1. Protocolo de la longitud del telómero 19 <ol><li> Aislamiento de ADN </li></ol> La mayoría de los métodos de aislamiento de ADN se pueden usar. Nuestro laboratorio prefiere Qiagen DNeasy kit (# 69506) para las fuentes de sangre. Dependiendo de la fuente de ADN, tales como bucales u otras fuentes, un método de aislamiento diferente puede ser utilizado. <ol start="2"><li> Los cebadores: </li></ol> Todos los cebadores se diluyen a una concentración de stock de 100pmoles/μl en agua de grado PCR y se almacenaron a -20 ° C hasta que sea necesario. Las cepas de trabajo de cebadores están recién hechas y se almacenan a 20 ° C durante un corto período de tiempo (algunos meses.) Cebadores estándar se utilizaron para los telómeros y la β-globina, la SCG, como se describe en O&#39;Callaghan et al. 20 . Primer secuencias: Telo 1: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; Nota: Los cebadores se diluyeron a una concentración de trabajo de 10pmoles/μl, antes de añadir a la mezcla de reacción. <ol start="3"><li> Diluciones seriadas de ADN genómico: </li></ol> Diluciones seriadas de ADN genómico de Telo y copia única del gen (SCG) se crean para generar una curva de valor Ct estándar para el ensayo. El ADN genómico utilizado se extrajo a partir de linfocitos de muestras de sangre. Estas diluciones se crean mediante la dilución de ADN con PCR de grado 2 H 0 para cada concentración por un factor de 1,68 para producir las dos series de diluciones en serie utilizando el mismo ADN genómico. Las concentraciones de partida se han optimizado sobre la base de ensayo y error, y pueden necesitar ser ajustado cuando el uso de diferentes reactivos, instrumentos, el ADN de otras especies, tipos de células, y SCG utilizados. Nota: La dilución en serie usando ADN genómico se hace mezclando suavemente y esperar al menos 15 minutos hasta una hora antvolver a tomar ADN para la siguiente dilución. Cada dilución requiere tiempo para el ADN genómico para disociar. Para almacenamiento, diluciones en serie a largo plazo alícuotas en tiras de PCR para el almacenamiento a -80 ° C. Cada tira de PCR se descongela y se usa una vez para evitar los ciclos de congelación y descongelación que pueden dañar el ADN. <ol start="4"><li> Configuración de reacción para RT-PCR </li></ol> Instrumento utilizado: Roche480 Light termociclador Reactivo: Roche Light termociclador SYBR verde- Diluir las muestras de ADN de prueba a una concentración final de 10 ng / l. Probamos concentración utilizando Nanodrop o Qubit. Nos diluir el ADN de 10ng/μl a 5ng/μl final. No probamos la concentración de nuevo. Componentes de reacción: <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ Td&gt; <td> 6 l </td><td> H20 </td><td> 6 l </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0,2 l </td><td> SCG 1 </td><td> 0,6 l </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1,8 l </td><td> SCG 2 </td><td> 1,4 l </td></tr><tr><td> Rxn mezcla </td><td> 10 l </td><td> Rxn mezcla </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> ADN o dilución en serie </td><td> 2 l </td><td> ADN o dilución en serie </td><td> 2 l </td></tr></tbody></table> Nota: Master Mix se hace sin ADN y con un exceso de 5% a 10%. Tanto Telo y el CGS se ejecutan a la vez en la misma placa utilizando el siguiente programa. Para la prueba de precisión, al menos tres repeticiones de cada muestra y control se debe ejecutar. Las variaciones de los cebadores utilizados pueden afectar los resultados. El protocolo ha sido optimizado para trabajar como sigue en el Roche480 Light Cycler y nuestros cebadores. Endesnaturalizan itial 10 min 95 ° C desnaturalizan Ciclismo 95 ° C 10 seg bodega 60 ° C 5 sec bodega 72 ° C 11 seg retención y adquisición única Repita 45 a 55 veces como sea necesario 2. Detección cuantitativa telomerasa (QTD) Protocolo (Basado en Kit QTD por Allied Biotech, Inc. gato. No. MT3012) Extraer Preparación <ol><li> Precipitar las células o tejidos. </li><li> Lavar una vez con PBS 1x. </li><li> Repellet y eliminar 1x PBS. * </li><li> Resuspender el sedimento celular en 200 l de 1 x tampón de lisis por cada 10 5 -10 6 células o 40-100 mg de tejido. </li><li> Incubar en hielo durante 30 min. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Transferir 160 l del sobrenadante en un tubo nuevo y determinar la concentración de proteína. </li><li> Alícuotas y congelar rápidamente el extracto remanente en hielo seco / etanol, almacenar a -80 ° C. </li></ol> * En el tsu condición, la telomerasa en las células o tejidos congelados es estable durante al menos un año. Cuando se descongelan para su uso, volver a suspender las células inmediatamente en 1 x tampón de lisis. 2.1. Controles de Ensayo Control de inactivación por calor: Para cada muestra, el tratamiento térmico de un extracto de control adicional mediante la incubación a 85 ° C durante 10 min antes del ensayo de actividad de la telomerasa. Curva estándar para la plantilla de control TSR: Efectuar la PCR cuantitativa en tiempo real usando diluciones de TSR, un oligonucleótido con una secuencia similar a los telómeros cebadores incluidos en el kit para generar una curva estándar. <ol><li> Preparar diluciones seriadas 1:05 de la concentración TSR almacén (0,5 Amoles / l) con tampón de lisis </li><li> Realice la telomerasa ensayo estándar de detección por medio de 1 l de cada dilución TSR, incluyendo la concentración de valores. Estas diluciones se pueden almacenar a 4 ° C durante al menos 2 semanas. </li></ol> 2.2. Ensayo de actividad de la telomerasautilizando QTD PCR en tiempo real <ol><li> Para cada muestra, añada lo siguiente a un tubo de PCR o de pared delgada placa de PCR (volumen total de 25,0 l): <ul><li> 12,5 l de 2 x Premix QTD </li><li> 1,0 l de células o extracto de tejido </li><li> 11,5 l de PCR Agua Calificado </li></ul></li><li> Mezclar bien </li><li> Programa de Sistemas de Tiempo Real de detección PCR de acuerdo con el siguiente programa: - 25 ° C durante 20 min (reacción telomerasa) - 95 ° C durante 10 min (PCR paso de activación inicial) 35-40 ciclos de: - 95 ° C durante 30 segundos (desnaturalización) - 60 ° C durante 30 segundos (hibridación) - 72 ° C durante 30 segundos (extensión) </li><li> Coloque los tubos de PCR en el termociclador e iniciar el programa de ciclismo. </li><li> Recoger el ciclo umbral o valor C T después de terminar los ciclos. El ciclo umbral es el ciclo en el que se detecta un aumento estadísticamente significativo de ARn primero. </li></ol> 2.3. Análisis de Datos <ol><li> Generatea curva estándar usando las lecturas de T C y comparar la actividad telomerasa. </li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Longitud de los telómeros proporciona un marcador celular única para estudiar la célula estresada y el envejecimiento y ofrece una visión de los mecanismos de envejecimiento. Desde su papel en el envejecimiento de la primera se había sugerido, una multitud de estudios se han realizado sobre la longitud del telómero a la edad, la longevidad, las enfermedades relacionadas con la edad, el cáncer y el estrés. Durante décadas, el patrón oro de la medición de la longitud del telómero fue el análisis de los fragme...

Los telómeros son secuencias repetidas de ADN hexámeros (TTAGGG) que se encuentran en los extremos de los cromosomas. En cada replicación celular, estos extremos de los cromosomas se acortan. Si se vuelven demasiado cortos, los cromosomas pueden sufrir fusiones telómero finales, recombinación aberrante y degradación. Por lo tanto suficiente mantenimiento de la longitud del telómero juega un papel importante en la estabilidad de los cromosomas y la protección de la célula 38. Mantenimiento de la longitud del telómero es también crucial para genes que se encuentran cerca de los extremos de los cromosomas, ya que la replicación del ADN no puede continuar hasta el final de los cromosomas 1-2. Por consiguiente, la prevención de acortamiento de los telómeros puede mejorar la estabilidad celular. Numerosos estudios han informado de que la longitud de los telómeros se correlaciona con la longevidad de un organismo y el estado de enfermedad, tales como en el cáncer de 3-4, 5 la diabetes, y la enfermedad cardiovascular 6,7. Además, acortamiento de los telómeros se han asociado con el exceso de estrés o unestilo de vida poco saludable 8, tal vez mediante la promoción de un envejecimiento prematuro y muerte celular 9. Por otro lado, algunos estudios han encontrado que no hay diferencia significativa entre la longitud de los telómeros y la longevidad y la enfermedad relacionada con la edad 39, 40, 41. Uno de los mecanismos innatos de la célula de protección de acortamiento de los telómeros es mediante la activación de su propia enzima telomerasa transcriptasa inversa (TERT). Esta enzima y su subunidad, ARN de telomerasa (TERC), un ARN no codificante, utilizan el telómero como una plantilla para añadir telómero se repite en el cromosoma termina 10. Aunque la actividad de la telomerasa está ausente de varios tipos de células y otros mecanismos están implicados en el mantenimiento de la longitud del telómero, el aumento de actividad de la telomerasa se correlaciona con el aumento de la longitud del telómero. Activación de la telomerasa se ha establecido como uno de los mecanismos por los que las células responden a daño y el estrés y evitar la senescencia y muerte prematura. Por ejemplo, ya TElomeres se demostraron en una población de Judios Ashkenazi con excepcional vida útil 11, las mutaciones en TERC o de TERT se han demostrado que contribuyen a la enfermedad fatal 12, y la regulación epigenética de la telomerasa se ​​ha demostrado que tienen un efecto sobre la enfermedad relacionada con la edad 13. Desde su descubrimiento, la longitud del telómero se ha propuesto como un biomarcador para el estado de salud en diversos modelos animales, así como en los seres humanos, pero estos primeros estudios eran difíciles de replicar ampliamente debido a que el método utilizado fue tedioso, largo y costoso. En 2002 y ajustado aún más en 2009, Cawthon propuso y demostró un nuevo protocolo, preciso, rápido y sencillo basado en la PCR para evaluar la longitud de los telómeros y de investigar más a fondo su papel en diversos aspectos de la biología celular, el envejecimiento y la enfermedad 19. La elección del método de medición del telómero correcto para un estudio es esencial. Actualmente, existen varios métodos utilizados para medir la longitud de los telómeros, cada uno con su propiaventajas y desventajas. Tradicionalmente, la longitud de los telómeros se mide usando análisis de transferencia Southern de los fragmentos de restricción terminales (TRFs), que implica: a. la digestión del ADN con enzimas de restricción que no cortan en el telómero se repite con el fin de obtener los TRF, b. Southern Blot de estos TRF se realiza mediante la determinación de la longitud media TRF utilizando una sonda telomérica 14, 37. Aunque este método es muy preciso con un pequeño coeficiente de variación, es una medida directa, y puede ser ventajoso para la medición de distribución de la longitud, el análisis TRF es costoso, mano de obra intensiva y requiere al menos 3 g de ADN. Este método también es insensible a los telómeros cortos y determinación de la longitud puede ser confundida por ADN subtelomérico, que puede ser detectada por la sonda por la (TTAGGG) n igual que las secuencias que contienen 15, 42. Otro método de alta precisión en la medición de la longitud del telómero es Individual telómeros Análisis Longitud Elongación (ESTELA), una singlMétodo E molécula basado en la PCR que sólo requiere una pequeña cantidad de ADN. En este método, se hacen cebadores para reconocer el G rico en voladizo en el extremo de los cromosomas y para unirse a una secuencia subtelomérico única en un cromosoma, que amplifica el telómero de un cromosoma específico. La amplificación resultante es entonces visualizado por Southern Blot. Este método tiene la ventaja de ser muy preciso y es capaz de detectar valores atípicos telómeros cortos 16. Por desgracia, ya que no todos los cromosomas tienen extremos G-ricos y una secuencia subtelomérica utilizable, longitud de los telómeros se puede medir sólo en los cromosomas específicos y estas medidas no puede representar la longitud de los telómeros en la celda 15. Otro método que se ha practicado es el uso de ácido nucleico peptídico (PNA) sondas para detectar la longitud del telómero. Florescence cuantitativa hibridación in situ (Q-FISH) permite visualizar los telómeros durante la metafase, donde el staining de los telómeros con una sonda de ANP en proporción a su tamaño permite la comparación de los telómeros entre cromosomas específicos. Aunque este método también se puede utilizar para las células en interfase, aquí la longitud de los telómeros de los cromosomas distintos puede no ser detectado, lo que introduce una limitación en la medición de longitud de los telómeros en las células senescentes o con poca frecuencia dividiendo 17. PEZ de flujo en su lugar utiliza la citometría de flujo y es actualmente el método más sensible para la medición de la longitud del telómero de células de la sangre en el entorno clínico, pero requiere técnicos altamente cualificados 18. Actualmente, el método estándar para medir la longitud media de los telómeros en nuestro laboratorio se aprovecha de la precisión, la sensibilidad, y la facilidad de PCR cuantitativa en tiempo real. Este método fue posible para la medición de la longitud del telómero por el desarrollo de cebadores novedosos que evitar la síntesis de productos de dímero de cebadores derivados, que de otro modo se han producido en comostándar ensayo debido a la naturaleza repetitiva de los telómeros. Para este ensayo, la medición de la longitud de los telómeros está representada por la relación T / S, el número de copia repetida de los telómeros para el número de genes de copia única. Puesto que existe una relación directamente proporcional entre la longitud de los telómeros y el número de cebadores telómero marcado que se une al ADN durante las etapas iniciales de la PCR, la relación T / S es directamente proporcional a la longitud de los telómeros. La relación T / S se mide mediante la comparación de la diferencia en el Ct, el número de ciclo fraccional al que la muestra ha acumulado fluorescencia cruza un umbral que es varias desviaciones estándar por encima de la línea de base de fluorescencia, entre las muestras con cebadores telómero y SCG cebadores 19. Este método ha sido criticado por su medición indirecta de la longitud de los telómeros, que puede conducir a mediciones inexactas, por ejemplo, en el caso del cromosoma duplicaciones o variaciones del número de copia 15. Además, la comparación entre estudios es a menudo difficult, pero estándar oligómeros han sido desarrollados para medir la longitud de los telómeros absoluta 20. Este método fue fomentada mejorado por Cawthon, utilizando un ensayo qPCR multiplex monocromo. En este ensayo, la PCR se realizó a temperaturas más bajas para los primeros pocos ciclos para evitar la unión del cebador-dímero y el gen de los telómeros y el control se analizaron en el mismo tubo de PCR para evitar un mayor error. Las mediciones de la longitud del telómero resultantes fuertemente correlacionada con la longitud de los telómeros se mide por análisis de transferencia Southern de los TRF y tenía una mayor precisión de 15, 19, 36. Por el momento, QRT-PCR es el único método práctico disponible para probar muestras de gran tamaño y sólo requiere una pequeña cantidad de ADN para llevar a cabo. Una parte fundamental de este método es medidas generales de control de calidad, por lo que cuando se hace correctamente, este método puede proporcionar una valiosa información comparativa acerca de la longitud del telómero. Además, este método ha sido adaptado para su uso más allá de los leucocitos para medirlongitud de los telómeros en una variedad de diferentes tejidos 42. Además, con el fin de entender mejor la biología detrás de mantenimiento de la longitud del telómero y las interacciones entre los dos efectos opuestas (es decir, acortamiento de los telómeros durante la replicación y la elongación por la enzima telomerasa), acompañamos el método de longitud de los telómeros con un ensayo adicional que mide la actividad de la telomerasa. Para este propósito, se utilizó un Protocolo de Amplificación de repetición telomérica, un ensayo in vitro. Brevemente, se lisaron, conserva, las células sintetizan enzimáticamente activas repeticiones teloméricas en un sustrato de oligonucleótido usando la telomerasa, y los productos se amplificaron mediante PCR en presencia de SYBR Green. Los resultados se analizaron a continuación mediante la comparación de la muestra y de control de los valores de umbral Ct. Dado que la telomerasa es una enzima sensible al calor, un calor adicional tratado de control se ejecuta junto a cada muestra 21. <p class=Se necesita &quot;jove_content&quot;&gt; Mientras que la medición de la longitud del telómero puede proporcionar información valiosa sobre la posible función de la longitud del telómero en la fisiopatología de la enfermedad y el envejecimiento, la longitud del telómero no es una propiedad estática y más información para comprender la función del telómero. Estudios de la actividad telomerasa puede añadir información sobre los mecanismos de regulación de la longitud del telómero. Por ejemplo, la activación controlada de la telomerasa puede mantener la longitud de los telómeros y la proliferación celular, pero la activación incontrolada de la telomerasa puede resultar en cáncer. Estos dos métodos de bajo costo hacia delante y recto combinados nos proporcionó no sólo con la evidencia más fuerte hacia una relación entre la longitud de los telómeros y la estabilidad celular, sino también una mayor comprensión de los posibles mecanismos de acortamiento de los telómeros y la recuperación. Con estos métodos esperamos para dilucidar aún más la respuesta de la célula al envejecimiento y varios estados de proliferación celular con el objetivo final de una mejor comprensión de la central de mechanisms de la biología celular.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

Los telómeros son secuencias repetidas de ADN en los extremos de punta de los cromosomas que son diferentes en longitud y en el ser humano puede alcanzar una longitud de 15.000 pares de bases. El telómero sirve como un mecanismo de bioprotectora del cromosoma desgaste en cada división celular. En una cierta longitud, los telómeros se vuelven demasiado cortos para permitir la replicación, un proceso que puede conducir a la inestabilidad cromosómica o la muerte celular. Longitud de los telómeros está regulada por dos mecanismos opuestos: deserción y el alargamiento. Desgaste se produce a medida que cada célula se divide. En contraste, el alargamiento es parcialmente modulada por la enzima telomerasa, que añade secuencias de repetición de los extremos de los cromosomas. De esta manera, la telomerasa podría invertir posiblemente un mecanismo de envejecimiento y rejuvenece la viabilidad celular. Estos son elementos cruciales en el mantenimiento de la vida celular y se utilizan para evaluar el envejecimiento celular. En este manuscrito se describirá un método preciso, breve, sofisticado y barato para evaluar la longitud del telómero en múltiples tejidoss y especies. Este método se aprovecha de dos elementos clave, la repetición en tándem de la secuencia de los telómeros y la sensibilidad de la QRT-PCR para detectar el número de copias diferenciales de muestras ensayadas. Además, vamos a describir un ensayo sencillo para evaluar la actividad de la telomerasa como una prueba complementaria columna vertebral para la longitud del telómero.

Un ejemplo de un ensayo de QRT-PCR longitud de los telómeros se muestra en la Figura 1. En el panel superior izquierdo, muestras marcadas en rojo y verde representan la ubicación de los sujetos evaluados en la placa de 96 pocillos. En el panel superior derecho, se demuestra la curva de amplificación. Cada tema se analiza en dos ensayos (Telómeros y copia única del gen), que se realiza por triplicado. Debido a los diferentes números de copias de ADN producidos en los dos ensayos de los individuos s...

Watch this Scientific Journal Video about Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence at JoVE.com

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Un método preciso, breve, sofisticado y barato se describe que evalúa la longitud del telómero en múltiples tejidos y especies utilizando QRT-PCR. Además, vamos a describir un ensayo sencillo para evaluar la actividad de la telomerasa como una prueba complementaria columna vertebral para la longitud del telómero.

La longitud del telómero y la actividad de la telomerasa, una Yin y Yang de la senescencia celular

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

telomere-length-telomerase-activity-yin-yang-cell

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

46.3K vistas.  Albert Einstein College of Medicine. Un método preciso, breve, sofisticado y barato se describe que evalúa la longitud del telómero en múltiples tejidos y especies utilizando QRT-PCR. Además, vamos a describir un ensayo sencillo para evaluar la actividad de la telomerasa como una prueba complementaria columna vertebral para la longitud del telómero.

Video: Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Investigación

Biología

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Control de la ubiquitina-proteasoma actividad en las células vivas utilizando un degron (dgn)-desestabilizado la proteína verde fluorescente (GFP)-basada en proteína indicadora

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reducción de gravedad Demostraciones entorno de hardware de un prototipo miniaturizado citómetro de flujo y Compañero Microfluidos Tecnología de mezcla

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

La correlación de Gene-específica de ADN de metilación cambios con la expresión y actividad transcripcional de astrocíticos<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Aplicaciones de la sonda: Single-Imaging espectrometría de masas y análisis de celda única bajo condiciones ambientales

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species' diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

La disección y-montaje plana del esqueleto branquial de tres espinas Stickleback

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

Técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...