J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

NOTA: Todos los pasos de este protocolo han sido aprobados por el Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas. 1. Generación de mTERT-ER alelo <ol><li> Introducir ronda en la orientación de vector que contiene el ERT2-LBD (Ligand Binding Domain) aguas arriba y en marco con la secuencia genómica mTERT (exón 1 a través de intrón 2) y un Lox - PGK - Neo - fragmento Lox (Figura 1A) en células ES de ratón con la electroporación. </li><li> Cultura de las células madre embrionarias en la neomicina para 6-10 días. Escoja clones resistentes a la neomicina y expandirse en placas de 48 pocillos. Extraer el ADN genómico utilizando un kit comercial y confirmar la knock-in alelo por Southern blot. </li><li> Inyectar dos ES líneas con más del 95% cariotipos normales en ratones C57BL / 6 blastocistos con un kit de micromanipulación bajo un microscopio invertido. Implante los blastocistos en el útero de madres de alquiler 23. Mate de las quimeras macho de alto grado (70-90%) a C57BL / 6 femachos. </li><li> Confirmar el genotipado de animales heterocigotos mTERT-ERneo por Southern blot. </li><li> Mate de los heterocigotos animales mTERT-ERneo y animales EIIa-Cre borrar el cassette NeoR. Mate a los animales heterocigotos para C57BL / 6 animales por lo menos tres veces, y otras inter-raza heterocigotos animales mTERT-ER para generar homocigosis. </li></ol> 2. Generación de LSL-mTERT alelo <ol><li> Introducir el knock-in focalización vector que contiene un LoxP - triples Stopper - Neo - fragmento LoxP y la secuencia genómica mTERT (entre el exón 1 y el intrón 2, Figura 1B) en células ES de ratón con la electroporación 23. </li><li> Cultura de las células madre embrionarias en la neomicina para 6-10 días. Escoja clones resistentes a la neomicina y expandirse en placas de 48 pocillos. Extraer el ADN genómico utilizando un kit comercial y confirmar la knock-in alelo por Southern blot 23. </li><li> Inject dos ES líneas con más del 95% cariotipos normales en ratones C57BL / 6 blastocistos con un kit de micromanipulación bajo un microscopio invertido. Implante los blastocistos en el útero de madres de alquiler 23. Mate de las quimeras macho de alto grado (70-90%) a C57BL / 6 hembras. </li><li> Confirmar el genotipado de animales heterocigotos LSL-mTERT por Southern blot. </li><li> Aparearse los animales heterocigotos para C57BL / 6 animales por lo menos tres veces, y aún más inter-raza heterocigotos animales LSL-mTERT para generar homozygosity. </li></ol> 3. La reactivación de la telomerasa en mTERT-ER y Ratones LSL-mTERT En Vivo Para mTERT-ER <ol><li> Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos antes de la inyección. </li><li> Anestesiar a los ratones con cámara de isoflurano (4% para la inducción, 2% para el mantenimiento) en 50% (v / v) de oxígeno / 50% (v / v) mezcla de gas de monóxido de dinitrógeno. O anestesiar a los ratones por una mezcla de ketamina xilazina (100 mg / kg de peso corporal + 10 mg / kg de peso corporal). </li><li> Después de alcanzar la anestesia profunda, retire el animal anestesiado de la cámara de inducción, y mantener su cabeza en el interior del tubo conectado a la cámara de isoflurano (2%). </li><li> Apriete las almohadillas de las patas de los ratones para asegurar que el animal está profundamente anestesiado. Ponga pomada en ambos ojos con el fin de evitar que los ojos se sequen. Limpiar la parte posterior de los ratones con solución de povidona yodada. </li><li> Inyectar la liberación lenta pellet 4-OHT con trocar de precisión (10 G) debajo de la piel de la espalda y empujar el sedimento todo el camino a la línea media entre dos hombros. </li><li> Selle la incisión con el clip herida aplicador y monitorear los ratones para la recuperación de la anestesia. Retire los clips de 10 días después. Calor suplementario no es necesario debido a que el procedimiento ha terminado en breve. </li><li> Período de tratamiento con 4-OHT pellet debe ser optimizado de acuerdo con el propósito del estudio. </li></ol> Para LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> El tamoxifeno (10 mg / ml, disuelto en aceite de maíz) se inyecta por vía intraperitoneal dos días consecutivos (200 ul / 25 g / día). </li></ol> 4. Aislamiento de células madre neurales y reactivación de la telomerasa in vitro <ol><li> Los ratones son sacrificados con dióxido de carbono y se quitan los cerebros. Siga el protocolo de kit disociación tejido neural disponible comercialmente como por fabricante. </li><li> Resuspender el polvo liofilizado en el vial etiquetado con Solución 4 con 1 ml de medio de cultivo celular para la Solución 4. No vórtice. Esta solución debe ser entonces alícuotas y se almacenó a -20 ° C para su uso posterior. </li><li> Pre-calienta la mezcla a 37 ° C durante 15 minutos antes de su uso. </li><li> Hacer Enzyme Mix 1: Solución 1 (50 l) y solución 2 (1,900 l). Haga Enzyme Mix 2: Solución 3 (20 l) y la solución de 4 (10 l). </li><li> Preparar 1950 l mezcla de enzimas 1 para un máximo de 400 mg de tejido y de vórtice. Pre-calienta la mezcla a 37 ° C durante15 min antes de usar. </li><li> Saque los cerebros de ratón 1-día, y mantener a los prosencéfalos quitando los bulbos olfatorios y el cerebelo. Mantenga los tejidos del cerebro anterior en 1 ml de medio de cultivo frío ya que la remoción y almacenar en 4 ° C. Asegúrese de procesar el tejido neural dentro de 1 hr. </li><li> Determinar el peso de tejido para asegurarse de que no se supere el límite de 400 mg por la digestión. Coloque el cerebro en la tapa de una placa de 35 mm de diámetro de Petri, y aplastar el cerebro utilizando un bisturí. </li><li> Utilizando una punta de pipeta de 1 ml, añadir 1 ml de HBSS (w / o Ca / Mg) y piezas de pipeta de nuevo en un tubo de 15 ml. Enjuague con HBSS (w / o Ca / Mg). Centrifugar a 300 xg durante 2 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante con cuidado. </li><li> Añadir 1.950 l de mezcla de enzima precalentado 1 (Soluciones 1 y 2) por hasta 400 mg de tejido. Incubar en el tubo de 15 ml durante 15 min a 37 ° C, mezclando por inversión o agitando el tubo cada 5 min. </li><li> Preparar 30 l mezcla de enzimas 2 por muestra de tejido mediante la adición de 20 &amp; #956; l de la solución de 3 a 10 l de solución de 4. A continuación añadir a la muestra. Invierta suavemente para mezclar. No lo hagas vórtice. </li><li> Disociar el tejido mecánicamente usando una amplia punta, pipeta Pasteur pulida al fuego por la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces lentamente. Evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 10 min, invirtiendo el tubo cada 3 min. </li><li> Repita el paso de 4,11 y 4,12 paso si los tejidos son más grandes que 200 mg. </li><li> Aplicar la suspensión celular a un filtro de células de 70 micras, colocado en un tubo de 50 ml. Aplicar 10 ml de PBS a través de filtro de células. Desechar filtro de células y la suspensión de células se centrifuga a 300 g durante 20 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Resuspender las células con medio de células madre hasta el volumen requerido para otras aplicaciones. </li><li> Para activar la telomerasa en LSL-mTERT NSC, el tratamiento de las células con 100 mM de 4-OHT durante dos días. Para activar la telomerasa en mTERT-ER NSC, mantener las células en medio de cultivo con 100 mM 4-OHT. </li></ol> 5. telómeros FISH <ol><li> Preparar los cromosomas en metafase de células cultivadas. </li><li> Para FFPE (fijados con formalina y embebidos en parafina) secciones de tejido, Desparafinar en xileno y rehidratar en series de etanol durante 5 minutos cada uno (100%, 90%, 70%, 50% de etanol) y PBS durante 5 min. </li><li> Post-fix en el metanol: ácido acético (3: 1) durante 1-2 horas. Deshidratar en serie etanol frío durante 5 min cada uno (70%, 90%, 100% de etanol) y secar al aire. Lave en 1x PBS a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Desnaturalizar cromosomas en formaldehído al 4% a 37 ° C durante 2 min. Deshidratar en serie etanol frío 5 min cada uno (70%, 90%, 100% de etanol) y secar al aire. </li><li> Aplicar de 12 a 25 l de la mezcla de hibridación PNA a cada diapositiva. (Mezcla de hibridación: formamida al 70%, SSC 0.06x, 0,2% de BSA, 0,5 ng / l tRNA, 0,5 ng / l telómero o centrómero sondas) </li><li> Selle la hoja de la cubierta con cemento de goma. Preparaciones cromosómicas Post-desnaturalizar y secciones de tejido a 80 ° C durante 4 men. Hibridar a temperatura ambiente o 37 ° C durante 2-4 horas en cámara húmeda. </li><li> Lavar a temperatura ambiente con tampón de lavado 2 x 15 min. (Tampón de lavado: 70% de formamida, SSC 0.06x, pH 7,2). Lavar a temperatura ambiente de 3 x 5 minutos con PBST. Diapositivas tinción de contraste con DAPI o fluorescencia roja lejana para el examen microscópico. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aquí, se presenta la generación de dos alelos telomerasa murino inducibles y cómo reactivar la telomerasa in vivo e in vitro. El paso fundamental para la reactivación de la actividad mTERT-ER es mantener una concentración continua de tamoxifeno, por lo que optan por utilizar 4-OHT gránulos de liberación vez fabricados por Innovative Research of America. Los pellets siguen liberando 4OHT a un nivel en sangre en estado estacionario de 1 ng / ml durante un máximo de 60 días. En un estudio anterior, hemos demostrado que la reactivación de la actividad de la telomerasa con esta estrategia fue capaz de mejorar los fenotipos degenerativos tales como el agotamiento de células madre, el deterioro de las respuestas de la lesión tisular y la insuficiencia de órganos en múltiples órganos que fueron inducidos por la disfunción de los telómeros en G4 mTERT ER / ER ratones 20. Aparte de estudiar la función de la telomerasa en el envejecimiento, estos dos alelos telomerasa inducibles también pueden utilizarse para estudiar el cáncer. Los estudios anteriores se llevaronventaja de estos alelos para explorar el papel de desgaste de los telómeros y la telomerasa reactivación en la conformación de los genomas y que afectan la biología de las células T linfoma tímico 21 y cáncer de próstata 22. Estos dos estudios demostraron que la disfunción telomérica en la generación de finales G4 Atm - / - mTERT ER / ER y G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L ratones proporciona un mecanismo alimentando la adquisición de eventos mutagénicos temprana para la iniciación del tumor, sin embargo, prevención de la progresión de los tumores completamente malignos. Cuando la telomerasa se ​​reactivó en el contexto de la inestabilidad genómica inducida por la disfunción de los telómeros, los puntos de control de daños del ADN y la inestabilidad cromosómica rampante fueron suprimidas, lo que permitió la progresión lleno de tumores malignos con nuevas propiedades biológicas tales como la metástasis ósea del cáncer de próstata 21 y la infiltración de cerebro de timosc linfoma 21. Fenómenos similares se observaron también en otros tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de colon y el cáncer de páncreas (comunicaciones personales con los Dres. Haoqiang Ying, Adam Boutin y Ronald DePinho). Puesto que la proteína de TERT-ER se puede conmutar fácilmente entre ON y OFF estados dependiendo de si los animales son tratados con tamoxifeno o vehículo, los modelos de tumores generados por alelo mTERT-ER pueden ser utilizados para probar la terapia anti-telomerasa. En el estudio anterior, los tumores generados en G4 Atm - / - mTERT ER animales / ER fueron liberados de 4-OHT; en reducción de la telomerasa, los tumores se redujeron finalmente debido a la reincorporación de los telómeros puestos de control para la disfunción inducida 21. Sin embargo, algunos de los tumores resistencia adquirida en respuesta a la telomerasa extinción mediante la activación de un alargamiento alternativo de los telómeros (ALT) mecanismo. Además de la caracterización de estos tumores ALT + resistentes mostró que tbueno tener la transcripción aberrante de genes implicados en la biología mitocondrial y de defensa oxidativo incluyendo un regulador maestro de la síntesis mitocondrial y oxidativa defensa PGC-1β. Derribo de PGC-1β o SOD2 (otro regulador de defensa oxidativa) elimina significativamente células ALT + tumorales, mientras que mantienen las células telomerasa + tumorales permanecen relativamente intactos 21. Una limitación de estos dos alelos knock-in es que sólo se pueden permitir la reactivación de la telomerasa en el nivel endógeno porque están en el locus nativo del gen de la telomerasa. En la mayoría de los cánceres humanos, la telomerasa se sobreexpresa en realidad a un nivel mucho más alto. Con el fin de mejorar el nivel de la telomerasa, una modificación podemos considerar es insertar el constructo mTERT-ER con un promotor más fuerte, tal como PGK (fosfoglicerato quinasa), el promotor en locus Rosa26. En conclusión, estos dos nuevos alelos telomerasa murinos inducibles proporcionan Genet sin precedentesic herramientas para estudiar las funciones de la telomerasa en el envejecimiento y la homeostasis del tejido, así como la progresión del tumor, especialmente bajo el fondo de pre-adquirido telómero disfunción inducida por la inestabilidad genómica. El alelo mTERT-ER también puede ser usado para estudiar la terapia anti-telomerasa mediante el cruce en otros modelos de ratón de tumor en decúbito prono.

La telomerasa es una enzima responsable de mantener los telómeros. Estos son secuencias repetitivas en los extremos de los cromosomas que protegen su integridad. Los componentes básicos de holoenzima telomerasa son una subunidad catalítica de la transcriptasa inversa (terc) y una subunidad de ARN (TERC) que sirve como la plantilla para la adición de la telomérica repite 1,2. Aunque generalmente suprimida en las células somáticas diferenciadas, la telomerasa presenta actividad robusta y juega un papel importante en las células germinales, células cancerosas y células madre. mTERC y mTERT ratones knockout proporcionan grandes en sistemas modelo in vivo para estudiar las funciones de la telomerasa en las células madre y el cáncer. El mTERC y mTERT ratones knockout (G1) no mostraron fenotipos obvios debido a la larga reserva de los telómeros en ratones 3. Sin embargo, entrecruzándose en serie mTERC y mTERT ratones knockout en generación tardía (G5-G6) resultó enprogresiva erosión de los telómeros y, finalmente, provocó una grave degeneración de los tejidos de proliferación 4. Generación Tardío (G5-G6) mTERC - / - ratones son infértiles debido a los altos índices de apoptosis en los testículos y el agotamiento de las células germinales. G5-G6 mTERC - / - ratones también muestran fenotipos degenerativos en los tejidos de proliferación incluyendo la médula ósea, intestino y piel debido a los altos índices de apoptosis y la capacidad de auto-renovación defectuosa en tallo tejido / compartimentos celulares progenitoras 4. Las células madre hematopoyéticas en la médula ósea de la generación tardía mTERC - / - ratones de pérdida de exposición de potencial proliferativo, la capacidad de auto-renovación comprometida, aumento de la apoptosis y, finalmente agotamiento funcional 5,6. Del mismo modo, se observó un aumento progresivamente cuerpos apoptóticos en las criptas intestinales en cada generación sucesiva de G1-G6 mTERC - / - ratones 7,8. Tél efecto deletéreo de los telómeros disfuncionales no parece limitarse a los tejidos alta rotación ya que tanto la proliferación de las células madre neurales adultas in vitro y la neurogénesis en vivo fueron severamente afectados en la generación tardía (G4-G5) mTERC - / - ratones 9 . El papel de la telomerasa en las células madre se ve apoyado por los hallazgos en un raro trastorno genético disqueratosis congénita humana (DKC), que en algunos aspectos se asemeja a un envejecimiento prematuro 10,11. DKC es causada por mutaciones en TERC, de TERT, y los genes que codifican la disquerina, una subunidad de la telomerasa núcleo, y otra disquerina proteínas asociadas 12. En promedio, los telómeros en pacientes DKC son más cortos que el 99% de los controles de la misma edad. La morbilidad grave de la enfermedad es debido a la anemia aplásica, que es causada por el mantenimiento defectuoso de las células madre hematopoyéticas. Otros aspectos de la enfermedad, tales como la leucoplasia oral, distrofia de la uña, retardati mentalesen, testículos atrofia y complicaciones pulmonares todos sugieren funciones de las células madre de tejidos y células progenitoras 10, los hallazgos en estrecha concordancia con los deteriorados a fines de generación de los ratones knockout de la telomerasa. DKC pacientes son propensos a síndrome mielodisplásico y tienen una mayor prevalencia de neoplasias malignas de la mucosa. Por lo tanto, la deficiencia de la telomerasa en pacientes humanos recapitula los defectos de funciones de las células madre y la predisposición tumor que se observan en los ratones knockout de la telomerasa generación tarde. Los telómeros cortos y alta actividad de la telomerasa son características del cáncer. Como las células normales o premalignas se dividen, los resultados bajos o ausentes de la actividad de la telomerasa en la eventual erosión de los telómeros y la activación de los puestos de control celulares similares a los provocados por el doble-breaks varados ADN (DSBs) 13. Como DSBs clásicos, disfunción de los telómeros se ha demostrado que induce p53 y asociado respuestas celulares, tales como la senescencia y / o apoptosis 14,15. Tras la inactivación mutacional de p53, el ciclo celular y la supervivencia celular se han mejorado en las células con disfunción de los telómeros, que proporciona un mecanismo mutador pro-cancerígeno caracterizado por translocaciones y regionales amplificaciones y deleciones 16,17. Al mismo tiempo, continuó la disfunción de los telómeros y la inestabilidad cromosómica asociada desenfrenada (incluso en las células p53 nulos) parecen limitar la progresión maligna completa de tales cánceres. Por ejemplo, la generación de finales de G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - ratones mostraron reducido significativamente la incidencia de linfoma en comparación con Ink4a / Arf ratones nulos debido al desgaste de los telómeros. En otro estudio, las lesiones adenomatosos más avanzados en G4 mTERT - / - min ratones APC fueron suprimidas en gran medida en comparación con los ratones APC min debido a la detención del crecimiento significativo y la apoptosis 18,19. Laobservación de que los telómeros disfunción inducida por la inestabilidad genómica inhibe la progresión del tumor induce al especulación de que la activación de la telomerasa puede permitir la progresión maligna en parte por sofocar la inestabilidad genómica a un nivel compatible con la viabilidad de células de cáncer y / o neutralizante de p53-dependiente o mecanismos de control -independiente. Con el fin de estudiar si la reactivación de la telomerasa puede detener o incluso revertir el envejecimiento de las células madre, y si la reactivación de la telomerasa puede promover la tumorigénesis en el contexto de la inestabilidad genómica, generamos dos alelos telomerasa murinos inducibles. El primero es de 4 hidroxitamoxifeno (4-OHT) (mTERT-ER) fusión de TERT-receptor de estrógeno-inducible ronda en alelo. En ausencia de 4-OHT, los ratones homocigotos para mTERT-ER (designado mTERT ER / ER) son deficientes en actividad de la telomerasa y sostener mismos fenotipos citogenéticas y celulares como mTERT convencional o mModelo nocaut TERC. A 4-OHT tratamiento, actividad de la proteína de TERT-ER puede ser restaurado a niveles comparables a la proteína nativa de TERT 20, 21. El segundo alelo es una novela de TERT inducible ronda en el alelo que contiene un casete LoxP-Stopper-LoxP intrónico (LSL- mTERT); tras la escisión de LSL Cre-mediada, mTERT se re-expresa bajo mecanismos de control de la expresión endógena 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21810031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1005796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine-xylazine mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxfien</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT pellet</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>Custermized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Trochar (10 Gauge)</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clip applier</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clip</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A-433S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>22-032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>F84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA telomere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F1001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA centromere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F3003-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1325-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5636-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber cement</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

Pérdida de la integridad del genoma y su señalización de daño del ADN asociado y respuestas de control del telómero disfunción inducida por los conductores son bien establecidas que causan la degeneración de los tejidos durante el envejecimiento. Cáncer, con tasas de incidencia aumenta considerablemente con la edad, se caracteriza por longitudes de los telómeros cortos y alta actividad de la telomerasa. Para estudiar el papel de la disfunción de los telómeros y la reactivación de la telomerasa en el cáncer y el envejecimiento, el protocolo muestra cómo generar dos telomerasa inducible murino ronda en alelos de 4 hidroxitamoxifeno (4-OHT) inducible de TERT-receptor de estrógeno (mTERT-ER) y Lox -Stopper-Lox de TERT (LSL-mTERT). El protocolo describe los procedimientos para inducir la disfunción telomérica y reactivar la actividad de la telomerasa en ratones mTERT-ER y LSL-mTERT in vivo. Los datos representativos muestran que la reactivación de la actividad telomerasa puede mejorar los fenotipos degenerativos tisulares inducidas por la disfunción de los telómeros. En order para determinar el impacto de la reactivación de la telomerasa en la tumorigénesis, hemos generado próstata PB-Cre4 modelo tumoral PTEN G4 L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L y el modelo de linfoma de células T del timo G4 Atm - / - mTERT ER / ER . Los datos representativos muestran que la reactivación de la telomerasa en el contexto de la inestabilidad genómica inducida por la disfunción de los telómeros puede mejorar enormemente la tumorigénesis. El protocolo también describe los procedimientos utilizados para aislar células madre neurales (NSC) de ratones mTERT-ER y LSL-mTERT y reactivar la actividad telomerasa en células madre neurales in vitro. Los datos representativos muestran que la reactivación de la telomerasa puede mejorar la capacidad de auto-renovación y la neurogénesis in vitro. Por último, el protocolo se describen los procedimientos para realizar los telómeros FISH (Hibridación Fluorescente In Situ) tanto FFPE ratón (fijados con formalina y ParafEmbedded) tejidos cerebrales aleta y metafase los cromosomas de las células cultivadas.

Las estrategias para generar murino mTERT-ER y LSL-mTERT knock-in alelos se describen en la Figura 1A y 1B. En concreto, un LoxP - triples Stopper - Neo - se insertó un fragmento LoxP entre el exón 1 y el exón 2 del locus mTERT para generar alelo LSL-mTERT. Para generar alelo mTERT-ER, dominio ERT2-LBD en marco con el gen de mTERT se insertó en el extremo N-terminal del exón 1. Hemos demostrado que cuando la telomerasa se ​​reactivó transitoriamente en ratones disfunción de los telómeros tratándolos con pellets de 4-OHT para 4 semanas, el fenotipo degenerativo podrían ser mejorados en múltiples órganos tales como el cerebro (Figura 2A) y los testículos (Figura 2B). Con el fin de determinar el impacto de la reactivación de la telomerasa en las células cultivadas in vitro, se aislaron células madre neurales (NSC) de G4 generación finales LSL-mTERT y G4 mTERTRatones -ER. Hemos demostrado que cuando la telomerasa se ​​reactivó en los telómeros NSCs disfuncionales, la capacidad de auto-renovación de células madre neurales se incrementó considerablemente (Figura 3), y en la neurogénesis vitro también fue significativamente mayor (Figura 3B). Con el fin de determinar el impacto de la reactivación de la telomerasa en la tumorigénesis en el contexto de la disfunción de los telómeros, que generó PB-Cre4 PTEN L-mTERT LSL / L (modelo de próstata tumor) / L p53 L / L L y Atm - / - mTERT ER / ER (modelo de linfoma de células T del timo) cohortes generación tarde. Cuando la telomerasa fue reactivado por tratamiento con tamoxifeno en estos ratones con la inyección (Figura 4A) o pellets de 4-OHT durante 8 semanas (Figura 4B), la tumorigénesis se mejoró en gran medida tanto en modelo de tumor de próstata (Figura 4A) y del timo modelo de linfoma de células T ( <strong&gt; Figura 4B). Por último, se informó de los protocolos de la realización de FISH de los telómeros en los tejidos del cerebro FFPE ratón (Figura 5) y metafase los cromosomas (Figura 5, recuadro). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Figura 1: (A) mTERT-ER ronda en la estrategia. TV, vector dirigido; WT, alelo de tipo salvaje; KI, ronda en alelo; LA, brazo izquierdo; RA, el brazo derecho; E1, el exón 1; E2, el exón 2; neo, pgk promotor impulsado gen resistente a la neomicina; ER, receptor de estrógeno modificado (ERT2) la unión del ligando de dominio; DT, dyphteria gen de la toxina. (B) LSL-mTERT ronda en la estrategia. TV, vector dirigido; WT, alelo de tipo salvaje; KI, ronda en alelo; LA, brazo izquierdo; RA, el brazo derecho; E1, el exón 1; E2, el exón 2; neo, pgk promotor impulsado gen resistente a la neomicina; TAPÓN, tres secuencias de parada transcripcional repetitivos; DT, dyphteria gen de la toxina. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Figura 2: Los datos representativos que muestran una reactivación de la telomerasa aminora fenotipos degenerativos de órganos Imágenes representativas de cerebros (izquierda). y los testículos (derecha) de ratones G0 y G4 mTERT ER-tratados con placebo o 4-OHT durante 4 semanas. Las barras de escala indican 50 micras. Vuelva a imprimir con permiso de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Figura 3:. Los datos representativos que muestran una reactivación de la telomerasa aumenta la auto-renovación y la neurogénesis de células madre neurales in vitro (A) Imágenes representativas de células madre neuraless aislado de G4 LSL-mTERT (panel superior) y G4 mTERT-ER (panel inferior) que crece en medio de células madre tratadas con vehículo o 4-OHT. (B) Imágenes representativas de la neurogénesis in vitro (Tuj1 +) de las células madre neurales aisladas de G4 mTERT-ER cultivaron en medio de diferenciación (con 1% de FBS) tratados con vehículo o 4-OHT. Las barras de escala indican 100 micras. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Figura 4:. Los datos representativos para mostrar la reactivación de la telomerasa aumenta la tumorigénesis en un contexto de inestabilidad genómica (A) Imágenes representativas de los tumores de próstata disecados de G0 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT- / -, Y G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L tratadas con tamoxifeno. Vuelva a imprimir con permiso de 22. (B) Imágenes representativas de los linfomas de células T del timo disecados de G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER tratado con vehículo, y G4 Atm - / - mTERT ER / ER trató con 4- OHT durante 8 semanas. Las barras de escala indican 1 cm. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Figura 5: Imágenes representativas de telomérica y FISH centromérica en FFPE ratón tejido cerebral y metafase (recuadro). El color rojo indica ADN, verde indica tinción de los telómeros, y cian indica cetinción ntromere. Las barras de escala indican 1 mm.

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Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Utilizando murino Inducible telomerasa alelos en los Estudios de la degeneración del tejido / Regeneración y Cáncer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K vistas.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Investigación

Medicina

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

La tinción inmunohistoquímica de B7-H1 (PD-L1) en Parafina embebido en diapositivas de tejido pancreático Adenocarcinoma

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

A preclínicos modelo murino de metástasis hepática

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Latencia Modelo de cáncer de mama estrógeno-sensibles en la médula ósea: una herramienta de Estudios mecanismo molecular y Hipótesis Generación

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

El inducible Modelo BM12 del lupus eritematoso sistémico (LES) en ratones C57BL / 6 ratones

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Preclínica modelo murino ortotópico de cáncer de próstata humano

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Analizar los efectos beneficiosos de los suplementos nutricionales sobre las funciones epitelial intestinal de barrera durante Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

Generación de un modelo Murino ortotópico de cáncer de mama metastásico y la realización de mastectomía Radical murino

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...