Este proyecto de investigación fue apoyada por el premio número R21AA017735 (YS) de los Institutos Nacional de Abuso de Alcohol y Alcoholismo. El contenido es de exclusiva responsabilidad del autor y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol y Alcoholismo o los Institutos Nacionales de Salud. El autor también desea agradecer a Charisse Montgomery para la edición de este manuscrito.

1. Los animales de cría y trófico Tratamiento Peptide <ol><li> Raza C57BL/mice mediante la colocación de los ratones hembra (~ 6 semanas de edad, peso promedio 20 g) en jaulas de origen macho durante 2 horas. </li><li> Compruebe si hay un tapón de esperma y / o citología vaginal inmediatamente después. </li><li> Si es positivo, designar este punto en el tiempo como el día embrionario 0 (E0). </li><li> El E7, peso coincidir las mujeres embarazadas a los grupos de control y tratamiento (3 grupos) se asignan como se ha descrito recientemente 4: 1) Alcohol (etanol) grupo de dieta líquida (ALC), 2) par-alimentados grupo control (PF), 3) Péptido grupo de tratamiento, que debe recibir una inyección intraperitoneal (ip) de péptido del ADNF-9 junto con el alcohol dieta líquida exposición (ALC/ADNF-9). Los detalles de la preparación de ALC y las dietas PF y el procedimiento de inyecciones ip se pueden encontrar en nuestra reciente trabajo 4. </li><li> Mida diario dieta líquida alcohol que se puede proporcionar el acceso libre como la única fuente de nutrientes. Dieta líquida PF yugo individualmente to una presa de ALC se puede medir todos los días también. </li><li> El volumen de la dieta de líquidos consumidos durante las 24 horas anteriores puede ser grabado desde graduada de 30 ml tubos con tapa de rosca y la dieta recién preparada debe proporcionar todos los días de E7 a E13. </li></ol> 2. La disección de fetos y Microdisección de cerebros fetales <ol><li> Sacrificar los ratones embarazadas en E13 profundamente por la eutanasia a los ratones con un procedimiento de CO 2 seguido de una dislocación cervical. </li><li> Limpie la zona abdominal de la incisión con etanol al 70%. </li><li> Hacer una incisión abdominal con tijeras y pinzas estériles. </li><li> Una vez que el abdomen está abierto, diseccionar el útero sujetándolo con una pinza y el uso de las otras pinzas para romper el mesometrio fuera del útero. Asegúrese de hacer este procedimiento lentamente para evitar la punción de los embriones. </li><li> Eliminar los embriones del útero y transferirlos a una placa de cultivo celular (60 mm x 15 mm) que contiene solución salina equilibrada de Hanks<html> (HBSS) en agua helada. </li><li> Disecar cerebros fetales de todo los embriones bajo microscopio estereoscópico para microdisección. </li><li> Con unas pinzas ultrafinas de microdisección, salga de la piel de los embriones en la parte superior de la cabeza para exponer el cráneo. </li><li> Una vez que el cráneo y se expone claramente visualizó bajo el microscopio estereoscópico microdisección, a continuación, desprenderse el cráneo a partir de la parte posterior del cerebro en la zonas del tronco cerebral y la médula espinal. </li><li> Asegúrese de quitar el pedazo del cráneo por pieza de posterior a partes anteriores de la cabeza. </li><li> Una vez que los cerebros fetales están expuestos visualmente, proceder a su extracción. </li><li> Diseccionar los cerebros fetales a partir de la base del bulbo olfatorio primordio a la base de la metencéfalo. </li><li> Postfix todo diseca cerebros fetales en paraformaldehído al 4% durante 2-3 días. También se puede congelar otros cerebros fetales de cada presa si se está probando para la transferencia de Western o ensayos enzimáticos. </li></ol>nt &quot;&gt; Nota: Los procedimientos para usos con animales fueron aprobadas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Toledo que están en conformidad con las directrices del Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de los Institutos Nacionales de Salud y la Guía para la Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 3. Incorporación de cerebros fetales en gelatina de seccionamiento <ol><li> Preparar 10% de gelatina de grado A. </li><li> Llenar un molde desprendible incrustar hasta la mitad y espere hasta solidificación de gelatina. </li><li> Lugar de control y fetal cerebros de lado a lado prenatalmente tratada en la parte superior de la gelatina solidificada. Esto es para mantener condiciones constantes de inmunodetección de muerte celular entre el control y los grupos experimentales. </li><li> Añadir la gelatina líquida en la parte superior de los cerebros fetales para hacer un molde completo (asegúrese de que la gelatina no es demasiado caliente). </li><li> Refrigerar el molde de gelatina preparada que contiene cerebros fetales durante 15 min. </li><li> Despegarel plástico molde de inclusión y luego transferir los cerebros fetales que contienen gelatina pre-hechos en paraformaldehído al 4% durante dos días. </li><li> Lugar y sección fija cerebros fetales de gelatina que usa la máquina de seccionamiento vibratome (Leica VT 1000S) a 50 m de espesor de seccionamiento coronal. Este espesor se prueba en nuestros estudios, ya que proporciona mejores características anatómicas. Además, los espesores de 25 micras y superior también se puede probar con esta técnica que implica incrustada de cerebros fetales en 10% de gelatina. Tenga en cuenta que las secciones coronal se cortaron utilizando vibratome a nivel eminencia ganglios basales del cerebro anterior </li><li> Recoger las secciones cerebrales fetales en tamponada con fosfato solución salina (PBS). </li><li> Monte las secciones del cerebro del feto en Superfrost Plus diapositivas en el agua. </li><li> Secar las secciones montadas de 15 min. </li><li> Colocar los portaobjetos (montados con las secciones cerebrales fetales) en PBS para el próximo día de pruebas de reacción TUNEL. </li></ol> 4. TUNEL reacción de Deprotección de la muerte celular o apoptosis (TUNEL: TDT mediada por dUTP nick fin de etiquetado; TDT: desoxinucleotidiltransferasa terminal). Este ensayo está dirigido para determinar la muerte celular. <ol><li> Tratar a las secciones del cerebro fetales montados en portaobjetos Superfrost Plus con proteinasa K (20 mg / ml) durante 5 min a 37 ° C (300 l de proteinasa K mixta en 20 ml de PBS). Las diapositivas se reunieron en 5 plend abierto Maile). </li><li> Enjuague secciones cerebrales fetales (montadas en diapositivas) con PBS tres veces durante 5 min bajo agitador orbital. </li><li> Incubar las secciones con 3% de H 2 O 2 en metanol durante 10 min a temperatura ambiente (3 ml de 30% de H 2 O 2 en 27 ml de metanol al 100%) (diapositivas no deben estar en un agitador). </li><li> Enjuague secciones con PBS tres veces durante 5 minutos en un agitador orbital. </li><li> Incubar las secciones en solución de permeabilización (0,1% Triton X-100 en 0,1% de citrato de sodio) durante 2 min en hielo (4 ° C) (100 l Triton X + 0,1 g de citrato de sodio + 99,9 ml destiladaagua d). </li><li> Enjuague secciones en PBS dos veces durante 5 minutos en un agitador orbital. </li><li> Seque el área alrededor de las secciones en las diapositivas. </li><li> Dibuja barrera en Superfrost Plus diapositivas utilizando PAP Pen. Esto está dirigido a evitar cualquier fuga de la solución que se utiliza para el tratamiento de las secciones para la detección de células TUNEL-positivas. </li><li> Se incuban las secciones con mezcla de reacción TUNEL (50 l de la botella 1 y 450 de la botella de 2 l) durante 1 hora a 37 ° C, el control va a ser utilizado por la incubación en solución de la botella 2. </li><li> Enjuagar con PBS tres veces 5 min bajo Orbit agitador. </li><li> Seque el área alrededor del tejido. </li><li> Incubar las secciones con el convertidor-POD durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Enjuague las secciones tres veces durante 5 min con Tris HCl (pH 7,5, 0,05 M). </li><li> Incubar las secciones 7 min en 0,05% tetrahidrocloruro 3&#39;-3&#39;-diaminobencidina (DAB) y 0,003% de H 2 O 2 (25 ml Tris HCl, pH 7,5, 0,05 M + 25 l 3% de H 2 0 2 500 + DAB l) Bajo Oribtal agitador a 4 ° C (en hielo) y en la oscuridad (asegúrese de hacer este procedimiento en la nueva 5 plend abierto mailer). </li><li> Enjuague las secciones con PBS tres veces 5 min bajo agitador orbital. </li><li> Mantenga las secciones de diapositivas en PBS durante no más de 24 horas en PBS, y luego procesarlos para la tinción de Nissl como se detalla en la siguiente sección de protocolo. </li></ol> Nota: DAB es un carcinógeno. Use guantes y limpiar todos los platos usados ​​con el cloro, una vez terminado con todos los experimentos. 5. Tinción Nissl para la preparación de las secciones del cerebro del feto para la observación microscópica <ol><li> Procedimiento de tinción de Nissl se debe hacer en una campana de seguridad biológica. </li><li> Enjuague las secciones de deslizamiento con agua desionizada durante 2 min. </li><li> Incubar las secciones en etanol al 70% durante 2 min. </li><li> Incubar las secciones en etanol al 95% durante 6 min. </li><li> Incubar las secciones en etanol al 70% durante 2 min. </li><li> Enjuague las secciones desionizada water durante 2 min. </li><li> Incubar las secciones de cresil violeta Mancha durante 3 min. </li><li> Enjuague las secciones en agua desionizada durante 2 min. </li><li> Incubar las secciones en etanol al 70% durante 2 min. </li><li> Incubar las secciones en etanol al 95% + 3 ml de ácido acético glacial durante 3 min. </li><li> Incubar las secciones en etanol al 95% durante 2 min. </li><li> Incubar las secciones en etanol al 100% durante 2 min tres veces. </li><li> Incubar las secciones en xileno durante 10 minutos tres veces. </li><li> Diapositivas que sostienen las secciones del cerebro del feto se puede montar utilizando Permount y cubierta de láminas de vidrio deslizantes. </li><li> Deja el montaje se desliza durante la noche antes de la observación y análisis microscópico. </li><li> Observación microscópica y fotomicrografías pueden realizarse bajo Leica microscopio vertical. </li></ol>

<ol>
	<li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide,+NAP,+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li><li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+peptide,+colivelin,+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mice:+signaling+pathway+investigations.">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li><li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL/6+mice:+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li><li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis,+in+part,+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li><li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL/6+mice:+a+proteomic+investigation.">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li><li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide.">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li><li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor:+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides.">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li><li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome.">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li><li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected,+in+part,+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li><li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide.">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li><li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li><li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoactive+intestinal+peptide+(VIP)+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures:+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson's+disease.">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li><li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress.">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li></ol>

No hay revelaciones que se hicieron.

La metodología y tecnología presentada en este estudio demuestran los efectos de la exposición prenatal al alcohol en los cerebros fetales y el papel de los péptidos tróficos en la prevención de estos efectos. Estos pueden proporcionar información sobre la forma de estudiar otras drogas de abuso u otros productos químicos tóxicos en el cerebro del feto durante las diferentes etapas del embarazo. En lo que respecta a la paradigma de cría, en algunos casos podría no ser observable l...

El objetivo de los métodos experimentales descritos aquí es para evaluar los efectos neuroprotectores de los péptidos tróficos en un modelo de exposición de alcoholismo fetal utilizando varias técnicas que incluyen la cría, alimentación, microdissecting, y la detección de la muerte celular. El trabajo de nuestro laboratorio ha supuesto una dieta líquida mezclada con alcohol como un modelo de consumo moderado de alcohol, que puede ser similar a un paradigma de consumo humano en términos de la cantidad de alcohol consumida 1-5. Nosotros y otros han identificado tres derivados de péptidos que son neuroprotector frente a los efectos nocivos de la exposición fetal al alcohol. Estudios de investigación de la exposición al alcohol durante las etapas embrionarias en modelos animales pueden conducir a la identificación de los posibles mecanismos de neuroprotección y permitir el desarrollo de los procedimientos de intervención. Esto puede proporcionar una información amplia sobre los efectos neuroprotectores y de atenuación de los efectos nocivos de la exposición al alcohol durante el embarazo. Posible prevención de los efectos de la exposición prenatal al alcohol puede implicar el tratamiento de ratones hembra embarazadas con péptidos que han demostrado estar involucrados en la neuroprotección in vitro e in vivo 6,7 1,2,4,8,9. Entre estos péptidos, SALLRSIPA, conocido como ADNF-9 o SAL, se deriva de la actividad dependiente de factor neurotrófico (ADNF) 7,10. Otro péptido con la secuencia de péptido NAPVSIPQ, denominado NAP, deriva de la proteína dependiente de la actividad neuroprotectora (ADNP) 6,11, demostrado un potente efecto protector contra el estrés oxidativo asociado con la exposición al alcohol 12,13. Además, recientemente hemos identificado un nuevo péptido sintetizado, colivelin que parece desempeñar un papel clave neuroprotector en el modelo de exposición fetal al alcohol 2. Colivelin se compone de ADNF-9 y AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). La importancia de la utilización de estos péptidos es que tienen la capacidad decruzar la barrera sangre-cerebro para prevenir los efectos de la apoptosis inducida por el alcohol y el déficit de crecimiento del cerebro. Los métodos experimentales utilizaron ratones C57BL / 6 para probar los efectos neuroprotectores contra la apoptosis inducida por el alcohol. Hemos adoptado una ventana en lugar de cría durante la noche de 2 horas con el fin de calcular con exactitud el día embrionario 0 (E0), ya que puede ser revelado por la detección de un tapón de esperma y una citología vaginal 1-5. Hemos utilizado una dieta líquida con tubos de alimentación, ya que se considera libre acceso en lugar de la entrega de alcohol por vía sonda, que puede inducir estrés ratonas preñadas. Por otro lado, microdisección puede ser un reto debido a la suavidad del tejido cerebral fetal, que se podría encontrar cuando la disección de los cerebros fetales en las etapas embrionarias tempranas. Aquí, mostramos las técnicas visualizados para hacer frente a todos los desafíos que implican microdisección. Además, como el seccionamiento del cerebro fetal también puede ser un reto, hemos adoptadouna técnica que consiste en incrustar el cerebro del feto en gelatina con desprendimiento incrustar moldes. Hemos tenido éxito en la reducción de los cerebros fetales en las secciones flotantes a 50 m de espesor. Esto nos permite investigar cualquier alteración del contenido de proteínas en las secciones del cerebro fetal, incluida la determinación de la muerte celular.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus Slides</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48311-703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAP PEN</td>
 <td>Research Products Int. Corp.</td>
 <td>195506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-Plend Open Mailer </td>
 <td>Heathrow Scientific, LLC</td>
 <td>HS 15983G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peel away embedding molds</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70182</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In situ cell death detection kit, POD</td>
 <td>Roche Diagnostics, Inc</td>
 <td>11684817910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14170-120 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelatin Type A</td>
 <td>FisherScientific</td>
 <td>G8-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc </td>
 <td>Leica M60, KL 200 LED</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro-Vibratome</td>
 <td>Leica, Inc </td>
 <td>Leica VT 1000S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Ultra Fine Forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11370-40</td>
 <td>2 pairs</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Graduate 30 ml feeding tubes</td>
 <td>Dyets, Inc </td>
 <td>900012 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vitamin Mix </td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8031 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral Mix</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8598 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maltose Dextrin</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>3650 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons</td>
 <td>111000190-SS05 </td>
 <td>Pharmco-AAPER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc</td>
 <td>LEICA DM 4000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

experimental methods for testing the effects of neurotrophic peptide, adnf-9, against alcohol-induced apoptosis during pregnancy in c57bl/6 mice

Diseños experimentales para la investigación de los efectos de la exposición prenatal al alcohol durante las etapas embrionarias tempranas en el desarrollo del cerebro fetal son desafiantes. Esto es debido a la dificultad de microdisección de los cerebros fetales y su corte por secciones Para la determinación de las células apoptóticas causadas por la exposición prenatal al alcohol en su mayoría. Los experimentos descritos aquí proporcionar técnicas visualizados a partir de ratones de cría para la identificación de la muerte celular en el tejido cerebral fetal. Este estudio utilizó ratones C57BL / 6 como el modelo animal para el estudio de la exposición al alcohol fetal y el papel de péptido trófico contra la apoptosis inducida por el alcohol. La cría se compone de una ventana de la estera de 2 horas para determinar el grado exacto de la edad embrionaria. Un modelo de la exposición al alcohol fetal establecido se ha utilizado en este estudio para determinar los efectos de la exposición prenatal al alcohol en el cerebro del feto. Esto implica el libre acceso a las dietas líquidas alcohol o par-alimentados como única fuente de nutrientes para los ratones embarazadas. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Las técnicas que implican la disección de los fetos y de microdisección de los cerebros fetales se describen cuidadosamente, ya que este último puede ser un reto. Microdissection requiere un microscopio estereoscópico y fórceps ultrafinas. Procedimientos paso a paso para la disección de los cerebros fetales se proporcionan visualmente. Los cerebros fetales se disecan a partir de la base del bulbo olfatorio primordio a la base de la metencéfalo. Para investigar la apoptosis, los cerebros fetales están integrados por primera vez en la gelatina con un desprendimiento del molde para facilitar su seccionamiento con un aparato vibratome. Cerebros fetales incrustados y fijados en paraformaldehído son fácilmente seccionada, y las secciones flotantes libres pueden ser montados en portaobjetos Superfrost Plus para la determinación de la apoptosis o muerte celular. TUNEL (TdT-mediada por dUTP nick fin de etiquetado; TdT: desoxinucleotidil transferasa terminal) de ensayo ha sido utilizado para identificar la muerte celular o apoptosis. Es de destacar que apoptosis y la citotoxicidad mediada por células se caracterizan por la fragmentación del ADN. Por lo tanto, las células TUNEL-positivas visualizados son indicativos de la muerte celular o apoptosis. Los diseños experimentales aquí proporcionan información sobre el uso de una dieta líquida establecido para el estudio de los efectos del alcohol y el papel de los péptidos neurotróficos durante el embarazo en los cerebros fetales. Se trata de la cría y la alimentación de los ratones embarazadas, microdissecting cerebros fetales, y la determinación de la apoptosis. En conjunto, estas técnicas visuales y de texto pueden ser una fuente para la investigación de la exposición prenatal de agentes nocivos en el cerebro del feto.

Los métodos experimentales descritos aquí muestran que una ventana de reproducción 2-hr es esencial para estimar la edad gestacional exacta. Hemos demostrado la disección de los embriones a la edad de E13. Se demostró además microdisección de cerebros fetales E13. El procedimiento implica varias etapas (ac), como se describe en la Figura 1. Cerebros fetales se disecan a partir de la base del bulbo olfatorio primordio a la base de la metencéfalo (Figura 1). Cerebros fetales se fi...

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Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Los diseños experimentales que aquí se proponen centrarse en el estudio de los efectos de la exposición al alcohol en la apoptosis y la aplicación de péptido neurotrófico durante el embarazo en el cerebro fetal. Se describe una descripción detallada de la cría a la colección de cerebros fetales. Las técnicas para la determinación de la apoptosis también se describen en detalle.

Métodos experimentales para probar los efectos del péptido neurotrófico, ADNF-9, contra la apoptosis inducida por el alcohol durante el embarazo en C57BL / 6 ratones

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

experimental-methods-for-testing-effects-neurotrophic-peptide-adnf-9

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K vistas.  University of Toledo. Los diseños experimentales que aquí se proponen centrarse en el estudio de los efectos de la exposición al alcohol en la apoptosis y la aplicación de péptido neurotrófico durante el embarazo en el cerebro fetal. Se describe una descripción detallada de la cría a la colección de cerebros fetales. Las técnicas para la determinación de la apoptosis también se describen en detalle.

Video: Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Los métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico en el SNC de los mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Investigación

Neurociencias

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotípicos Culturas del cerebelo: Retos y detección de apoptosis

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Modelos Experimentales para Estudiar la Neuroprotección del Acondicionamiento Acido Contra la Isquemia Cerebral

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the application of these techniques to identify gait deficits in a mouse model of MS, known as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Paralysis and motor deficits in mice subjected to EAE are typically assessed using a clinical scoring scale. However, this scale yields only ordinal data that provides little information about the precise nature of the motor deficits. EAE disease severity has also been assessed by rotarod performance, which provides a measure of general motor coordination. By contrast, kinematic gait analysis of the hind limb in the sagittal plane generates highly precise information about how movement is impaired. To perform this procedure, reflective markers are placed on a hind limb to detect joint movement while a mouse is walking on a treadmill. Motion analysis software is used to measure movement of the markers during walking. Kinematic gait parameters are then derived from the resultant data. We show how these gait parameters can be used to quantify impaired movements of the hip, knee, and ankle joints in EAE. These techniques may be used to better understand disease mechanisms and identify potential treatments for MS and other neurodegenerative disorders that impair mobility.

Kinematic gait analysis in the sagittal plane yields highly precise information about how movement is executed. We describe the application of these techniques to identify gait deficits for mice subjected to autoimmune-mediated demyelination. These methods may also be used to characterize gait deficits for other mouse models featuring impaired locomotion.

Análisis cinemático de la marcha de plano sagital en ratones C57BL/6 sometidos a MOG35-55 inducida por encefalomielitis Autoinmune Experimental

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Cirugía de implante coclear y eléctricamente evocada médula oblonga auditivo respuesta grabaciones en ratones C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal abrasion, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Next, position the mouse on its side on a heated plate. Gently use a cotton swab to absorb the artificial tear, and brush aside the mouse's eyelashes without making contact with the eye. Turn on the ocular burr, and carefully open the mouse's eyelid with two fingers.Simultaneously shield the vibrancy to prevent them from entangling in the burr. Locate the pupil or the eye center and gently apply the ocular burr to the eye's surface in circular motions until the epithelium is removed. Alternatively, perform about 20 circular movements on the cornea.Now apply a drop of fluorescent staining solution on the abraided eye. After 20 seconds, dab the eye with a tissue to absorb the solution. Then rinse it with a drop of artificial tear.Finally, absorb the artificial tear with a tissue, and illuminate the eye using a blue cobalt lamp. Prior to the surgery, the basal epithelium was intact and the nerve fibers in the sub basal plexus formed a vortex. The burr tip removed the outer corneal layer, leaving the stroma and endothelium intact with a visible gap at the basal epithelium and sub basal plexus.Regeneration of the epithelium occurred over a week post-surgery. However, the vortex remained absent from the corneal center.

Abrasión del nervio corneal murino para la inducción de queratitis neurotrófica

Paradigma del estrés social adolescente en ratones C57BL/6 para la investigación conductual

Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL&#47;6 Male and Female Mice

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female rodents is needed to understand its effects on ongoing brain development and behavioral outcomes. The chronic social defeat stress paradigm (CSDS) has been widely used to model social stress in adult C57BL/6 male mice by leveraging on the aggressive behavior displayed by an adult male rodent to an intruder invading its territory. An advantage of this paradigm is that it allows to categorize defeated mice into resilient and susceptible groups based on their individual differences in social behavior 24 h after the last defeat session. Implementing this model in adolescent C57BL/6 mice has been challenging because adult or adolescent mice do not typically attack early adolescent male or female mice and because adolescence is a short period of life, encompassing discreet temporal windows of vulnerability. This limitation was overcome by adapting an accelerated version of the CSDS to be used for adolescent male and female mice. This 4-day stress paradigm with 2 physical attack sessions per day uses a C57BL/6 male adult to prime the CD-1 mouse for aggressiveness such that it readily attacks the male or female adolescent mouse. This model was termed accelerated social defeat stress (AcSD) for adolescent mice. Adolescent exposure to AcSD induces social avoidance 24 h later in both males and females, but only in a subset of defeated mice. This vulnerability occurs despite the number of attacks being consistent across sessions between resilient and susceptible groups. The AcSD model is short enough to allow exposure during discrete periods within adolescence, allows the segregation of mice according to the presence or absence of social avoidance behavior, and is the first model available to study social defeat stress in adolescent C57BL/6 female mice.

Autor destacado: Comprender los efectos de la adversidad social adolescente en el neurodesarrollo en ratones

We developed an accelerated social defeat stress model for adolescent C57BL/6 mice, which works in both males and females and allows exposure during discrete adolescent periods. Exposure to this model induces social avoidance, but only in a subset of defeated male and female mice.

Modelo de Estrés de Derrota Social para Ratones Adolescentes C57BL/6 Machos y Mujeres

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female ...