <ol><li> Coloque el plato de disección con el ápice diseccionado bajo el microscopio estereoscópico, y establecer la ampliación al máximo. Sumergir el ápice del brote en agua estéril, desionizada, o alternativamente, utilizar una pipeta de 1000 l para aplicar agua a la ápice del brote regularmente mientras la disección de los sépalos. </li><li> Con el pasador-tornillo de banco, coloque el pasador en la parte superior del sépalo abaxial, tangencialmente con respecto al ápice del brote. Empuje suavemente el sépalo lejos del ápice del brote hasta que se rompeDel botón floral. </li><li> Procederá de manera similar con el sépalo adaxial, pero empujar el sépalo hacia el ápice del brote. </li><li> Procederá de manera similar con los sépalos laterales, pero la posición del pasador radialmente con respecto al ápice del brote, y empujar los sépalos a un lado, lejos de la yema floral. </li><li> Sumerja el ápice del brote en agua estéril, desionizada durante unos minutos para evitar la deshidratación. </li></ol></li><li> La ablación por láser de los primordios sépalo en la etapa 3-4 (Figura 2, C5-D5) <ol><li> Coloque el plato de imagen con el manchado, el ápice diseccionado en la platina del microscopio confocal. Localizar y centrarse en el vértice como si se preparara a la imagen (véase la sección 6, &quot;Configuración de imagen&quot;). </li><li> Usando el software del sistema de ablación por láser, definir la zona de ablación, que corresponde a la cresta y la punta de los primordios sépalo emergente antes de comenzar a cubrir el meristemo de flores (por lo general, en la etapa 3 para los sépalos abaxial y adaxial, y en la etapa tardía 3 / temprano etapa 4 para SE lateralPals). </li><li> Establecer la potencia del láser y el tiempo de permanencia de los parámetros apropiados para la ablación de suficientes células sin causar demasiado daño a los tejidos subyacentes. Típicamente, dependiendo del sistema de ablación láser utilizado, los parámetros adecuados inicialmente necesitan ser identificadas a través de un proceso de ensayo y error para asegurar que suficientes células se eliminan para evitar que los sépalos para crecer posteriormente sobre el FM, sin afectar el resto de la flor brote. El uso de demasiada potencia del láser y morada tiempo resulta en daños en el centro de la flor, lo que afecta su crecimiento y / o supervivencia. Una vez se han identificado los parámetros adecuados, pueden ser reutilizados para posteriores experimentos. NOTA: Si la ablación inicial resulta insuficiente, es posible proceder a una segunda ablación en los siguientes días (Figura 2, C4 y D2). </li></ol></li></ol> 6. Configuración de imagen <ol><li> Utilizar un microscopio vertical. <ol&gt; <li> Llenar el plato de formación de imágenes con los ápices disecados con agua estéril, desionizada de modo que la superficie del medio se cubre en mm de agua 2,5-5 (Figura 1F). Sumerja completamente las muestras. NOTA: Cuando la formación de imágenes con un microscopio vertical, varios vértices se pueden colocar en el mismo plato de imagen. Sin embargo, si el proceso de formación de imágenes tiene una duración de más de una hora, yoduro de propidio tiende a ser diluida, y algunas muestras podría necesitar re-tinción antes de la imagen. </li><li> Coloque el plato de formación de imágenes en la platina del microscopio (Figura 1F). Bajar la lente de inmersión en agua y elevar el escenario para que la punta de la lente se sumerge en el agua. Proceder con cautela a fin de no aplastar los ápices disecados o sumergir la lente en el medio de formación de imágenes. </li><li> Si una burbuja de aire es atrapado en la punta de la lente, que chorros de agua con una pipeta de 1000 l para eliminarlo. </li><li> Bajo iluminación de epifluorescencia, la posición de uno de los ápices diseccionado en el campo de la lente utilizando el aire XYTroller. Mira a través de los oculares y se centran en la muestra utilizando el controlador Z. Proceder con cautela a fin de no aplastar la muestra. </li><li> Utilizando el software de microscopio confocal, zoom en la yema floral en ser fotografiado, y proceder a la obtención de imágenes de su muestra. </li></ol></li><li> Utilizar un microscopio invertido. <ol><li> Usando una pipeta de l 1000, poner una gota de agua estéril, desionizada en la punta de la lente. </li><li> Mantenga el plato de formación de imágenes al revés, y con una pipeta de 1000 l, añadir una gota de agua estéril, desionizada hasta el ápice diseccionado. </li><li> Coloque el plato de imagen al revés sobre la platina del microscopio (Figura 1G). Proceder con cautela a fin de no aplastar la muestra. </li><li> Bajo iluminación de epifluorescencia, posicionar el vértice diseccionado sobre la punta de la lente utilizando el controlador XY. Con el controlador Z, baje con cuidado la etapa hasta que la muestra alcanza la gota de agua en la punta de la lente. Una columna de agua debe formar between la punta de la lente y el medio. </li><li> Si no se forma la columna de agua, agregar cuidadosamente una gota de agua a la muestra con una pipeta de 1000 l. Añadir mangas improvisadas a la lente con el fin de añadir más agua en su punta, lo que facilita el establecimiento y el mantenimiento de la columna de agua (Figura 1H y 1I). </li><li> Bajo iluminación de epifluorescencia, mirar a través de los oculares y se centran en la muestra utilizando el controlador Z. Proceder con cautela a fin de no aplastar la muestra. </li><li> Utilizando el software de microscopio confocal, zoom en la yema floral en ser fotografiado, y proceder a obtener imágenes de la muestra. </li></ol></li><li> Si la realización de experimentos con lapso de tiempo, verter el agua del plato de imágenes y cerrarla para evitar la deshidratación en el tiempo entre los puntos. Coloque el plato de imagen con las muestras en día largo (16 h de luz) o días continuos, 16-22 ° C Condiciones de. muestras de Re-mancha antes de cada punto de tiempo. NOTA: Mientras que las células en desade ping órganos florales se dividen más rápidamente, las células en el meristemo floral división una vez o dos veces cada segundo día, y linajes celulares son fáciles de seguir con los puntos de tiempo cada 24 h. Sin embargo, si es necesario, es posible que la imagen de las muestras de cada seis horas. </li></ol> 7. Consideraciones sobre los parámetros de imagen NOTA: Cómo configurar los parámetros de imagen depende mucho del sistema confocal utilizado. A continuación se presentan sugerencias para algunos de estos parámetros que se pueden utilizar con cualquier microscopio confocal. Para más consideraciones sobre los parámetros de formación de imágenes, ver la sección de Discusión y referencia 14. <ol><li> Para la resolución XY: utilizar 1024 x 1024 para una buena resolución celular. Como alternativa, utilice 512 x 512 para reducir el tiempo de formación de imágenes, a expensas de la resolución. </li><li> Para la resolución Z: establecer el tamaño de paso a 0,5-1,5 m. Bajando el tamaño de paso aumenta la resolución Z sino también el tiempo de formación de imágenes. </li><li&gt; Para el agujero de alfiler: establecer el agujero de alfiler a 1-1,5 unidades ventiladas. El aumento del agujero de alfiler aumenta la intensidad de la señal, sino también el ruido de los aviones no focales. </li></ol> 8. Visualización de datos confocal <ol><li> Convertir las imágenes fijas de los puntos de tiempo de desarrollo de la flor en una película. <ol><li> Abrir las imágenes fijas (en formato JPEG o TIF) en el software (por ejemplo, Fiji). </li><li> Ir a Imagen&gt; Pilas&gt; Imágenes para el apilado. Las imágenes abiertas se agruparán en una pila. </li><li> Si el orden de las imágenes en la pila no se corresponde con el orden cronológico, utilizar el plugin Pila Clasificador (Plug-ins&gt; Pilas&gt; Pila Clasificador) para reordenarlos. </li><li> Para activar la pila en una película, ir a Archivo&gt; Guardar como&gt; AVI. </li></ol></li></ol>

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El autor no tiene nada que revelar.

A continuación, ofrecemos un protocolo para la obtención de imágenes, el desarrollo de los brotes de flor de Arabidopsis en vivo con un microscopio confocal y una lente de inmersión en agua. Si bien esto se puede hacer, ya sea con un montante o un microscopio invertido, es más fácil y rápido de usar la antigua. También vale la pena señalar que los diferentes sistemas confocal varían significativamente en términos de velocidad, sensibilidad y capacidad de separar las longitudes de onda. Los mejores microscopio confocal permiten ahora a la imagen de varios canales diferentes (por ejemplo, GFP, YFP, dsRed y yoduro de propidio; Figura 2 g) en las mismas muestras. Algunos microscopio confocal están equipados con un detector espectral, que puede recoger la fluorescencia de varios fluoróforos simultáneamente y separarlos después. Cuando se utiliza un detector regular, sin embargo, un conjunto de láseres y filtros debe ser utilizado para excitar y separar la fluorescencia de diferentes fluoróforos. Algunos fluoróforos tienen espectros de emisión totalmente distinta (por ejemplo, una CFPd YFP), y se pueden obtener imágenes de forma simultánea. Otros fluoróforos tienen espectros de emisión que se superponen parcialmente (por ejemplo, GFP y YFP), y en general tienen que ser fotografiado por separado, lo que aumenta el tiempo de formación de imágenes. Imaging cercanos fluoróforos también a menudo requiere la restricción de la cantidad del espectro se recoge para cada canal para evitar la fluorescencia de un fluoróforo de las fugas en el otro canal. Esto provoca una pérdida de intensidad de la señal recogida, que puede ser compensada por un aumento de la potencia del láser y la ganancia. Sin embargo, el tiempo de proyección de imagen prolongada y una mayor potencia del láser pueden blanquear y / o dañar la muestra. El aumento de la potencia del láser y / o ganancia también pueden aumentar el ruido de fondo. Optimización de intensidad de la señal, la resolución y el tiempo de proyección de imagen para cada muestra se realiza a través de un proceso de ensayo y error, e implica permanentes compensaciones. Este protocolo se explica cómo realizar la imagen confocal en vivo de los botones florales en desarrollo en los flancos de un ápice del brote diseccionado. EsoPuede argumentarse que el hecho de que el ápice del brote no está conectado al resto de la planta y crece en un medio que contiene citoquininas podrían afectar SAM y desarrollo de la flor. Sin embargo, este medio se diseñó empíricamente a través de un proceso de ensayo y error para asegurar el rodaje diseccionado meristemos apicales producen nuevos brotes de flores en el plastocrono normal, y que estos capullos de las flores se desarrollan normalmente 15. Del mismo modo, la disección sépalo no parece afectar los patrones de expresión de genes o el desarrollo del resto de la flor. Otros protocolos de detalle la forma de realizar la imagen confocal en vivo de la SAM todavía unido al resto de la planta (por ejemplo, referencia 11). Tales protocolos podrían adaptarse a, y ofrecen una alternativa útil para la obtención de imágenes de flores en desarrollo, sobre todo en el estudio de los procesos relacionados con citoquininas. Presentan varios inconvenientes, sin embargo: los tallo se alarga y giros, y cambia la orientación de los capullos de las flores; unnd mientras imágenes de un ápice del brote unido al resto de la planta funciona bien con un microscopio vertical, es mucho más complicado que hacerlo con un microscopio invertido. Lentes de inmersión tienen una mejor apertura numérica (NA) que las lentes &quot;secos&quot; (es decir, las lentes que están separados de la muestra por el aire), y por lo tanto proporcionan una resolución más fina de la muestra, lo cual es crítico cuando se utiliza un microscopio confocal. El uso de una lente de inmersión en agua por lo tanto proporciona una mejor NA de una lente seca, mientras que la prevención de la ápice del brote de deshidratación durante el proceso de formación de imágenes. Mientras que la glicerina y lentes de petróleo tienen una AN aún mayor que las lentes de agua, que requieren el uso de un cubreobjetos, que es muy poco práctico con una muestra del tamaño de un ápice del brote, que también sigue creciendo durante los experimentos de lapso de tiempo. Dado el tamaño de las muestras (dependiendo de las etapas florales, las pilas pueden ser más de 150 m de espesor), también es importante la utilización de una lente con una distancia de trabajo larga. Utilizamos típicamente una lente de 20 o 40X con un NA de 1 y una distancia de trabajo de 1.7-2.5 mm. Software microscopio confocal ofrece varias formas de visualizar datos confocal, incluyendo reconstrucciones tridimensionales (figura 2, B1, B2 y B4) y vistas rebanada (Figura 2, B3). Aunque las vistas tridimensionales más comúnmente utilizados son proyecciones de máxima intensidad de los Z-pilas confocal (Figura 2, B1 y B4), algunos software (por ejemplo ZEN y Imaris) también ofrecen vistas de transparencia que filtra la señal de las partes más profundas de la muestra (Figura 2, B2), que puede ser útil cuando se mira en procesos que tienen lugar, o genes expresados en, la capa epidérmica. La intensidad de señal puede ser codificado con un solo color (figura 2, B1), utilizando inte pixelnsity, o el uso de un código de color (Figura 2, B4). imagen confocal en vivo no sólo ofrece información valiosa cualitativos en el desarrollo de flores, sino que también proporciona potencialmente biólogos del desarrollo con una gran cantidad de datos cuantitativos. Software diferente (por ejemplo Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permite la cuantificación del número o el volumen de células que expresan uno o varios reporteros, o el nivel de expresión de reportero en células diferentes. Dicho software también puede ser utilizado para llevar a cabo la segmentación de células automático, realizar un seguimiento de los linajes de células y cuantificar el crecimiento. Este software ofrece diferentes herramientas similares, pero también difiere en muchos aspectos. MARS-ALT y MorphoGraphX fueron diseñados específicamente para las plantas 15, 20, 21, a diferencia de Imaris unand Fiji. MorphoGraphX ​​sólo permite la segmentación y análisis de la capa epidérmica, mientras que Imaris y MARS-ALT permiten la segmentación y el análisis de toda la muestra. Sin embargo, MARS-ALT requiere la formación de imágenes antes de la misma muestra desde tres ángulos diferentes 15, y Imaris sólo requiere una sola pila. El acceso a la información cuantitativa es fundamental para mejorar nuestra comprensión del desarrollo de la flor.

La mayor parte del cuerpo de la planta forma post-embrionaria de grupos de células madre situadas en o cerca de la punta - o meristemos apicales - de los brotes y raíces. Todas las estructuras por encima del suelo de la planta adulta derivan del meristemo apical del brote (SAM), que produce continuamente órganos laterales en sus flancos: Hojas durante la fase vegetativa, y meristemos florales (FM) después de que éste pase a la fase reproductiva. FM a su vez se convierten en flores. Mientras que la Arabidopsis SAM produce órganos laterales de una en una, en un patrón repetitivo, espiral, fms producir cuatro tipos de órganos florales dentro de cuatro verticilos, de una manera parcialmente síncrono, con múltiples programas de desarrollo desentrañar simultáneamente. Las redes genéticas que subyacen a la especificación de la identidad de los diferentes órganos florales se han descifrado parcialmente (para revisiones, véanse las referencias 1, 2), pero muchos aspectos de la flor development, tales como floral de posicionamiento de órganos y la definición de los límites entre verticilos, siguen siendo poco conocidos. Estudios de genética molecular tempranas de desarrollo de la planta en su mayoría se basaban en técnicas tales como hibridación in situ y los reporteros GUS para analizar la expresión génica. Si bien estos métodos han proporcionado una gran cantidad de información y contribuido en gran medida a nuestra comprensión del crecimiento de las plantas y el desarrollo de flores, hay limitaciones importantes: carecen de buena resolución celular, no permita la fácil observación del patrón de expresión de múltiples genes en la misma muestras, y esto es importante, sólo pueden aplicarse a los tejidos muertos y fijos. Los recientes avances en microscopía confocal han superado estas limitaciones y proporcionar los biólogos del desarrollo de una herramienta poderosa para investigar los procesos de morfogénesis de plantas subyacente. En particular, la microscopía confocal permite la observación de los tejidos vivos y órganos a lo largo de su formación, que es critical para comprender plenamente un proceso esencialmente dinámico como el desarrollo. De formación de imágenes confocal en vivo se ha usado ampliamente para analizar el crecimiento aéreas de las plantas y la producción de órganos laterales por el SAM (por ejemplo, Referencias 3, 4, 5, 6), pero con la excepción de unos pocos informes (por ejemplo, las referencias 7, 8, 9, 10), que no ha sido ampliamente aplicado al estudio de desarrollo de la flor. Los protocolos para la imagen confocal en vivo de la SAM están disponibles (por ejemplo, hace referencia a 11, 12), y proporcionan una buena base para la forma de la imagen de los botones de las flores en desarrollo que rodean el SAM. Sin embargo, los brotes de flor de imagen presenta retos específicos: por ejemplo,brotes de flor se convierten rápidamente en más grande que el SAM, y en la etapa 4, sépalos comenzar a cubrir las FM (etapas como se describe en la referencia 13), y de atenuación de la fluorescencia de los tejidos subyacentes (Figura 2A). A continuación, ofrecemos un protocolo detallado que explica cómo realizar la imagen confocal en vivo en el desarrollo de los brotes de flor de Arabidopsis utilizando un montante o un microscopio invertido y una lente de inmersión en agua. Hemos publicado anteriormente en este protocolo de referencia 14.

<table><tbody><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td>Dumont Style 5 Inox, for apex dissection</td></tr><tr><td>Pin Vise</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13560</td><td>80 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Straight Stainless Steel Needles&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-50</td><td>0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Round plastic boxes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64332</td><td>transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes</td></tr><tr><td>Rectangular hinged boxes</td><td>Durphy Packaging Co.&amp;nbsp;</td><td>DG-0730</td><td>transparent, 2-7/8&amp;rdquo; long, 2&amp;rdquo; wide, 1-1/4&amp;rdquo; deep, to use as imaging dishes with an upright microscope</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td><td>VWR</td><td>25382-064</td><td>transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope</td></tr><tr><td>P10 and P1000 pipettes&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>with corresponding filter tips</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>with an 80-90X maximum magnification</td></tr><tr><td>Laser ablation system</td><td></td><td></td><td>for sepal ablation</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 or 40X water-dipping lens</td><td></td><td></td><td>with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog basic salt mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>without vitamins</td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0761</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Pyridoxine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6280</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Thiamine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>N6-Benzyladenine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td>BAP, a cytokinin</td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td>dilute in water to 80&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL, to stain the plasma membranes</td></tr></tbody></table>

live confocal imaging of developing arabidopsis flowers

El estudio del crecimiento y desarrollo de la planta ha dependido durante mucho tiempo en las técnicas experimentales utilizando tejidos muertos, fijos y que carecen de celulares de resolución adecuada. Los recientes avances en microscopía confocal, junto con el desarrollo de numerosos fluoróforos, han superado estos problemas y ha abierto la posibilidad de estudiar la expresión de varios genes simultáneamente, con una buena resolución celular, en muestras vivas. imagen confocal en vivo proporciona los biólogos de plantas con una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo, y se ha utilizado ampliamente para estudiar el crecimiento radicular y la formación de órganos laterales sobre los flancos del meristemo apical. Sin embargo, no ha sido ampliamente aplicado al estudio del desarrollo de la flor, en parte debido a los problemas que son específicos para la formación de imágenes de flores, tales como los sépalos que crecen sobre el meristemo flor, y filtrar la fluorescencia de los tejidos subyacentes. A continuación, presentamos un protocolo detallado para llevar a cabo la imagen confocal en vivo en vivo, desarrollando Árabeidopsis capullos, ya sea utilizando un montante o un microscopio invertido.

La Figura 2 presenta diferentes vistas de confocales Z-pilas de capullos de flores Arabidopsis vivas que expresan diferentes genes indicadores fluorescentes, y se tiñeron con yoduro de propidio (Figura 2, A-C5 y G) o FM4-64 (Figura 2, E1-F) a proporcionar una resolución clara celular. La mayoría de los sistemas confocales permiten la obtención de imágenes de dos fluoróforos con espectros de emisión que no se solapan tal como GFP o YFP junto con ya sea yoduro de propidio o FM4-64 (Figura 2A - 2F). Los mejores sistemas confocales también son capaces de separar múltiples fluoróforos con espectros de emisión que se superponen parcialmente en las mismas muestras, tales como GFP y YFP, y dsRed y yoduro de propidio (Figura 2G). Tres ejemplos de experimentos de lapso de tiempo se presentan en la figura2 y muestran capullos de flores en desarrollo normalmente después de la ablación sépalo se realizó ya sea con un sistema de ablación por láser (Figura 2, alquilo C1-C5 y D1-D5) o manualmente con un pasador-tornillo de banco y un pasador de metal (Figura 2, E1-E2). Tenga en cuenta que el brote de flor se muestra en la Figura 2, E1-E2 es de una planta mutante superman-1, que es la razón por primordios carpelo no se observan en el centro de la yema en la etapa 7. La ablación por láser de emergente primordios sépalo del brote de flor se muestra en la Figura 2, alquilo C1-C5 les impide que cubre la FM, que todavía se pueden obtener imágenes en la etapa 5 (Figura 2, C5). A la inversa, en el caso de la yema floral se muestra en la Figura 2, D1-D5, la ablación por láser sólo retrasa el crecimiento sépalo, pero sépalos eventualmente creció para cubrir la mayor parte de la FM por la etapa 5 (Figura 2, D5 </strong&gt;). Por el contrario, si demasiada potencia del láser y tiempo de permanencia se utiliza durante la ablación con láser, el daño se extiende a la parte central de la flor y afecta su crecimiento y en ocasiones da lugar a la posterior muerte de toda la yema floral. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> Figura 2: Visualización de confocal Z-pilas de yemas florales en vivo. A y B2 son vistas de transparencia; B1 y B4-G son proyecciones de máxima intensidad; B3 es una vista rebanada ortogonal. (A - E2) flores que expresan un reportero Venus para el gen APETALA3 (verde); paredes celulares se tiñeron con yoduro de propidio (rojo, a excepción de B4, verde). (A) Inflorescencia; números indican etapas florales; sépalos en la etapa 4 y 5 flores filtran la fluorescencia del reportero Venus, que normalmente forms un anillo. Tenga en cuenta que algunos brotes de flores aparecen inclinadas con respecto a la inflorescencia. (B1 - B4) Cuatro vistas diferentes de la misma confocal Z-pila de un capullo de la etapa 5 de la flor: proyecciones de máxima intensidad (B1 y B4) con intensidad de señal Venus estará con intensidad de píxel en el color verde (B1) o con código de color fuego (B4; código de color se muestra en la parte inferior del panel); vista transparencia (B2) y vista rebanada ortogonal (B3; la orientación XY, XZ y YZ de las rodajas se indica en el panel). (C1 - C5) 4-días de lapso de tiempo de un brote flor individual de la etapa 3 a la etapa 5; ablación láser (marcados como rasgos blancos) realizó en el día 1 y el día 3 fueron suficientes para evitar que los sépalos de cubrir el centro del brote de la flor en la etapa 5. (D1 - D5) 4-días de lapso de tiempo de un brote de flor individuo de escenario3 a la etapa 5; ablación láser realizados en días 1, 2 y 3 fueron insuficientes para evitar que los sépalos de cubrir el centro del brote de la flor. (E1 - E2) del brote de flor individual después de la extracción manual de la abaxial y sépalos adaxial (E1), y de todos los sépalos (E2); puntas de flecha blancas indican sépalos restantes; asteriscos blancas indican cicatrices resultantes de la eliminación de los sépalos. (F) Etapa 7 flor apetala1-1 expresar un reportero DR5-3xVenusN7 18 (verde); membranas plasmáticas se tiñeron con FM4-64 (rojo); puntas de flechas azules indican las estructuras semejantes a hojas que reemplazan sépalos y no cubren la yema floral. (G) Etapa 4 del brote de flor que expresa un reportero GFP fluorescente para Dornröschen-LIKE 7 (verde), un reportero Venus para SUPERMAN (rojo) y un reportero dsRed para CLAVATA3 19 (cian); Célulasparedes se tiñeron con yoduro de propidio (gris). d: día; ST: etapa. Barras de escala = 25 m; escala es idéntico en B1, B2 y B4, en C1-C5 y en D1-D5. Esta cifra se modificó a partir de referencia 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

imagen confocal en vivo ofrece biólogos con una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la imagen confocal en vivo de flores en desarrollo de Arabidopsis.

Vivir Imagen confocal de desarrollo de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K vistas.  California Institute of Technology.  imagen confocal en vivo ofrece biólogos con una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la imagen confocal en vivo de flores en desarrollo de Arabidopsis. 

Video: Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Inducibles, expresión de específicas del tipo celular en Arabidopsis thaliana mediada a través de LhGR Trans-activación

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Investigación

Genética

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Biología del Desarrollo

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Proyección de imagen confocal vivo de meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

Imágenes de células vivas de citoesqueleto de microtúbulo y manipulación micromecánica del Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Un método simple para imágenes Arabidopsis Uso de hojas perfluorodecalina como un medio de imágenes infiltrativas

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biología

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análisis específico de célula de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Hojas usando citometría de flujo

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em&gt; Cotiledones Arabidopsis</em&gt; Epidermis durante la germinación

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Medición Espacial y Temporal Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en plantas de Arabidopsis

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Un método versátil para el montaje de Arabidopsis las hojas para la proyección de imagen de Time-lapse Intravital

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Vivir Imagen confocal de desarrollo de Arabidopsis Flores

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