This protocol follows any and all animal care and use guidelines and regulations set by IACUC at the University of Cincinnati. This work is funded by NIH/NINDS NS07722 and the Gardner Family Center for Parkinson&#8217;s Disease and Movement Disorders.

Todos los pasos del protocolo siguen el cuidado de los animales y el uso de las directrices y normas establecidas por el IACUC de la Universidad de Cincinnati. 1. Consideraciones generales <ol><li> Si es posible, pruebe los ratones durante su fase activa en el ciclo de oscuridad. Por lo general, realizar pruebas con poca luz y por lo menos 1 hora en la oscuridad ciclo. Sin embargo, si las pruebas en el ciclo de oscuridad no es posible, realice las tres pruebas durante el ciclo de luz. Tenga en cuenta que los tiempos sniffing puede disminuir cuando los ratones se ponen a prueba durante su ciclo de sueño. NOTA: Si bien las pruebas se pueden realizar durante el ciclo de sueño de los ratones pueden mostrar menos interés en el sedimento enterrado, bloques, o cartucho perfumado. </li><li> Con el fin de reducir cualquier efecto de fuera de señales olfativas, llevar un par de bases de guantes en todo momento a lo largo de cada prueba y luego colocar un par de guantes limpios en el par de bases para cada ratón y cada ensayo. Como norma general, en caso de duda, se puso un conjunto de guantes limpios. Tiene una caja de guantes de leerily disponible ya que serán cambiados con frecuencia. NOTA: Nosotros usamos guantes de nitrilo para toda manipulación de animales. </li><li> Limpieza de los materiales de prueba y las jaulas entre los sujetos con un desinfectante / esterilizante es también un paso importante en esta serie de pruebas con el fin de reducir las posibilidades de propagación de enfermedades, así como eliminar las señales olfativas deseadas. </li></ol> 2. Buried Prueba Pellet <ol><li> Al menos dos días antes de la prueba, se registra el peso de cada ratón y luego alimentos restringir a 90% del peso corporal. Antes de la prueba y durante la restricción de alimentos, dar a cada ratón 1-2 piezas de los pellets que se utilizarán durante la prueba (por ejemplo, un pedazo de cereal azucarado). No se salte este paso porque los ratones son neofóbicos con los alimentos y pueden no buscar la pastilla durante la prueba, si no han comido los gránulos previamente. </li><li> En todos los días de prueba, habituar a los ratones durante 1 hora antes de la prueba mediante la colocación de su jaula en la sala de pruebas sin botella de agua o en el alimentador ben. ellos casa en su jaula con sólo una tapa superior del filtro. </li><li> Durante la habituación, llenar un ratón jaula limpia ~ 3 cm de alto con ropa de cama limpia asegurándose de la ropa de cama se distribuye uniformemente a través de la jaula. Establecer un temporizador durante 5 min. </li><li> Después de 1 hr de la habituación, enterrar 1 endulzadas de pellets de cereales 0,5 cm por debajo de la ropa de cama de manera que no es visible. </li><li> Retire el ratón de prueba de su jaula hogar, lugar en el centro de la jaula de ensayo, colocar la tapa superior del filtro en la jaula y iniciar el temporizador. </li><li> Detener el temporizador cuando el ratón descubre el pellet y comienza comerlo. Tenga en cuenta el tiempo para descubrir el sedimento enterrado. </li><li> Si el ratón no encuentra el sedimento en 5 minutos, poner fin al juicio y tenga en cuenta una puntuación de 300 segundos para que el ratón. Mueva el pellet a la parte superior de la ropa de cama por lo que el ratón tiene acceso a ella, y permitir que el ratón para comer la pastilla. </li><li> Tras el juicio, devuelva el ratón a su jaula. </li><li> Vacíe la ropa de cama de la jaula de prueba y limpiar el cedad con una solución de limpieza de habitaciones animal. </li><li> Repita los pasos 2.4 a 2.9 para cada ratón, y cambiar los guantes antes y después de cada ratón. </li><li> Después de todos los ratones se ponen a prueba, les dan suficiente comida para mantenerlos a 90% del peso corporal. </li><li> Realizar pruebas en los días 2-5 del mismo modo que los días de prueba 1 con una excepción; enterrar el precipitado en un lugar diferente en la jaula para cada ensayo. </li><li> El día de la prueba 6, realice el juicio pellet superficie. </li><li> Para el ensayo de pellets superficie, siga el mismo procedimiento que para el día de la prueba 1, pero en lugar de enterrar el sedimento en el lugar de cama en la parte superior de la ropa de cama. Registre el tiempo para el ratón para encontrar y empezar a comer la pastilla. </li></ol> 3. Bloque de prueba <ol><li> Individualmente albergar ratones en jaulas limpias y colocar 5 bloques en la jaula (etiquetado AE), el cambio de los guantes antes de la creación de cada jaula. </li><li> Realice la prueba 24 horas más tarde. Mueva los ratones de prueba a la zona de la prueba, retire la bandeja de botella de agua y de alimentación, y coloque all 5 cuadras de la jaula, junto con un puñado de ropa de cama en una bolsa de plástico etiquetada con la identificación del animal. Coloque la bolsa de plástico sellada en la parte superior de la jaula de la casa del ratón. </li><li> Habituar a los animales en sus jaulas sin la botella de agua, bin alimentador, y los bloques durante 1 hora antes de la prueba. </li><li> Cámbiese los guantes entre cada jaula para que los olores no se intercambian entre los animales / bloques. </li><li> Alinear las jaulas de ratón al lado de otra, sobre una mesa con un mínimo de 10 cm entre cada jaula. Colocar una cámara de vídeo de manera que la parte delantera de la jaula (no el lado largo de la jaula) es a la vista. </li><li> Ajuste el temporizador de 30 segundos y la etiqueta de una tarjeta con los detalles importantes del experimento (fecha, ID del ratón, el juicio, etc). Videotape la etiqueta para 2-3 seg. </li><li> Retire los bloques de AD de la bolsa de plástico con la identificación de ese ratón y colocarlos en el centro de la jaula de manera que sean claramente visibles en la cámara de vídeo. Asegúrese de que hay ~ 1 cm of espacio entre cada uno de los bloques. Coloque la parte superior del filtro nuevo en la jaula. Inicie el temporizador y cintas de vídeo durante 30 segundos. </li><li> Después de 30 segundos, detenga la grabación y quitar los bloques de la jaula y colocarlos de nuevo en la bolsa de plástico. </li><li> Cambie los guantes y luego pasar a la siguiente ratón, repitiendo el mismo procedimiento utilizado para la primera prueba. Haga esto por un total de 6 pruebas para cada ratón asegurándose de que hay un intervalo entre ensayos de ~ 5 min. </li><li> En la prueba de 7 º, siga el mismo procedimiento para los ensayos 1-6 excepto que en lugar de colocar el bloque D de la propia jaula del ratón añadir bloque E de la jaula de otro ratón de manera que el ratón está expuesto a los bloques A, B, y C de su propia jaula de alojamiento y el bloque E de la jaula de otro ratón. Nota en el libro de laboratorio cuyos E bloque cada ratón está expuesto y alternativa en la que el bloque E se coloca en la jaula de cada ratón (por ejemplo, ABCE o AEBC). Tome bloque E de un ratón del mismo sexo, pero no de un cagemate originales. Videotape durante 30 segundos. </li><li> Después de los 7 ensayos, devuelva los animales a una nueva jaula limpia con sus compañeros de jaula originales. Bloques Limpie utilizados en el ensayo con un detergente suave y agua y dejar secar al aire para su uso en pruebas posteriores. </li></ol> 4. habituación / Deshabituación <ol><li> Realizar la prueba de habituación / deshabituación de una manera similar a la prueba de bloque, pero en lugar de utilizar bloques que tienen el olor de un ratón, utilice cartuchos de tejido de algodón que sostienen perfumado con diferentes pares de extractos. </li><li> Siga los pasos 3.1 a 3.4 utilizando un único cartucho, tejido sin perfume en lugar de los bloques. </li><li> Habituar a los ratones en la sala de ensayo. </li><li> Prepare los cartuchos de tejidos perfumados en una habitación separada. Coloque una pequeña bola de algodón en un cartucho limpio y luego añadir 5 l de extracto (por ejemplo, extracto de almendra) en el algodón. Encaje la parte superior del cartucho sobre el algodón y colóquelo en un cuadro dedicado o bolsa etiquetada con ese olor. </li><li> Realice el mismo procedimiento fo una segunda aroma (por ejemplo, extracto de anís). Cambiar los guantes entre el manejo de diferentes aromas. Asegúrese de que la bola de algodón está completamente encerrado en el cartucho de tejido. NOTA: Expuesto fibras de la bola de algodón pueden causar que el animal tiene interés en la bola de algodón para fines de anidación en lugar de la propia esencia. </li><li> A continuación, siga los pasos 3.6 a 3.10 utilizando un cartucho de papel fragrante durante los primeros seis ensayos, y el segundo cartucho tejido perfumada para el séptimo juicio. </li></ol> 5. Análisis de cintas de vídeo <ol><li> Para el bloque y las pruebas de habituación / deshabituación, tiene una persiana rater a condición experimental medir el tiempo olfateando cada bloque, con sniffing definido como contacto nasal con ese bloque. Si se desea, medir otros comportamientos tales como el tiempo para acercarse a la novela bloque (E) durante la prueba de 7 y la actividad total (el número de movimientos realizados a lo largo de la longitud y la anchura de la jaula de alojamiento) durante cada ensayo. Puntuar el tiempo dedicado olfateando unatiempo d acercarse desde la cinta de vídeo utilizando un cronómetro. </li><li> De manera similar, para la prueba de habituación / deshabituación, tienen un evaluador ciego a condición experimental medir el tiempo empleado olfateando el cartucho, tiempo para acercarse al cartucho, y la actividad locomotora. </li></ol> 6. Estadísticas <ol><li> Analizar la prueba pellet enterrados utilizando estadística no paramétrica porque la latencia para encontrar el pellet puntuaciones tienden a mostrar la heterogeneidad de la varianza. Promediar la latencia para localizar el sedimento a través de los días 3-5 y luego comparar entre grupos de ratones usando una prueba U de Mann-Whitney. Del mismo modo, para la parte de pellets superficie de la prueba, analizar la latencia para encontrar el sedimento usando una prueba U de Mann-Whitney para comparar los genotipos. </li><li> Para la prueba de bloque, analizar los datos de prueba de 7 (introducción del bloque de novela con aroma). Típicamente, emplear análisis no paramétricos para tener en cuenta la heterogeneidad de la varianza. Con el fin de analizar las diferencias en el tiempo dedicado olfateando ªbloque novela electrónico, así como el tiempo para acercarse a los bloques para los diferentes grupos experimentales, utilice la prueba U de Mann-Whitney. Utilice la prueba de Rango Firmado Wilcoxon para comparar el tiempo dedicado olfateando la novela bloque de tiempo dedicado a oler los bloques familiares. </li><li> Para la prueba de habituación / deshabituación, conducta paramétrico análisis sobre ensayos 1, 6 y 7, similar a estudios previos 20. Si ratones muestran poco o ningún sniffing, utilice los análisis no paramétricos. </li></ol>

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We have no conflicts of interest.

Cada una de las pruebas que se describen en este estudio miden diferentes aspectos de la función olfativa en ratones. La prueba de pellets enterrado mide la motivación aspecto de alimentos del olfato, poniendo a prueba la capacidad de hambre (alimentos restringido, no privados de alimentos) ratones para detectar una pieza aceptable de cereal endulzada enterrado bajo la ropa de cama. La prueba mide el bloque más del aspecto social de la función olfativa, probando la capacidad de los ratones para discriminar entre su propio olor y la de una misma especie. La prueba de habituación / deshabituación evalúa la capacidad del ratón para discriminar entre olores inocuos conocidos y novedosos,. El uso de múltiples pruebas es importante la hora de caracterizar un nuevo modelo, ya que las anomalías en la motivación de alimentos o el miedo pueden contribuir a las diferencias observadas en los ratones mutantes en comparación con los controles. Por ejemplo, si sólo se realiza la prueba de bloque y la disminución de la inhalación del bloque que se ha observado es el olor de otro ratón, no está claro si hay una Olfactdéficit de memoria o una mejor respuesta de miedo a la misma especie que puede conducir a la evitación de ese bloque. Cuando se realizan varias pruebas y los déficits se observan en todas las pruebas, que apoya firmemente una interpretación de deterioro olfativo. Sin embargo, si se observan diferencias en una sola prueba, pero no los otros, entonces puede haber un deterioro olfativo más sutil pero será esencial para descartar otras explicaciones (por ejemplo, el miedo mayor o menor motivación de los alimentos). Factores importantes adicionales a tener en cuenta al probar ratones funciones olfativas incluyen la cepa de fondo y el sexo de los ratones. Diferentes cepas fondo genético (es decir, C57BL / 6, DBA, etc) pueden tener profundos efectos en el comportamiento del ratón, por lo tanto, se recomienda adaptar cada protocolo en ratones de tipo salvaje de la misma fondo antes de realizar todo el experimento. También se recomienda que los ratones macho y hembra comprobarse por separado el uno del otro porque el sistema olfativo masculino es altomente sensible a las hembras en la detección de celos y olfativa de una hembra en estro podría interferir con el rendimiento en las tres pruebas. Algunos pasos son absolutamente críticos para seguir al probar el olfato en ratones. Es importante ser consciente de los olores el experimentador está introduciendo a los animales. El uso de guantes para los procedimientos es se requiere cambio esencial y frecuente de guantes entre los animales. Siempre es una buena práctica que el experimentador no usar colonia o perfume en días de exámenes olfato. Mientras que algunas partes del procedimiento son inflexibles, hay otras partes que pueden ser modificados y adaptados sin reducir la validez o la sensibilidad de la prueba. Por ejemplo, el número de ensayos de habituación puede aumentarse o disminuirse dependiendo de la cepa de ratones se está probando y la rapidez con que se habitúan a los estímulos. La principal limitación de estas pruebas es que todos ellos están impulsados ​​por una cierta forma de motivación, ya sea comida o social, por lo quedifícil descartar por completo las anomalías en la motivación como una explicación cuando una alteración de la respuesta observada. Esto puede ser minimizado mediante el análisis de parámetros adicionales, tales como la actividad durante las pruebas y el tiempo de acercarse a los estímulos. Una vez dominado, las pruebas se pueden utilizar fácilmente al examinar el fenotipo de modelos novedosos ratón de la enfermedad neurodegenerativa. Además, las pruebas que tienen la mayor potencia pueden ser incluidos en los estudios preclínicos de prueba posibles terapias (para un ejemplo véase la ref. 25).

Disfunción olfativa está vinculada a una serie de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson (PD), enfermedad de Alzheimer, y enfermedad de Huntington 1. En la EP, alteraciones olfatorias incluyen déficits en la identificación del olor, la detección y la discriminación y se encuentran hasta en el 70-95% de los pacientes 2-5. Estos déficits pueden preceder a los síntomas motores de la EP por el cardenal de hasta 4 años, lo que indica que la disfunción olfativa puede ser señal de las primeras etapas de la DP 6-10. La aparición temprana de los déficits olfativos en la EP ha generado un gran interés en la disfunción olfativa y los mecanismos subyacentes implicados. En estudios preclínicos en roedores, disfunción olfativa podría ser una medida de resultado sensible para predecir el potencial terapéutico de nuevas estrategias terapéuticas. Muchas pruebas han sido diseñados y ampliamente utilizado para caracterizar alteraciones sensoriomotoras en modelos de roedores de PD y de TESt el potencial terapéutico de los tratamientos novedosos 11-15. A pesar de que los déficits olfativos están bien documentados en la EP, la función olfativa no se ha medido rutinariamente en muchos modelos. Esta visión está cambiando, aunque con el descubrimiento de formas genéticas de la EP y la noción más aceptada que la EP es una enfermedad sistémica que afecta a algo más que la función sensoriomotora. Actualmente, hay numerosos estudios en modelos genéticos de ratón de la EP y otros trastornos neurodegenerativos que ahora incluyen análisis de olfato en la caracterización 16-24. Dado el creciente interés de la disfunción olfatoria en los trastornos neurodegenerativos, hemos tratado de reunir una serie de pruebas olfativas que pueden ser utilizados para caracterizar nuevos modelos de neurodegeneración, así como las pruebas posibles terapias modificadoras de la enfermedad en los estudios preclínicos. Los ensayos descritos en el presente estudio se han utilizado tanto en la caracterización y estudios preclínicos 18,25. Las pruebas highlighted en este estudio se ha demostrado que ser sensible en la detección de la disfunción olfativa en una utilizado con frecuencia alfa-sinucleína modelo de ratón que sobreexpresa de la enfermedad de Parkinson 18. Ellos incluyen la prueba enterrado pellet 26,27, una versión adaptada de la prueba de bloque de 23,24,28,29, y la prueba de habituación / deshabituación 30. Es importante tener en cuenta que hay varias adaptaciones de las pruebas descritas en este estudio que son medidas sensibles de la función olfativa en ratones, los que se destacan en este estudio son las pruebas de nuestro laboratorio tiene la mayor experiencia con y utilizar de forma rutinaria.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Cap&#39;n Crunch</td>
			<td style="width:88px;">Quaker Oats</td>
			<td align="right" style="width:88px;">3E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Wooden Blocks</td>
			<td style="width:88px;">Lara&#8217;s Crafts</td>
			<td align="right" style="width:88px;">10144</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="379" rowspan="6" style="height:379px;width:88px;">Flavor Extracts</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;">Kroger</td>
			<td style="width:88px;">Almond: 011110664716</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Anise: 011110615619</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Banana: 011110669919</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Coconut: 011110669889</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Lemon: 011110669957</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:88px;">Orange: 0011110669964</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="59" rowspan="2" style="height:59px;width:88px;">Tissue Cartridges</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Z672122-500EA</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Manufactured by Simport no: M490-2</td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Cotton Balls</td>
			<td style="width:88px;">Kroger</td>
			<td align="right" style="width:88px;">1.1111E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Mouse Cages</td>
			<td style="width:88px;">Ancare</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">19 x 29 x 12.7 cm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Camcorder</td>
			<td style="width:88px;">Sony</td>
			<td style="width:88px;">&#160;HDR-HC9</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">MiniDV Tapes</td>
			<td style="width:88px;">Sony DVC premium</td>
			<td align="right" style="width:88px;">2.7243E+10</td>
			<td style="width:88px;">60 minute long play&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Los pellets, bloques, y las pruebas de habituación / deshabituación enterrados son evaluaciones altamente ventajosas del olfato en ratones. El uso de estas pruebas, hemos encontrado cambios significativos en el olfato en varios modelos de ratón genético de la enfermedad de Parkinson, incluyendo sobreexpresión de alfa-sinucleína (Thy1-Asyn) 18 y ratones knockout ATP13A2. Ambos ratones knockout Thy1-Asyn y ATP13A2 tardan más en encontrar el pellet enterrados que los controles 18. Figuras 1-3 muestran los datos recogidos de los ratones de tipo salvaje y ATP13A2 knockout. En la prueba de sedimento enterrado, ratones knockout muestran un aumento ATP13A2 latencia para encontrar el sedimento enterrado en comparación con los ratones de control de tipo salvaje (Figura 1). En la prueba de bloque, tanto de tipo salvaje y ratones knockout ATP13A2 olfatean la novela cuadra de la jaula de otro ratón en comparación con manzanas de su propia jaula (Figura 2). En los ratones de tipo salvaje prueba habituación / deshabituación mostrar habituación a un olor y<html> luego aumentó oler cuando una novela olor se introduce (Figura 3). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Buried pellet de prueba. Latencia para encontrar el pellet en de tipo salvaje (n = 10) y ATP13A2 KO (n = 14) a 20-27 m de edad. * P &lt;0,05, Mann-Whitney U. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. prueba Tiempo entre calzos olfateando la novela bloque (E) en la prueba de bloque de tipo salvaje (n = 10) y ATP13A2 KO (n = 12) en ratones hembra a 20 -. 27m de edad. ΔΔ representa p &lt;0,01 en comparación con los bloques A, B, y C de la misma genotipo. Mann-Whitney U. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51804 / 51804fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. prueba de habituación / deshabituación. Tiempo olfateando un cartucho perfumado en ratones de tipo salvaje media (9 m edad, n = 7) a través de 6 pruebas y la introducción de un cartucho con una novela olor a juicio 7.

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Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Los ensayos olfativos para modelos de ratón de Enfermedades Neurodegenerativas

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

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21.9K vistas.  University of Cincinnati. Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Video: Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature infants and the most common antecedent of cerebral palsy. PVL is characterized by periventricular white matter damage with prominent oligodendroglial injury. Hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation are the primary causes of PVL. We use P6 mice to create models of neonatal brain injury by the induction of hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation with unilateral carotid ligation followed by exposure to hypoxia with or without injection of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemistry of myelin basic protein (MBP) or O1 and electron microscopic examination show prominent myelin loss in cerebral white matter with additional damage to the hippocampus and thalamus. Establishment of mouse models of PVL will greatly facilitate the study of disease pathogenesis using available transgenic mouse strains, conduction of drug trials in a relatively high throughput manner to identify candidate therapeutic agents, and testing of stem cell transplantation using immunodeficiency mouse strains.

We established mouse models of periventricular leukomalacia (PVL), the predominant brain injury in premature infants characterized by periventricular white matter lesions. Hypoxia/ischemia with/without systemic infection are the primary causes of PVL. Unilateral carotid ligation and hypoxia exposure with/without lipopolysaccharide injection creates PVL-like lesions in P6 mice.

Los modelos de ratón de la Retinopatía

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

Investigación

Neurociencias

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

La detección de la hipoxia Microrregional en corteza cerebral de ratón por la imagen de dos fotones de fluorescencia endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Un ratón, dos culturas: Aislamiento y cultivo de adultos Neural las células madre de las dos zonas neurogénicos de ratones individuales

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunocoloración Cuádruple del Bulbo Olfativo para la Visualización de Códigos de Identidad Molecular del Axón Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Evaluación de la permeabilidad de la barrera hemato - encefálica por infusión intravenosa de albúmina marcado con FITC en un modelo murino de enfermedad neurodegenerativa

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Los ensayos olfativos para modelos de ratón de Enfermedades Neurodegenerativas

Resumen

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Evaluación de la permeabilidad de la barrera hemato - encefálica por infusión intravenosa de albúmina marcado con FITC en un modelo murino de enfermedad neurodegenerativa

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila