Con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01EY018144.

1. Producción, replegamiento y purificación por HPLC de holo-RBP <ol><li> Transformar BL-21cells con el vector pET3a que alberga el cDNA humano para RBP con 6x His en el extremo N-terminal. Cultivar las transformadas BL-21 células en un agitador a 37 ° C en 40 ml de medio LB con carbenicilina hasta que la DO a 600 nm alcanza 0,5. Inducir la expresión de proteínas RBP mediante la adición de IPTG a 1 mM. Crecer las bacterias a 37 ° C otra 5 hr. </li><li> RBP producida en E. coli es en su mayoría presentes en cuerpos de inclusión insolubles. Para enriquecer los cuerpos de inclusión, las células de pellets a 10.000 xg durante 20 min. Entonces sonicar las células en hielo en 5 ml de PBS con inhibidores de la proteasa, seguido por 2 ciclos de congelación y descongelación. Pellet abajo los cuerpos de inclusión a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Remover el sobrenadante y el sedimento mantener en hielo. </li><li> Solubilizar el cuerpo de inclusión mediante sonicación pellet en 10 ml de clorhidrato de guanidina 7,5 M. Añadir un volumen medio (5 ml) de tampón Tris 25 mM, pH 9,0 y DTT a un final concentration de 10 mM. Mezclar vigorosamente la solución en un vórtex durante la noche a temperatura ambiente para reducir completamente y desnaturalizar las proteínas. </li><li> Centrifugar la solución de proteína para eliminar el material insoluble a 18.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y se coloca el tubo en hielo. </li><li> Preparar cuatro volúmenes (60 ml) de tampón de replegamiento (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM de cistina, cisteína 3,0 mM, 1 mM EDTA). Desgasificar el tampón de replegamiento. También hay que preparar 600 l 10 mM en etanol retinol bajo luz roja tenue. Mantenerlo en la oscuridad sobre hielo. Tanto el tampón de replegamiento y solución de retinol que estar recién preparada. </li><li> Enfriar tanto la solución de proteína y el tampón de replegamiento en hielo durante al menos 30 min. Una temperatura más alta probablemente reduce la calidad de las prácticas comerciales restrictivas replegado. Añadir 1 ml de replegamiento gota a gota solución tampón y 10 l retinol a su vez, mientras que la solución de proteína se mezcla vigorosamente en un vaso de precipitados sobre hielo. Repita este paso hasta que el tampón de replegamiento y retinolse añaden. Mantener la agitación de la reacción en hielo en la oscuridad durante 5 hr. </li><li> Decantar la reacción de replegamiento a 24.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Es esencial para eliminar los agregados después de la reacción de replegamiento. </li><li> Se concentra la solución sobrenadante utilizando concentrador Amicon Ultra 15 (MWCO 10 K) a aproximadamente 10 ml. No concentrar la solución replegó más de este nivel. Concentrarse demasiado dará lugar a la agregación de proteínas y baja el rendimiento final y calidad de RBP correctamente plegada. Diluir la muestra concentrada con PBS frío a 100 ml. El propósito de este paso consiste en eliminar los componentes de la reacción de replegamiento que interfieren con la purificación de níquel. </li><li> Haga girar la solución una vez más a 24.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Es importante para eliminar cualquier precipitado. Transferir el sobrenadante a dos tubos de 50 ml, conteniendo cada uno 1 ml de Ni-NTA de lodos que se ha lavado con PBS. Girar los tubos a 4 º C durante una hora. Incubando f solución diluidao 1 hr puede causar la precipitación de proteínas mal plegadas que necesitan ser removidos. </li><li> Decantar los tubos a 500 xg durante 3 min. Retire con cuidado el sobrenadante. Flotante nada debe ser eliminado. Añadir PBS frío a 30 ml para cada tubo. Girar de nuevo y eliminar el sobrenadante. Repita este proceso hasta que vea nada más que cuentas en el tubo. </li><li> Transferir la resina Ni-NTA a una columna vacía. Lavar la resina con 20 volúmenes de columna de imidazol 10 mM, NaCl 500 mM en PBS. Eluir Su-RBP en 5 volúmenes de columna de 100 mM de imidazol en PBS. No almacenar esta solución durante un período prolongado de tiempo, y la congelación reduce el rendimiento final y calidad. Para un mejor resultado, purificar RBP por HPLC inmediatamente. </li><li> Dializar Su-RBP purificada a partir de la resina Ni-NTA contra 25 mM Tris, pH 8,4, y NaCl 120 mM. Un concentrador también puede ser utilizado para el intercambio de tampón. Muestras claras para HPLC por centrifugación a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C justo antes de cada ejecución. </li><li> Purificar holo-RBP en HPLC utilizando un ioncolumna de intercambio AX-300 por un gradiente escalonado de NaCl (220 mM 12 min, 360 min 15 mM, y mM 1.000 15 min) usando 25 mM Tris, pH 8,4 como fase móvil a 1 ml / min. A medida que aumenta la concentración de NaCl, holo-His-RBP se libera mientras que apo-RBP y mal plegadas RBP permanecer atado a la columna (Figura 1). Si replegamiento RBP no se realiza de manera óptima, misfolded RBP (por ejemplo, mal plegadas RBP-I en la Figura 1) puede predominar la preparación entera. </li><li> Recuperar el plegado correctamente holo-RBP de las fracciones del pico a 360 mM NaCl. Es importante vigilar cuidadosamente el perfil de elución de plegado correctamente y mal plegado Su-RBP. A partir de 1.000 mM NaCl, la mayor parte de su mal plegadas-RBP deben ser liberados. </li><li> Las fracciones que contienen holo-RBP se reunieron, se concentraron, y se dializó frente a PBS durante la noche a 4 ° C. Comprobar el rendimiento final y calidad (330 nm/280 nm) con un espectrofotómetro. Producto correctamente plegado debe tener una relación de 330 nm/280 nm de ligeramente superior a 1 (Figura 1). </li><li> Para la produccióne apo-RBP, añadir un volumen igual de heptano purificado para la holo-RBP y mezclar suavemente por rotación durante la noche a 4 ° C. Centrifugar a 16.000 g durante 10 min a 4 ° C y transferir cuidadosamente la fase acuosa inferior a un nuevo tubo (evitando el precipitado en la interfase). Repetir el proceso tres veces con una incubación de 3 horas para cada una. Ver absorción en un espectrofotómetro Nanodrop para asegurarse de que el pico de 330 nm se ha reducido al nivel de fondo. </li></ol> 2. Monitoreo en tiempo real de STRA6 catalizada Release Retinol Retinol y Carga <ol><li> Bloquear un negro de 96 pocillos Microfluor-2 placa (Thermo Scientific) con 200 l de bloqueador de caseína (Pierce) durante la noche a 4 ° C para evitar la adherencia no específica de holo-RBP al plástico. Bloqueador de caseína da el mejor efecto de bloqueo de las todas las soluciones de bloqueo que probamos. </li><li> Las membranas recién preparadas a partir de células que expresan STRA6 o células de control se lavan con PBS y se pasa a través de una jeringa Hamilton (GastiGHT # 1710) 6 veces para producir una suspensión uniforme en PBS. Nos suelen utilizar membranas derivadas de 1/100 a 1/20 de las células cultivadas en una placa de 100 mm por reacción. </li><li> Lavar los pocillos recubiertos de la placa Microfluor-2 una vez con 200 l de PBS. Se enfría la placa en hielo antes de la adición de suspensión de membrana (50 l por pocillo). </li><li> Seguimiento en tiempo real de retinol fluorescencia se mide utilizando la óptica de fluorescencia de la Omega Polarstar (BMG Labtech) con el filtro de excitación 320ex y el filtro de emisión 460-10. El programa se establece en el modo de lectura Punto final. El modo de placa también se puede utilizar para medir la evolución temporal de si los intervalos de tiempo no son variadas. La señal de cada punto de tiempo es la media de 10 mediciones (promedio orbital con un diámetro de 2 mm) y la ganancia se fija en 1.800. La placa se agita durante 10 segundos a 500 rpm usando doble agitación orbital antes de cada medición. </li><li> Para iniciar el ensayo de liberación de retinol, los pocillos se leen una vez con el extremo de la lectura moda antes de holo-RBP (típicamente 1 mM concentración final) se añade a 0 min. Tan pronto como holo-RBP se añade, la reacción se controla continuamente cada 5-10 minutos durante 1-3 hr. Para iniciar el ensayo de carga de retinol, retinol todo trans (típicamente de 1 mM de concentración final) se añadieron a los pocillos bajo luz roja tenue. La placa se lee una vez antes de apo-RBP se añade a 0 min. Tan pronto como apo-RBP se añade, la reacción se controla continuamente cada 5-10 minutos durante 1-3 hr. </li><li> Después de que todas las mediciones se realizan, descarga los datos en bruto (ejemplo mostrado en la Figura 2) desde el software de análisis de datos Omega (BMG Labtech) a Microsoft Excel para el análisis de datos. Cada punto de tiempo genera un archivo que contiene las lecturas de todas las condiciones experimentales. Por ejemplo, si hay 20 puntos de tiempo, 20 consolidar archivos en un único archivo de Excel para el análisis de datos. </li><li> Para el análisis de datos, las señales de fluorescencia antes de la adición de retinol o holo-RBP a 0 min se consideran señales de fondo unad resta de las señales de fluorescencia final en todos los puntos temporales. Aunque las señales de fondo son bajas comparadas con retinol fluorescencia en holo-RBP, restando el fondo elimina la influencia específica de dispersión de luz por las membranas y permite concentrarse en la fluorescencia de holo-retinol o retinol RBP a 0 min. </li></ol> 3. Monitoreo en tiempo real de STRA6 catalizada Transporte de Retinol De holo-RBP a CRBP-I <ol><li> Retinol-EGFP es una nueva transferencia de resonancia de fluorescencia (FRET) par que se ha creado recientemente 41. STRA6 catalizada por transporte de retinol holo-RBP para EGFP-CRBP-I se supervisa en tiempo real mediante la medición de retinol-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I proteína de fusión con etiqueta 6XHis (EGFP-CRBP-I) se produce en células de mamífero y se purificó en resina Ni-NTA antes del experimento. EGFP-CRBP-I se pueden almacenar en PBS con inhibidores de la proteasa durante un período corto de tiempo a 4 ° C. Alternativamente, la proteína de fusión is congelado a -80 º C en alícuotas pequeñas. </li><li> Antes de las reacciones, preparar un comandos Microfluor-2 y la placa de membranas como se describe anteriormente. Lavar los pocillos recubiertos de la placa Microfluor-2 una vez con 200 l de PBS antes de la adición de suspensión de membrana (50 l por pocillo). </li><li> En tiempo real retinol-EGFP FRET se mide usando Polarstar Omega con el filtro de excitación 320ex y los filtros de emisión 460-10 y 510-10 utilizando simultáneas duelo de emisión óptica de fluorescencia. El programa se establece en el modo de lectura Punto final. El modo de placa también se puede utilizar para medir la evolución temporal de si los intervalos de tiempo no son variadas. La señal de cada punto de tiempo es la media de 10 mediciones (promedio orbital con un diámetro de 2 mm) y la ganancia se fija en 1.800 por canal. La placa se agita durante 10 segundos a 500 rpm usando doble agitación orbital antes de cada medición. </li><li> Para iniciar las reacciones, EGFP-CRBP-I (típicamente 1 mM concentración final) se añadieron a los pocillos. La placa se lee ence usando el modo de lectura de punto final antes de holo-RBP se añade a 0 min. Tan pronto como holo-RBP se añade, la reacción se monitorizó continuamente mediante medición cada 5-10 minutos durante 1-2 hr. </li><li> Después de que todas las mediciones se realizan, descarga los datos en bruto (ejemplo mostrado en la Figura 3) desde el software de análisis Omega datos a Microsoft Excel para el análisis de datos como se describe anteriormente. </li><li> Retinol-EGFP FRET se calcula por la dinámica de cambio en la relación de los picos de emisión del aceptor / donante 47. La ecuación 41 para calcular esta razón es [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], donde t 510, 510 b, t 460, 460 y b representan las emisiones a 510 nm después de la iniciación de la reacción ( t = tiempo de punto), a 510 nm antes de retinol o holo-RBP se añade (b = fondo), a 460 nm después de la iniciación de la reacción (t = punto de tiempo), y en 460 nm antes de retinol o holo-RBP se añadió (b = fondo), respectivamente. </li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Compartimos aquí un protocolo RBP producción optimizada por prácticas comerciales restrictivas procedimientos de producción y purificación son fundamentales para la generación de prácticas comerciales restrictivas correctamente plegada. Dada la posibilidad de que especies RBP mal plegadas y la presencia de cantidades traza de proteínas bacterianas incluso en HPLC purificada producidas por bacterias RBP, es útil usar RBP nativo a partir de suero para confirmar una conclusión relacionada con RBP. RBP orina, que ...

La vitamina A es una molécula orgánica que es esencial para la supervivencia y el buen funcionamiento de casi todos los órganos humanos. Derivados de vitamina A (retinoides) participar en diversos eventos bioquímicos y celulares, incluyendo la detección de luz de 1,2 visión y la regulación de la expresión génica y la traducción de la proteína durante el desarrollo embrionario y en los tejidos adultos 3-6. Aunque retinol tiene la capacidad de difusión en forma sistémica, evolución subió con plasma proteína de unión a retinol, una proteína portadora específica para la vitamina A de transporte en la sangre para lograr una alta eficiencia y especificidad, y para evitar la toxicidad asociada con la difusión 7-10 aleatorio. Un receptor de alta afinidad que se une a la RBP y toma de vitamina A se planteó la hipótesis en la década de 1970 11-13. A pesar de la evidencia acumulada en tres décadas en la existencia del receptor RBP 14-31, la hipótesis del receptor fue objeto de debate durante muchos años debido a la existence de una definición incorrecta de holo-RBP. La definición correcta de holo-RBP es que es el complejo 1:1 de alta afinidad entre el retinol y RBP. Extracción repetida de holo-RBP por disolvente orgánico es necesario para producir apo-RBP. Esta definición es utilizada por casi todos los laboratorios que estudian las prácticas comerciales restrictivas 7,9,32-35 o el receptor de RBP 14-31,36-42. La definición incorrecta de holo-RBP que se usó para refutar la existencia del receptor RBP es la mezcla aguda de retinol libre con apo-RBP. Dado que la función del receptor de la vitamina A RBP en la captación de holo-RBP es liberar retinol de holo-RBP, el receptor de RBP jugaría ningún papel en la absorción de retinol si retinol es libre de empezar (como propone la definición incorrecta de holo -RBP). La reciente identificación de receptor RBP como una proteína de dominio multitransmembrane llamado STRA636 y su función en la absorción de vitamina A a partir de holo-RBP 36-43 fuertemente argumenta en contra de la hipótesis de que no RBPnecesita un receptor para entregar vitamina A. análisis detallado reveló que STRA6 tiene 9 dominios de transmembrana con el extremo N-terminal situadas extracelularmente y C-terminal localizado intracelularmente 40. Situado entre transmembrana 6 y 7 es un dominio esencial RBP unión 39. STRA6 está acoplado tanto LRAT y CRBP-I en la absorción de vitamina A a partir de holo-RBP, pero tampoco LRAT ni CRBP-I es absolutamente necesario para la actividad mejorada STRA6 41. STRA6 capacidad para catalizar la liberación de retinol a partir de holo-RBP es la clave para su actividad de vitamina A captación 41. Al basarse en STRA6 para liberar su retinol, la vitamina A entrega el RBP puede transportar la vitamina A para dirigir las células en los tejidos periféricos con alta especificidad y eficiencia. La importancia crítica del holo-RBP definición y preparación se ilustra no sólo por el debate histórico sobre la existencia del receptor RBP, pero también por tres documentos relacionados recientes basados ​​en holo-RBP definiciones DIFrente de la definición original y correcto 44-46. El papel utilizado por primera vez la definición holo-RBP que fue utilizado para desaprobar la existencia del receptor RBP para estudiar el receptor RBP 44. Los periódicos segundo y tercero, se le ocurrió una tercera definición de holo-RBP que lo hizo aún menos probable de retinol a estudiar para formar un complejo adecuado con las prácticas comerciales restrictivas 45,46. Estos estudios preparan mezclando 3 H-retinol/RBP holo-RBP (ni siquiera apo-RBP) con 3 H-retinol. Puesto que este ensayo no tenía 3 H-retinol/RBP formado y no eliminó excesivo libre 3 H-retinol 45,46, no es un ensayo para 3 H-retinol captación de 3 H-retinol/RBP, pero es una libre 3 H-retinol difusión ensayo. Se ha demostrado previamente que STRA6 no mejora la captación celular de retinol libre por LRAT 38 o CRBP-I 41. Prácticamente todos retinol está obligado a RBP en la sangre y no hay detectable free retinol. Una función principal del receptor RBP es catalizar la liberación de retinol a partir de holo-RBP durante la absorción de retinol holo-RBP 41. Si el retinol es artificialmente liberado o está en la forma libre de comenzar con 45,46, el receptor RBP no es necesario. Los resultados drásticamente diferentes obtenidos a partir del ensayo de difusión libre de retinol en comparación con los ensayos basados ​​en correctamente preparado holo-RBP ilustrar que la preparación correcta de RBP es crucial para sus ensayos funcionales. RBP puede purificar a partir de suero humano 41, pero el procedimiento es complejo y el rendimiento es bajo. Un enfoque alternativo es producir RBP en E. Debido a que E. coli. coli no tiene la capacidad para plegar correctamente proteínas secretadas de mamíferos con más de un par de enlaces disulfuro como RBP, es esencial para prácticas comerciales restrictivas replegamiento y purificar la proteína correctamente plegada. Proteínas mal plegadas, no sólo se comportan de manera diferente de las prácticas comerciales restrictivas corregido doblada en varios ensayos,pero también causan la agregación de proteínas durante el almacenamiento. Por la misma razón, apo-RBP se produce solamente a partir de alta calidad holo-RBP. Se describe aquí un protocolo optimizado para producir RBP alta calidad 100% cargado con retinol a través de la expresión bacteriana, replegamiento y purificación por HPLC. La purificación por HPLC no sólo elimina el RBP incorrectamente plegado, sino también una importante contaminación bacteriana que puede causar artefactos serios si RBP se utiliza en ensayos de transducción de señales. También se describen dos sensibles en tiempo real las técnicas de monitoreo para estudiar el transporte de retinol en STRA6. Ambas técnicas dependen de las prácticas comerciales restrictivas de alta calidad. Debido a limitaciones de espacio, las técnicas clásicas de vitamina radiactivos retinoide y basado en HPLC basado-A ensayos de absorción no se describen aquí.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> hidrocloruro de guanidina </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> cistina </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> cisteína </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescador </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pescador </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicilina </td><td> Pescador </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescador </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptano </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Casein Blocker </td><td> Atravesar </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 concentrador (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 placa </td><td> Pescador </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton jeringa hermética # 1710 </td><td> Pescador </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

La vitamina A es esencial para la visión y el crecimiento / diferenciación de casi todos los órganos humanos. Plasma proteína de unión a retinol (RBP) es el principio y el soporte específico de la vitamina A en la sangre. Aquí se describe una técnica optimizada para producir y purificar holo-RBP y dos en tiempo real de técnicas de supervisión para estudiar el transporte de vitamina A por el receptor de alta afinidad RBP STRA6. La primera técnica hace que sea posible producir una gran cantidad de alta calidad holo-RBP (100%-cargado con retinol) para la vitamina A ensayos de transporte. RBP de alta calidad es esencial para ensayos funcionales porque misfolded RBP versiones vitamina contaminación bacteriana y fácilmente en la preparación RBP pueden causar artefactos. En tiempo real las técnicas de vigilancia como la electrofisiología han hecho contribuciones importantes a los estudios de transporte de membrana. La RBP receptor mediada por el transporte de retinol no se ha analizado en tiempo real hasta hace poco. La segunda técnica descrita aquí es la razónl análisis en tiempo de STRA6 catalizada por la liberación de retinol o de carga. La tercera técnica es analizar en tiempo real de STRA6 catalizada por transporte de retinol holo-RBP para celular proteína de unión a retinol I (CRBP-I). Estas técnicas proporcionan una alta sensibilidad y resolución en la revelación de receptor de la vitamina del RBP un ​​mecanismo de absorción.

Presentamos aquí los resultados representativos de holo-RBP producción y purificación por HPLC (Figura 1), análisis en tiempo real de STRA6 catalizada por la liberación de retinol holo-RBP y la carga de retinol en apo-RBP (Figura 2) y el análisis en tiempo real de STRA6 catalizada retinol transporte de holo-RBP a EGFP-CRBP-I (Figura 3). Sin replegamiento, RBP producida en bacterias es casi completamente plegadas incorrectamente debido ...

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Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Aquí describimos una técnica optimizada para producir alta calidad complejo de vitamina A / RBP y dos técnicas en tiempo real de seguimiento para estudiar la vitamina A por STRA6 transporte, el receptor de las prácticas comerciales restrictivas.

En tiempo real de análisis de transporte de retinol en el receptor de la membrana de plasma Proteína Fijadora del Retinol

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K vistas.  University of California, Los Angeles. Aquí describimos una técnica optimizada para producir alta calidad complejo de vitamina A / RBP y dos técnicas en tiempo real de seguimiento para estudiar la vitamina A por STRA6 transporte, el receptor de las prácticas comerciales restrictivas.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Investigación

Biología

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

La medición cuantitativa de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática por citometría de flujo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Cartografía de la difusión molecular en la membrana plasmática de objetivos múltiples de Búsquedas (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging membrana plasmática Deformaciones Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...