El protocolo combina el poder de generar tipos de células cardiovasculares humanas utilizando células madre pluripotentes inducidas y una técnica versátil para generar esferoides cardíacos en menos de 72 horas. Estos esferoides cardíacos se pueden utilizar para el modelado de enfermedades y pruebas de drogas. Una de las principales ventajas de esta técnica fácil es que se podrían generar casi 1000 esferoides cardíacos en una placa estándar de 12 pocillos.
Y lo más importante, todos y cada uno de los esferoides cardíacos se pueden ensayar por su función contráctil utilizando una técnica basada en imágenes. Después de derretir la agarosa en el microondas, colóquela en el gabinete de bioseguridad y deje que se enfríe durante tres minutos. Pipetee 700 microlitros de la agarosa fundida y agréguela al micromoldo de silicona de una matriz de nueve por nueve, teniendo cuidado de evitar generar burbujas.
Coloque cuidadosamente el molde en el bloque de hielo prefrío para acelerar la duración de la agarosa. Una vez que la agarosa se vuelve translúcida, doble cuidadosamente los bordes del micromoldo para perder la réplica de agarosa y pelar suavemente la réplica de todos los lados para separarla del micromold de silicona. Transfiera la bandeja de microtejigas de agarosa que contiene 81 huecos circulares a una placa estéril de 12 pocillos, luego agregue dos mililitros de PBS a la bandeja de microtinaja de agarosa e inspecciónela bajo el microscopio en busca de burbujas atrapadas o pozos de forma irregular.
Sumerja la bandeja de agarosa en dos mililitros de etanol al 70% durante la noche, seguido de un tratamiento UV en el gabinete de bioseguridad durante una hora. Retire el etanol al 70% y lave dos veces con agua destilada, y una vez con dos mililitros de PBS. Una vez que los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas, los fibroblastos cardíacos y las células endoteliales se cuentan después de la tripsinización y neutralización, coloque las suspensiones celulares en el hielo.
En un nuevo tubo, mezcle los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas, los fibroblastos cardíacos y las células endoteliales. Luego, retire el PBS del pozo y la cámara de siembra celular sin tocar los huecos, y agregue 200 microlitros de la suspensión celular gota a gota. Permita que las células se asienten a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante dos horas.
Agregue un medio de fabricación de micro tejidos que rodea el molde de agarosa para cubrir la superficie de la cámara interna. Después de 24 horas, observe los esferoides autoensamblados y compactos en los huecos circulares. Cambie el medio cada dos días para mantener los esferoides.
Por lo general, después de 48 horas, se puede observar un latido espontáneo de los esferoides. Cultive los tipos de células individuales por separado en un medio de matriz de membrana basal o en portaobjetos de cámara recubiertos de gelatina. Enjuague suavemente los microtusores cardíacos de los huecos circulares y recójalos en un tubo de crónica de 15 mililitros.
Aspirar el medio y enjuagar las células o los microtejidos, con un mililitro de PBS. Luego, fije las células o los microtejidos con un tampón de fijación que contenga 4.2% de PFA e incube a temperatura ambiente. Aspirar el PFA e incubar las células o los microtejidos con un mililitro de solución permeabilizante.
Luego, aspire la solución y enjuague con dos o tres mililitros de PBS. Agregue de 500 a 1000 microlitros de solución de bloqueo a las células e incube durante al menos una hora para los portaobjetos de la cámara, y durante tres a cuatro horas para los microtejidos. Incubar las muestras con anticuerpos conjugados en la solución de bloqueo durante una hora para los portaobjetos de la cámara, y durante la noche a cuatro grados centígrados para los microtejidos cardíacos.
Lave los deslizadores de la cámara tres veces con 500 microlitros de 0.1% Tween 20, con cinco minutos de duración entre cada lavado, luego realice un lavado final con PBS. Lave los micro tejidos cardíacos cinco veces con dos mililitros de 0.1%Tween 20, con una duración de 20 minutos entre cada lavado. Luego, realice un lavado final durante 20 minutos adicionales.
Incube las células o los microtejidos con DAPI antes de la microscopía confocal, luego transfiera cuidadosamente los microtejidos cardíacos a un plato de fondo de vidrio de 35 milímetros y agregue PBS para sumergir el microtejido. Enjuague los microtejidos de los huecos circulares con uno mediano usando una punta de pipeta ancha o de un mililitro en un tubo crónico de 15 mililitros, y deje que se asienten. Luego, aspire el medio y enjuague con un mililitro PBS.
Agregue de 200 a 300 microlitros del tampón de digestión enzimática e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Luego mezcle los microtejidos suavemente durante un minuto y repita la incubación. Después de la incubación, mezcle los microtejidos vigorosamente con una punta de pipeta regular de un mililitro para digerirlo en células individuales.
Obtenga una suspensión de células turbias, y neutralice inmediatamente la suspensión celular con cinco mililitros de medio que contengan 5% fbs. Cuele la suspensión celular a través de un colador celular de 40 micrómetros y cuente el número total de células. Centrifugar la suspensión unicelular a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Aspirar el sobrenadante y resuspendir las células en tampón de unión a anexinas con FITC Annexin V y yoduro de propidio, o colorante de exclusión de células muertas TO-PRO-3, e incubar durante 10 minutos en hielo. Después de la incubación, agregue 300 microlitros del tampón de unión a la anexina a la suspensión celular y transfiéralo a un tubo FACS de fondo redondo para el análisis de citometría de flujo. Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas purificadas, las células endoteliales y los fibroblastos cardíacos se visualizaron mediante microscopía de contraste de fase.
La pureza de los diferentes tipos de células se determinó mediante inmunomanchación y citometría de flujo. La troponina T se utilizó como marcador de cardiomiocitos, y se logró una pureza superior al 90%. La molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias CD31 y vimentina se utilizaron como marcadores para células endoteliales y fibroblastos cardíacos, e indicaron una pureza superior al 98 y 96%, respectivamente.
La tinción de inmunofluorescencia reveló que los cardiomiocitos eran los más pesados y ocupaban el centro de los microtejidos, mientras que las células endoteliales se intercalaban a lo largo de los microtejidos, y los fibroblastos cardíacos ocupaban predominantemente la periferia. La digestión de los microtejidos utilizando este ritmo uno y Liberase TL dio como resultado proporciones celulares altamente viables con menos células apoptóticas después de dos semanas en cultivo. La exposición de una hora de los microtisones cardíacos a una alta concentración de doxorrubicina indujo cardiotoxicidad dependiente de la dosis.
La contractilidad de los micro tejidos y el movimiento de los vectores generaron un pseudo mapa de calor que ilustró el perfil de contracción promedio a través del microtejido. El movimiento contráctil de los microtejidos cardíacos generó picos positivos que se midieron como la velocidad de contracción, la velocidad de relajación y la tasa de latido, que se calculó como el tiempo transcurrido entre dos ciclos de contracción. La contractilidad de los microtejidos cardíacos fue consistente durante cuatro semanas en cultivo.
El calentamiento de las células es uno de los pasos más importantes en este protocolo en particular, donde se debe tener cuidado de dispensar cuidadosamente la suspensión celular en forma de gota en la matriz de agarosa para una distribución uniforme dentro de los micropocillos y para evitar el desbordamiento. Utilizando el protocolo de radiación optimizado de estos microtejidos, se podría someterlos a tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, como RNA-seq de una sola célula o ATAC-seq de una sola célula para comprender los patrones de expresión génica específicos de la célula que resultan debido a diferentes condiciones de tratamiento.
