Damos las gracias a Philipp Denninger para obtener ayuda con la preparación de vídeo y Chaudhuri Bhavna para proporcionar líneas de plantas que expresan FRET sensores. Este trabajo fue apoyado por becas de la National Science Foundation (MCB 1.021.677), el Departamento de Energía (DE-FG02-04ER15542) de la WBF, los Institutos Nacionales de Salud y el Instituto Médico Howard Hughes de SRQGG fue apoyada por una larga EMBO -período de la beca. MM fue apoyado por la Fundación Alexander von Humboldt.

Nota: Realice todos los pasos de las medidas preparatorias en condiciones estériles. 1. Preparación de los conos de plástico para la germinación de la semilla <ol><li> Llenar un 10 cm de placa de Petri con medio de crecimiento que contenía 1% de agar a un espesor de 5 mm. Utilizamos una fuerza media modificada Hoagland medio 4, pero la composición del medio debe ser elegido para adaptarse a los requisitos individuales experimentales. </li><li> Mientras que el medio es todavía líquida, utilice una pipeta multicanal para cubrir puntas de pipeta de 10 ml con 5 ml de medio de la placa de Petri. </li><li> Guarde las puntas llenas en la caja de punta de la pipeta hasta que el medio es sólido, luego se corta a 4 conos de plástico mm de largo y el lugar en posición vertical en una placa de Petri que contiene medio de crecimiento sólido. </li></ol> 2. La germinación de semillas y crecimiento de plántulas <ol><li> Surface esterilizar las semillas en 5% de NaOCl durante 5 min, se lava tres veces con agua estéril, a continuación, colocar una sola semilla en la parte superior de cada uno de los cono medio llenos. </li><li> Selle la placa con cinta Micropore (3M) y se almacena a 4 ° C para sincronizar la germinación. </li><li> Después de tres días, transferir las placas a una cabina de crecimiento para iniciar la germinación. Nuestras condiciones de crecimiento son de 23 ° C en un ciclo de 16 horas de alta light/8h oscuro (Intensidad de la luz: 100 μE m -2 s -1). </li><li> Entre 5 y 7 días después de la germinación, las plántulas deben estar listos para la transferencia a la RootChip. En este momento, puntas de las raíces deben estar cerca de los desagües de fondo de los conos de plástico. Comprobar el estado de plántula, longitud de raíz y, en su caso, la expresión de un marcador fluorescente bajo un microscopio de disección. </li><li> Marcar plántulas individuales para la transferencia en el chip. Seleccione una decena de plantas de semillero en caso de que uno se daña durante la transferencia. </li></ol> 3. La transferencia de plántulas en el RootChip <ol><li> Para esterilizar el RootChip de experimentos a largo plazo, envuelvael dispositivo en papel de seda, el lugar en un plato Petri de vidrio, y autoclave. </li><li> Una vez que el RootChip se haya enfriado, cubrir con medio de cultivo líquido. El RootChip debe estar completamente sumergido, pero el nivel del líquido no debe ser mayor de 3 mm por encima de la superficie RootChip. </li><li> Con una pipeta 20 ul, tirar de medio a través de la entrada de la raíz y salida de la cámara para llenar la cámara de observación con el medio. </li><li> Conos de plástico diseñados seleccionado en el paso 2.5 en las entradas de RootChip. Los conos deben quedar bien ajustados en las entradas. Dado que el RootChip está montado sobre una fina capa de cristal óptico, no se aplican demasiada presión al chip. </li><li> Incubar la RootChip durante la noche en medio líquido. Para evitar flotante, colocar dos portaobjetos de vidrio en el chip. Añadir una barra de agitación magnética y cerrar el plato. </li><li> Traslado a la asamblea a un agitador magnético y agitar suavemente el medio. </li><li> La entradas RootChip se cruzan los canales en un ángulo de 30 ° en el dispositivo normal a FACIlitate crecimiento de las raíces en los canales (Figura 1A). Para apoyar aún más el crecimiento en la dirección deseada, incline ligeramente el conjunto mediante la colocación de un portaobjetos de vidrio bajo la placa de Petri en el lado opuesto de la viruta de las salidas. </li><li> Para mantener el ciclo luz / oscuridad, iluminar las plantas de semillero con una lámpara de anillo (Intensidad de la luz: 100 μE m -2 s -1) conectado a un temporizador. </li></ol> 4. Conexión de la RootChip al Transportista <ol><li> El día siguiente, llenar un vial hermético, presurizable con medio de crecimiento líquido (Figura 1B). </li><li> Invertir el soporte de chip y colocarlo sobre una superficie estable. Quitar el RootChip del medio líquido e insertarla lado PDMS abajo en la abertura inferior del soporte de chip. Oriente el chip de manera que el lado que contiene las entradas de la capa de control se enfrenta al lado de los conectores de tubo de presión de línea en la pared lateral portador. </li><li> Secar la cubierta de vidrio en elparte inferior del chip secando suavemente con papel de seda. Asegure el RootChip a la compañía con la cinta y el derecho a toda la asamblea. </li><li> Conectores de tubería se realizan cortando un tubo flexible de plástico microperforado (TYGON, 0.20 &quot;x 0.060&quot; OD) en trozos de 5 cm de largo y conecta a los tubos de acero inoxidable microperforado (Nueva Inglaterra tubo pequeño, 0,025 &quot;de diámetro exterior x 0.013&quot; x 0.75 &quot; de largo). Rellenar los conectores de tubo con agua usando una jeringa y el tapón cada conector del tubo en la entrada de control de la capa correspondiente en el chip. El agua después se llenan los canales de la capa de control y se utiliza para transmitir la presión a las válvulas micromecánicos. </li><li> Enchufe los extremos opuestos de las líneas en los medios de comunicación y envase de la solución (s). Aplicar presión en el vial de solución con una jeringa de aire. La presión de aire mayor en el envase de la solución forzará líquido en las líneas. </li></ol> 5. Montaje de la RootChip en el microscopio <ol><li> Coloque el soporte sobre el Microscetapa de opa. Para reducir la posibilidad de que el conjunto de desplazamiento durante el curso del experimento, debido a las vibraciones en la sala, el portador debe encajar exactamente en las muescas del inserto etapa. </li><li> Las válvulas de chips y el flujo del medio a través del chip son controlados por la presión del aire. Dos líneas con los reguladores se separaron de una línea de presión principal - una se utiliza para controlar el flujo de medio a través de los canales, y el otro se conecta a las válvulas de solenoide de aire que accionan las válvulas hasta empuje de la capa de control. Las válvulas de solenoide se manejan desde el ordenador a través del controlador USB de la válvula (desarrollado por Rafael Gómez-Sjöberg, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley). Cierre las dos reguladores de presión antes de conectar el chip. </li><li> Añadir unos mililitros de agua a los embalses de la compañía para mantener la humedad alta dentro de la asamblea. Este paso se debe repetir en curso de los experimentos más largos para mantener las plantas se sequen. Mantenga el volumen bajo para reducir al mínimo tél cantidad de líquido que podría ser derramado sobre el microscopio. Para experimentos a largo plazo, la salida de los puntos de venta de chips puede ser guiado en los depósitos de la compañía mediante la conexión de los puntos de venta de chips para los depósitos con un tubo microperforado (ver paso 4.4). Alternativamente, el flujo de salida que se acumula sobre la superficie del chip pueden ser recogidos por pipeteado. </li><li> Preparar hojas cuadradas de plástico transparente de protectores de hojas (C-Line). Fijar el plástico transparente a la compañía por la cinta de doble cara para mantener la humedad alta en la asamblea. </li><li> Coloque el anillo de luz sobre el chip y mantener el ciclo luz / oscuridad. El anillo de luz debe ser desconectada antes del comienzo de cualquier experimento que utiliza marcadores fluorescentes, como la iluminación directa va a interferir con la colección de imágenes. </li></ol> 6. Funcionamiento de la RootChip utilizando el interfaz de LabVIEW La interfaz de controlador de RootChip para la plataforma de software LabVIEW puedepuede descargar desde nuestro sitio web <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> Las válvulas en el chip se cierran mediante la aplicación de presión a la capa de control, en este caso mediante la apertura de las válvulas de solenoide de aire. La interfaz de control permite el accionamiento de las válvulas haciendo clic en el botón situado debajo del número de la válvula. Verde brillante indica la aplicación de presión y el cierre de una válvula de chip (Figura 2B). Activar las tres válvulas de entrada de solución en la interfaz de controlador antes de abrir los reguladores de presión. Nota: La interfaz de controlador dispone de un circuito de retroalimentación, que permite el seguimiento del estado del sistema. Esta función puede activarse haciendo clic en la &quot;relectura&quot; en la interfaz de controlador. </li><li> Abra el regulador de presión para la capa de control y establecido inicialmente en 15 psi, a continuación, abra el regulador para la capa de flujo y fijado inicialmente a 5 psi. Dependiendo del caudal deseado, las presiones pueden ser ajustados después. </li><li> Abrir la válvula de entrada para el medio de crecimiento de elección para vaciar las cámaras con el medio. </li><li> Ver las trayectorias de flujo bajo el microscopio. Normalmente, el aire queda atrapado en los canales de flujo y debe ser eliminado. Adicionalmente, los canales de la capa de control todavía contienen aire que debe ser forzado a salir y se sustituye por el agua de los tubos conectores (sin salida de llenado). Ambas tareas se logran mediante el lavado de cada una de las ocho cámaras en varias ocasiones (5 psi) hasta que el aire es forzado desde los canales en el PDMS (&quot;desgasificación&quot;). Nota: El controlador de interfaz puede ser programado para automatizar experimentos. Tales rutinas también puede utilizarse para desgasificar el chip. </li></ol> 7. Los resultados representativos El propósito principal de la RootChip es combinar una plataforma de imágenes y un sistema de perfusión en un solo dispositivo con un alto nivel de integración. Para demostrar la manipulacióndel microambiente de las raíces que lavarse las cámaras con colorante oscuro (dilución 1:4 en medio hidropónico) y se midió el intercambio de fluidos dentro de las cámaras. A la presión recomendada de 5 psi se midió un cambio completo dentro de 10 segundos a una velocidad de flujo calculado de aproximadamente 1,5 l / min (Figura 3). También se observó crecimiento de las raíces de las plántulas, en este caso crecido en la oscuridad y se suministra con 10 mM de glucosa como fuente de energía externa (Figura 4). Dependiendo de las condiciones de crecimiento tales como la luz y la composición del medio, las plantas se puede observar en la RootChip de hasta tres días. El RootChip se ha utilizado para monitorizar la glucosa intracelular y los niveles de galactosa en las raíces que expresan nanosensores genéticamente codificados, basado en Förster Resonancia transferencia de energía (FRET) 5-7. Las raíces en el chip se perfundieron con pulsos cuadrados de glucosa o galactosa solución ( <strong&gt; Figura 5). Los niveles intracelulares de azúcares fueron controlados y se muestran aquí expresado como una relación de la intensidad de la Citrino fluoróforo receptor a la intensidad de la ECFP donante. El aumento de la relación indica la acumulación de azúcar. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. RootChip principio. <ol class="ualpha"><li> El RootChip cuenta con ocho cámaras de observación para el crecimiento y la imagen de las raíces. Las primeras semillas germinan en conos de plástico - fabricada a partir de puntas de pipeta de plástico - que se llena con un medio sólido. La punta de la raíz crece a través del medio y llega a la cámara donde un flujo continuo de medio líquido mantiene las condiciones de la constante de cámara. Las válvulas micromecánicos (rojo) controlar el flujo. El chip está montado sobre una cubierta de vidrio óptico. El dibujo no está a escala. (Adaptado con el permiso de Grossmann et al., 2011 Plant Cell.) </li><li> Scheme de un frasco de solución de presurizable con el diafragma (rojo). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Conectar y montar el RootChip. <ol class="ualpha"><li> Vista superior de la RootChip completamente conectado y el vehículo montado en un microscopio invertido. </li><li> Esquema que ilustra el sistema de válvulas y el interfaz de control. Un ejemplo de una válvula de ajuste para guiar el flujo de fluido a una sola cámara se muestra. Mientras que las válvulas de 4 a 8 actúan como válvulas, válvulas individuales de 0 a 3 actúan en grupos. Con este sistema una cámara individual puede ser abordado mediante la activación de una combinación de válvulas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Intercambio de soluciones en el cap de observaciónámbar. de visualización del tipo de cambio de líquido en una cámara de observación utilizando solución de colorante. La imagen es una superposición de campo claro y falso color de intensidad de la señal de tinte. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. El chip crecimiento de las raíces. La observación de una sola raíz creciente expresar un fluorescente FRET nanosensor para la glucosa / galactosa en el transcurso de 20 horas. Formato de hora: hh: mm, barra de escala: 100 m. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Medir los niveles de azúcar en la intracelulares utilizando nanosensores FRET. <ol class="ualpha"><li> La cantidad de sensor se muestra como la intensidad citrino dentro de la punta de la raíz (izquierda). La respuesta de la intracelular FRET nanosensor para la aplicación de la glucosa o galactosa solución se muestra como imágenes ratiometric. (Adaptado con el permiso de Grossmann et al., 2011 PlaCelular nt) barra de escala. 100 m. </li><li> Seguimiento de FRET los cambios de relación en respuesta a impulsos repetidos tres cuadrados de la glucosa (verde) y galactosa (en rojo). </li></ol>

<ol>
	<li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors:+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells.">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li><li>Loqu&#233;, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wir&#233;n, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake.">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li><li>Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+maltose+uptake+in+living+yeast+cells+by+fluorescent+nanosensors.">Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li><li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants.">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li><li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip.">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+Compatibility+of+Poly(dimethylsiloxane)-Based+Microfluidic+Devices.">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las principales ventajas de la RootChip sobre los métodos convencionales de crecimiento son la preparación mínimamente invasiva para la microscopía, la capacidad de alterar de forma reversible y repetidamente el entorno de las raíces, y la capacidad para la observación continua de tejido sano desarrollo competente y fisiológicamente durante un período de varios días. Anteriormente, las plántulas fueron cultivadas en medios gelificados verticalmente y se transfiere a un sistema de perfusión inmediatamente antes del experimento, que permite sólo medir raíces individuales en un momento 8. Herramientas de microfluídica se han utilizado para la Arabidopsis, pero en un nivel de integración bajo 9 o sin control de la perfusión 10. El RootChip combina un alto nivel de integración con la capacidad de automatizar el flujo de experimentos mediante la orientación precisa. Otra ventaja de esta plataforma, típico de todos los dispositivos de microfluidos 11, es que sólo cantidades mínimas de líquido se requiere para suministrar la raíz con la tuerca necesariorients, incluso para los experimentos que abarcan varios días. El RootChip está diseñado como un dispositivo de un solo uso, pero dado que los costes de producción de patatas fritas son bajas, las pequeñas cantidades de reactivos consumidos hace que el chip todavía muy rentable. Hay algunos pasos críticos que deben ser adoptadas para garantizar la salud de las plantas de semillero: El volumen en los conos de plástico es sólo l 3-4, que comenzará a secarse cuando se expone al aire. Por lo tanto, es fundamental que los conos se transfieren en el chip rápidamente y la humedad se mantiene alta hasta que las raíces han llegado a las cámaras de observación, que los abastecen con agua suficiente. Pasos 4.2 a 4.5 se debe realizar rápidamente y sin interrupción para evitar la desecación de las plántulas. Pasos 3,5 - 3,8 describir la incubación de la viruta en medios líquidos durante el cual las raíces crecen en las cámaras de observación. Este paso puede ser omitido por el montaje de la viruta en la carrier inmediatamente e iniciar la perfusión constante con medio de crecimiento. Sin embargo, se recomienda sumergir en el medio de cultivo durante la noche, ya que tiene algunas ventajas: 1) Se crea un ambiente húmedo por lo que las plántulas son menos propensos a ser desecado a medida que crecen dentro de la cámara de observación, 2) el chip se sumerge en un líquido, por lo que desgasificación (paso 6,4) será más rápido. Es importante utilizar los medios con bajas concentraciones de soluto. Soluciones más concentradas pueden precipitar y obstruir los canales, sobre todo si el chip se utiliza durante varios días. Una vez que el dispositivo está conectado a la línea de presión de aire, el flujo de medio de cambio es controlada por la presión hidráulica en las válvulas. Para garantizar el cierre adecuado de las válvulas micromecánicos, es importante elegir una presión de control que es aproximadamente tres veces mayor que la presión del flujo. La presión de aire no debe exceder de 15 psi como el fluido será empujado fuera de las entradas de la raíz. Presiones más altas may también provocar la deslaminación del chip, que hace que el chip inutilizable. Una limitación de la RootChip es que PDMS es poroso e hidrofóbicas. Mientras que el material es prácticamente inerte a soluciones acuosas, que pueden absorber compuestos orgánicos 12. Esto puede interferir con un intercambio rápido de soluciones como compuestos orgánicos pueden filtrarse a partir del material, incluso cuando el suministro de este compuesto se ha detenido en la entrada. Debido a la porosidad, el uso de disolventes orgánicos que pueden causar la hinchazón de la PDMS 12. Seguimos para optimizar la RootChip y extender su utilidad, por ejemplo con las raíces de las plantas de cultivo. Creemos que mejorando el acceso a la raíz para el tratamiento y la observación, las herramientas de microfluidos, como el RootChip abrirá nuevas dimensiones de la investigación de la raíz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artículos </td><td> Fuente </td><td> Información </td></tr><tr><td> El portador de chip, software y otro tipo de información. </td><td> Institución Carnegie - DPB </td><td> CAD y CNC para la fabricación de los archivos de soporte, software de control y más información están disponibles para su descarga desde el sitio web <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip~~HEAD=NNS</a> Los transportistas también se pueden pedir desde este sitio web. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Fundición de Stanford </td><td> Diseños de máscaras y protocolos de fabricación están disponibles bajo petición. Listo para usar RootChips se puede pedir a <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Chip de la controladora </td><td> -Casa construida-</td><td> El sistema de controlador de la válvula automática fue desarrollado originalmente por Rafael Gómez-Sjöberg, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley. Una instrucción detallada sobre cómo construir su propio controlador de la válvula de accionamiento se puede encontrar en <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse fluorescence imaging of arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the rootchip

Las funciones de las raíces como el ancla de la planta física y es el órgano responsable de la captación de agua y nutrientes minerales tales como los elementos nitrógeno, fósforo, sulfato y de seguimiento que las plantas adquieran en el suelo. Si queremos desarrollar enfoques sostenibles para la producción de alto rendimiento de los cultivos, tenemos que comprender mejor cómo se desarrolla la raíz, tiene un amplio espectro de nutrientes, e interactúa con organismos simbióticos y patógenos. Para lograr estas metas, tenemos que ser capaces de explorar sus raíces en detalle microscópico durante períodos de tiempo que van desde minutos a días. Hemos desarrollado el RootChip, un polidimetilsiloxano (PDMS) - dispositivo de microfluidos basada en, lo que nos permite crecer y las raíces de las plántulas de Arabidopsis imagen, evitando cualquier tensión física a las raíces durante la preparación para la imagen 1 (Figura 1). El dispositivo contiene una estructura de canal bifurcado con válvulas de micro-mecánicos para guiar el flujo de fluidoa partir de entradas de solución a cada una de las ocho cámaras de observación 2. Este sistema de perfusión permite el microambiente raíz para ser controlado y modificado con precisión y rapidez. El volumen de las cámaras es de aproximadamente 400 nl, por lo que requieren sólo cantidades mínimas de solución de ensayo. A continuación presentamos un protocolo detallado para el estudio de la biología de raíz en el RootChip el uso de imágenes basadas en los enfoques de la resolución en tiempo real. Las raíces pueden ser analizados a lo largo de varios días utilizando microscopía de lapso de tiempo. Las raíces pueden ser perfundidos con soluciones nutritivas o inhibidores, y hasta ocho plantas de semillero pueden ser analizados en paralelo. Este sistema tiene el potencial para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo el análisis de crecimiento de las raíces en la presencia o ausencia de productos químicos, la fluorescencia basada en el análisis de la expresión génica, y el análisis de los biosensores, por ejemplo FRET nanosensores 3.

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Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo de plántulas de Arabidopsis en el RootChip, una plataforma de imágenes de microfluidos que combina el control automatizado de las condiciones de crecimiento con control microscópico y la raíz FRET basada en la medición de los niveles intracelulares de metabolitos.

Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

time-lapse-fluorescence-imaging-arabidopsis-root-growth-with-rapid

Research

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Bioengineering

19.5K vistas.  Carnegie Institution for Science. Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo de plántulas de Arabidopsis en el RootChip, una plataforma de imágenes de microfluidos que combina el control automatizado de las condiciones de crecimiento con control microscópico y la raíz FRET basada en la medición de los niveles intracelulares de metabolitos.

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Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

Demostrando la Utilización del Espectrómetro de Novela de la Fuerza gravitacional para estirar y medir las proteínas fibrosas

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

Investigación

Bioingeniería

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Síntesis de oro Nanostar con un método de la Simiente de Plata crecimiento mediada por

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture cellular behaviors involved in developmental processes.&#160; The ability to track and follow cell movements is limited by sample movements that occur due to drift of the sample or, in some cases, growth during image acquisition. Tracking cells in datasets affected by drift and/or growth will incorporate these movements into any analysis of cell position. This may result in the apparent movement of static structures within the sample. Therefore prior to cell tracking, any sample drift should be corrected. Using the open source Fiji distribution 1 &#160;of ImageJ 2,3 and the incorporated LOCI tools 4, we developed the Correct 3D drift plug-in to remove erroneous sample movement in confocal datasets. This protocol effectively compensates for sample translation or alterations in focal position by utilizing phase correlation to register each time-point of a four-dimensional confocal datasets while maintaining the ability to visualize and measure cell movements over extended time-lapse experiments.

Time-lapse microscopy allows the visualization of developmental processes. Growth or drift of samples during image acquisition reduces the ability to accurately follow and measure cell movements during development. We describe the use of open source image processing software to correct for three dimensional sample drift over time.

Muestra de Corrección de la sincronización Tras 4D Confocal Time-lapse de imágenes

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

La morfología del pelo de la raíz de plántulas de Arabidopsis en una plataforma de microfluídica de dos capas de imagen

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

Replicación biomimética de la microestructura de superficie raíz mediante alteración de la litografía blanda

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Imágenes de flujo sanguíneo con Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...