Nos gustaría dar las gracias a Curt Mazer de Isis Pharmaceuticals para la prestación de asesoramiento relacionados con la cirugía de ICV bolo, así como Isis Pharmaceuticals en su conjunto para el suministro de nuestro laboratorio con OSS. Además, nos gustaría dar las gracias a Carey Shaner por revisar este artículo. TMM y SLD son apoyados por NIH subvenciones P50AG005681, K08NS074194 y R01NS078398.

El protocolo a continuación ha sido aprobado por el Cuidado de Animales institucional y Comités uso en la Universidad de Washington en St. Louis y está de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso de animales de experimentación. Si esta es la primera vez que la realización de cirugías, le recomendamos que consulte el artículo de Jove en cirugías de roedores como introducción antes de comenzar la 14. OSS se pueden entregar en el SNC a través del ratón tanto para la infusión de la bomba osmótica y una sola inyección en bolo ICV. Debido a esto, el procedimiento detallado a continuación se divide en dos segmentos. Pros y contras de cada método se abordaron en la sección de Discusión. Las coordenadas que se utiliza en los protocolos son para adultos y C57BL6 ratones B6C3. Coordenadas de rata correspondientes se pueden encontrar en la Tabla 1. Bomba osmótica ALZET 1. Preparación de bombas osmóticas Alzet <ol><li> Establecer un drap estérilcorreo y colocar cuidadosamente los siguientes elementos en ella, teniendo cuidado de no tocar nada directamente con el fin de mantener la esterilidad: bomba osmótica (s), modulador de flujo (s), 1 ml jeringa estéril (s), hoja de bisturí, y las secciones de tubería (1 pedazo de tubería = 5 bombas). Para los ratones, hay tres opciones para bombas: 14 días, 28 días y 42 días (Figura 2A). </li><li> Destapar y llenar tubos cónicos estériles de 50 ml con 15 a 20 ml de solución salina. Hasta 6 bombas montadas se pueden añadir por tubo cónico. </li><li> Llene un plato de Petri p60 con etanol al 100%. Añadir número apropiado de catéteres para el etanol. Para los ratones, longitud del catéter es de 2,5 mm. </li><li> Filtrar cada ASO en tantos tubos Eppendorf de 1,5 ml, según sea necesario. Incluye un tubo de Eppendorf lleno con 0,9% de solución salina estéril para llenar el tubo con. </li><li> Una vez que todo está preparado, se puso los guantes estériles. Asegúrese de no tocar nada que no sea estéril. Cámbiese los guantes si es necesario. </li><li> Para cada ASO a ser utilizado, llenar una jeringa de 1 mly loadpumps mediante la colocación de la aguja en el orificio superior y llenar lentamente hasta que el exceso de fugas a cabo. Continúe hasta que todas las bombas están llenas. </li><li> Destape el Flow-moduladores y se insertan en las bombas. Empuje el flujo de-modulador casi la totalidad de la forma en, dejando un espacio de 3-5 mm. </li><li> Uso de la hoja de bisturí, corte cada pedazo de tubo en 5 segmentos iguales. Tome una pieza de tubo, llenar con solución salina estéril usando una jeringa de 1 ml, y insertar la parte superior del modulador de flujo en un extremo de la tubería. Luego tomar una cánula desde el etanol y conectarlo al otro extremo de la tubería. Ahora la bomba está completamente montado. </li><li> Coloque la bomba completamente montada en el tubo cónico estéril de 50 ml con solución salina para el cebado. El cebado permite para las bombas para absorber fluido para iniciar la administración de fármacos, así como llegado a la temperatura adecuada. El tiempo de cebado: 14 bombas días: 06.04 h, 28 bombas de día: 40 hr, bombas de 42 días: 60 h. Cuando haya terminado el montaje de las bombas, tapar los tubos cónicos y colocar en un lugar limpio37 ° C baño de agua hasta la cirugía. </li></ol> 2. Procedimiento Pre-quirúrgica <ol><li> Limpie todo abajo con etanol al 70% para esterilizar la zona y establecer paños estériles sobre la mesa y stereotax para crear un campo estéril. Es importante tener en cuenta el campo estéril durante toda la cirugía completa. Active la siguiente: esterilizador de cuentas, cojín de calefacción, luz, lectura digital y de oxígeno / Sistema de isoflurano (Figura 1). </li><li> Los siguientes elementos serán necesarios si hacerlo o bien una sola cirugía o un lote de cirugías, ya que habitualmente hacemos: 1 par de pinzas, 1 pinza hemostática curva, 1 par de tijeras pequeñas, 1 par de pequeñas tijeras romas curvas, 1 rata de corte del hueso , 1 pinza hemostática recta, 5-0 suturas de nylon, 1 tubos cónicos con etanol al 70%, 1 tubo cónico con etanol al 95%, 1 tubo cónico con yodo, 1 tubo cónico con peróxido de hidrógeno, el paquete de hisopos de algodón estériles, 1 botella de súper pegamento, 1 tubo de pomada antibiótica, 1 tubo de ojolubricante, y 1 máquina de afeitar eléctrica. </li><li> Coloque la punta de los dos pares de tijeras, pinzas hemostáticas y curvado en el esterilizador de cuentas durante 15 s. Retirar y colocar en etanol al 70%. Cuando se realiza más de una cirugía, vuelva a esterilizar las puntas de los instrumentos en entre los animales. </li><li> Girar el isoflurano al 4% y O 2 0,4 l / min y el flujo de gas directamente a la cámara. Contamos con nuestro sistema / oxígeno isoflurano calibrado al menos una vez al año para asegurarse de que estamos entregando la cantidad adecuada de anestesia. Coloque el ratón en la cámara y espere hasta que la respiración se ralentiza considerablemente. Retire el ratón y realice una pizca dedo del pie para asegurarse de que el ratón es completamente inconsciente. </li><li> Afeitar el pelo de la parte superior del hombro hasta en medio de los ojos. Si el ratón comienza a despertar, coloque el puntero del ratón hacia la cámara hasta que el ratón es completamente inconsciente de nuevo, confirmando con una pizca dedo del pie. Coloque el ratón anestesiado en el stereotax y empuje el cono de la nariz sobre la nariz.Sea amable como los dientes y los huesos son frágiles. </li><li> Dirigir el flujo de gas al stereotax mantener el ratón anestesiado. Es importante comprobar de vez en cuando para asegurarse de que el ratón es completamente inconsciente con una pizca dedo del pie durante toda la cirugía. Asegure la cabeza con los barrotes del oído. Nosotros preferimos nivelación bares del oído, aunque para apuntar el ventrículo lateral, un cráneo perfectamente nivel no es necesario debido al gran tamaño del ventrículo. </li><li> Baje el nivel de isoflurano al 2,0% para el mantenimiento. Frote pomada en cada ojo. Como se ve en el video, había un campo estéril sobre el ratón de modo que sólo la base del cuello y la cabeza están expuestos. A continuación, la desinfección de la zona quirúrgica limpiando la parte superior de la cabeza y el cuello en un movimiento circular comenzando en el centro de la zona de afeitado y en movimiento hacia el exterior primero con un hisopo de algodón humedecido en etanol al 95%, seguido de un bastoncillo de algodón humedecido en yodo. </li><li> Se recomienda utilizar una temperatura del sistema de calefacción de sonda rectal retroalimentación controlada que garantizala temperatura del ratón se mantiene en un establo 37 ° C. Si la temperatura del ratón disminuye durante la cirugía, la recuperación después de la cirugía puede llevar más tiempo y la hipotermia resultante puede conducir a la actividad aberrante de proteínas, incluyendo la hiperfosforilación de la proteína Tau asociada a microtúbulos 15. Después de configurar el sistema de calefacción, que ahora está listo para comenzar la cirugía. </li></ol> 3. Implantación de la bomba osmótica Alzet <ol><li> Antes de comenzar la cirugía, se puso un nuevo par de guantes estériles. Luego, utilizando fórceps y un pequeño par de tijeras, hacer una incisión en la piel de la base del cuello por encima de cráneo del animal a un máximo en entre los ojos </li><li> Tome las tijeras romas con la curva hacia arriba y deslice por debajo de la piel en la base de la parte posterior del cuello hacia la extremidad posterior izquierda. No debería haber ninguna resistencia. Si existe, retire las tijeras y vuelva a intentarlo. Esto forma el bolsillo subcutáneo de la bomba osmótica. </li><li> Wipe el cráneo limpio con hisopos de algodón estériles, seguido de un bastoncillo de algodón humedecido en peróxido de hidrógeno para mejorar la bregma. </li><li> Limpiar abajo de los tubos cónicos de 50 ml que contienen bombas para mantener la esterilidad de las bombas. Con cuidado, una bomba desde el tubo cónico utilizando la pinza hemostática curva, teniendo cuidado de que la bomba no toca los lados del tubo cónico. Mantenga la base de la bomba con unas pinzas y empuje el modulador de flujo en el resto de la forma con la pinza hemostática curva. </li><li> Mantenga la bomba donde el modulador de flujo y el tubo se reúnen con la pinza hemostática curva. Inserte la bomba bajo la piel en la base del cuello y empujarlo hacia la extremidad posterior izquierda hasta el tope sin resistencia. Tenga cuidado de no dejar que la sonda toque nada. </li><li> Con la pinza hemostática curva, tomar la cánula en la ranura de la parte superior, donde se encuentra con el pedestal. Mueva el controlador de la cánula en su posición y asegure en su lugar. </li><li> Coloca una gota de pegamento en la base de la cánula. Push la parte superior de la cánula en el conductor y la posición de modo que el tubo se apunta directamente hacia atrás. </li><li> Toque la punta del catéter a bregma y poner a cero las coordenadas en la pantalla digital. Elevar el catéter y mover 1,1 mm lateralmente a la derecha y 0,5 mm posterior (Figura 2B). Mantenga la piel de la manera con la pinza hemostática curva. </li><li> Conducir el catéter de metal delgado a través del cráneo hasta que la base cánula de plástico quede presionado firmemente contra la parte superior del cráneo. El catéter de metal se puede conducir directamente a través del cráneo en ratones debido al cráneo delgada relativa. Si el uso de ratas, perforar un agujero en el cráneo antes de bajar el catéter. </li><li> Tire cualquier piel que tiene pegamento en la basura del cráneo. Con el controlador cánula que sostiene la cánula / sonda en su lugar, esperar 1-2 minutos para que el pegamento se seque completamente. </li><li> Durante la práctica, para evaluar la colocación del catéter, se inyectan 20-40 l de 2,5% FastGreen colorante a través del tubo (Figura 2C). Espere 2-3 minutos, perfuse el ratón con 1X PBS 0,03% heparina, y retire el cerebro. Corte coronal en el sitio del catéter. Si el catéter se coloca en el ventrículo, el colorante se perfunde en todo el sistema ventricular del ratón (Figura 2D). </li><li> Sostenga el catéter en su lugar con la pinza hemostática curva mientras que aumentaba el conductor. Suelte lentamente la pinza para asegurarse de que la cánula está bien fijado al cráneo. </li><li> Con un hisopo de algodón, presione hacia abajo la parte superior de la cánula. Coloque a los Clippers ósea de rata en el bosque entre la parte superior y la base de la cánula. Clip de la parte superior de la cánula mientras sigue presionando hacia abajo con el bastoncillo de algodón. Trata de mantener el nivel de las podadoras para no separar la cánula del cráneo. Si la cánula no vengas arrastrado, de forma rápida re-pegamento y aplique presión con un hisopo de algodón durante 2 min. </li><li> Usando el hilo de sutura 5-0, hemostática regular, y las pinzas, suturas a lo largo de la apertura total, prestando una atención especial a la derecha sobre la cánula. Utilizamos un running sutura de colchonero horizontal (véase la figura 5) debido a la incisión más grande sobre el cráneo. </li><li> Aplique una pequeña cantidad de pomada antibiótica en la cabeza y el cuello. Afloje el oído bares y aflojar el cono de la nariz. Retire el ratón del stereotax y colóquelo en una almohadilla térmica para la recuperación. Monitorear los ratones estrechamente para la duración de la recuperación, típicamente van desde 10-30 minutos. Compruebe cada 2-3 minutos hasta que el ratón comienza a caminar alrededor y que se prepara. </li></ol> 4. Cuidados después de la operación <ol><li> Controle los ratones al día después de la cirugía para la primera semana. </li><li> Si un ratón parece estar en el dolor o la angustia, le recomendamos que proporciona el ratón con un mg / kg por inyección subcutánea de 5 Carprofen una vez cada 24 horas durante un máximo de 5 días, a fin de aliviar el dolor. </li><li> Si parece que hay una infección, aplicar generosamente pomada antibiótica a la zona a diario y consultar con un veterinario a cargo para asegurar que la herida se cura adecuadamente. </li><li> ReMove la sutura de nylon 5-0 7-10 días después de la cirugía para prevenir la irritación del hilo de sutura. </li></ol> 5. Cambio o eliminación de la bomba osmótica Alzet Después de la bomba se realiza la infusión activamente ASO, se puede ya sea cambiado o eliminado por completo. <ol><li> Siga el mismo procedimiento antes de la cirugía mencionado, con las siguientes modificaciones: 1) no se necesitan las tijeras curvas, hemostática curva, cortadores ósea de rata, ni la pantalla digital, y 2) en lugar de preparar la cabeza del ratón, afeitarse y desinfectar la parte posterior del ratón en el cruce de la bomba y la tubería. </li><li> Hacer una incisión de 1,5 cm en la parte posterior del ratón, perpendicular a la unión de la bomba / tubo, utilizando fórceps y tijeras. Saque con cuidado la bomba fuera de la incisión sin tirar / empujar la tubería ya que podría sacudir el catéter de manera significativa. </li><li> Para quitar la bomba, cortar el tubo aproximadamente 0,5 cm por encima del modulador de flujo y toque el pegamento al tubo to sellarlo. Espere 1-2 minutos para que el pegamento se seque. Colocar el tubo nuevamente dentro de la incisión y sutura cerrada. Frote ungüento antibiótico sobre la piel suturada y el lugar del ratón sobre una almohadilla de recuperación climatizada. </li><li> Para cambiar la bomba, recién han hecho bombas listo junto con un plato de 10 cm llena con etanol al 95%. Los catéteres no son necesarios con las nuevas bombas. </li><li> Agarra una nueva bomba con las pinzas. Sumerja sus dedos en el etanol, echa mano de la bomba, y desechar el flujo modulador. Luego, con cuidado y lentamente salga de la bomba vieja del modulador de flujo conectado al tubo y la cánula. Tan pronto como está apagado, deslice lentamente la nueva bomba en, asegurando que el modulador de flujo nunca toca la parte exterior del ratón. </li><li> Vuelva a introducir la nueva bomba a través de la incisión de nuevo en el paquete subcutánea y la sutura de la piel. Frote ungüento antibiótico sobre la herida y el lugar del ratón en la pista de la recuperación. </li><li> Al igual que con la implantación de la bomba, supervisar los ratones todos los días después de la cirugía para comprobar si pain / malestar e infecciones. Tratar con Carprofen y los antibióticos cuando se considere necesario. </li></ol> ICV BOLO 6. Procedimiento Pre-quirúrgica <ol><li> Siga el mismo procedimiento antes de la cirugía como en la sección 2 anterior con los siguientes cambios: 1) no se necesitan tijeras curvas, hemostática curva, o cuchillas de hueso de rata, 2) limpiar una jeringa Hamilton 10 l y la aguja con agua esterilizada y se carga con ASO, y 3) conectar la jeringa y la aguja en el aparato estereotáxico donde se encuentra el controlador cánula. </li></ol> 7. Inyección en bolo de ASO <ol><li> Con unas pinzas y un pequeño par de tijeras, hacer una incisión en la base del cuello hasta en medio de los ojos. </li><li> Limpiar el cráneo limpio con hisopos de algodón estériles, seguido de un bastoncillo de algodón humedecido en peróxido de hidrógeno para mejorar la bregma. </li><li> Mueva la jeringa / aguja en su lugar y fijarla. Asegúrese de que la parte biselada de la aguja se enfrenta posterior. Bajela aguja hasta que toque bregma. Poner a cero todas las coordenadas. Mover la aguja lateralmente hacia la derecha 1,0 mm anterior y 0,3 mm (Figura 3A). </li><li> Maneje lentamente la aguja a través del cráneo justo hasta que el agujero de la aguja quede al ras con la parte superior del cráneo. Una vez más, esto se puede hacer debido a la delgadez del cráneo del ratón. El cero de la coordenada z y bajar la aguja a -3,0 mm a una velocidad de 1 mm / seg (Figura 3B). Espere 2-3 minutos para el cerebro para sellar alrededor de la aguja. </li><li> Entregar el 10 l lleno de ASO a una velocidad de 1 l por seg. Espere 2-3 minutos. Utilizamos una tasa de infusión de l 1 de OSS en el ventrículo, aunque esta tasa puede variar entre los diferentes fármacos. Durante la práctica, comprobar la correcta colocación de la aguja mediante la entrega de 10 a 20 l de 2,5% FastGreen Dye. Perfundir el ratón con 1X PBS 0,03% de heparina pronto después de la infusión del tinte y hacer que las secciones coronales del cerebro para verificar que el tinte se encuentra en el sistema ventricular (Figura 3C). </li> &lt;li&gt; Mantenga una torunda de algodón contra el cráneo en la base de la aguja. Levante la aguja a una velocidad de 1 mm por seg. Tan pronto como la aguja está fuera del cráneo, rodar el hisopo de algodón sobre el agujero de la aguja y mantener durante 1 min para evitar la ASO se escape. </li><li> Suturar la piel se cerró, aplique ungüento antibiótico, y el lugar del ratón en la pista de la recuperación climatizada. Dependiendo de la concentración de ASO, puede tardar 20 minutos para un par de horas para recuperarse por completo. </li><li> Al igual que con la implantación de la bomba, supervisar los ratones todos los días después de la cirugía para revisar para el dolor / incomodidad y las infecciones. Tratar con Carprofen y los antibióticos cuando se considere necesario. </li></ol>

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Los autores reciben sus oligonucleótidos antisentido de Isis Pharmaceuticals.

La capacidad de entregar drogas a nivel mundial en el SNC como se muestra en el video es una técnica extremadamente poderosa que es fácil de aprender y utilizar. Con la práctica, una sola implantación de la bomba o un ICV bolo se puede completar en 10 minutos, lo que permite grandes cohortes de ratones para ser tratados al mismo tiempo. Esto es especialmente útil para los estudios con una lectura de comportamiento, como números más grandes para el comportamiento del ratón son críticos para ayudar a ver diferencias significativas. En base a nuestras experiencias a través de la entrega de OSS bombas y las inyecciones de bolo, hemos observado algunas ventajas y desventajas de cada método. Debe tenerse en cuenta que estas son las opiniones en nuestro laboratorio y pueden no ser cierto para todos los modelos de ratón y de rata. Encontramos una ventaja de la utilización de las bombas es su capacidad para ofrecer una alta cantidad de ASO desde la ASO se distribuye durante un período de tiempo mucho más largo. Esto por lo general equivale a la caída ya sostenida o después de empalme activaASO infusión, aunque esto puede no ser siempre el caso. Las bombas también permiten un marco de tiempo precisa de la entrega ASO (14 días, 28 días, o 42 días) y las bombas pueden ser cambiados una vez para permitir la infusión de ASO incluso más tiempo activo. Sin embargo, nos hemos dado cuenta de que el cambio de las bombas de más de una vez aumenta la variabilidad debida a la formación de bolsillos fibrosos alrededor de la bomba que impiden que la bomba de absorción de fluido correctamente. Una desventaja de las bombas es que algunos ratones no toleran la bomba, así como otros. Si la línea transgénica que está trabajando es más frágil, una bomba puede ser demasiado engorroso. Las bombas también tienen que ser eliminados después de la infusión final, sometiendo a los ratones a otra cirugía y la anestesia añadido. Si haciendo el trabajo comportamiento, es especialmente importante para eliminar la bomba y permitir que por lo menos 1-2 semanas de recuperación ya que la presencia de la bomba afectará a algunos comportamientos en los ratones. Con ICV inyecciones en bolo, una de las ventajas es el costo. Hay unainversión inicial para la compra de las jeringas y agujas, pero con el tiempo, las inyecciones de bolo son más rentables, ya que no hay bombas / tuberías / catéteres para comprar. En general, hay menos hasta-mantener las inyecciones de bolo ICV, debido a la falta de cánulas y bombas. También encontramos que bolo ICV se pueden utilizar para entregar OSS a los ratones más jóvenes frágiles y / o más. Una desventaja de la ICV bolo es que se trata de una sola inyección. No tanto ASO general se puede entregar a través de esta ruta, y si la duración de la acción de la ASO se utiliza es corto, los efectos desmontables / empalme también será de corta duración. Tanto las bombas osmóticas, así como los bolo ICV tienen la capacidad de entregar OSS que puede proteínas desmontables o alterar empalme de genes en todo el SNC de roedores, una técnica que tiene amplias aplicaciones en múltiples campos de la neurociencia relacionados. Sugerimos pilotando ambos métodos de entrega si no está seguro de que la vía de administración es el más adecuado para su sestudio ESPECÍFICOS.

Algunos medicamentos no son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica (BBB), lo que requiere directa del sistema nervioso central (SNC) de entrega. Para eludir la acreditación, los medicamentos pueden ser entregados directamente en el cerebro usando los métodos descritos. Aunque nuestro laboratorio y el documento se centran en este documento detallado sobre oligonucleótidos antisentido (ASO), a otros medicamentos, como pequeñas moléculas, anticuerpos, vectores de terapia génica, etc., También pueden ser entregados a través del mismo método exacto. Ciertas proteínas desempeñan un papel fundamental en la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas. Estas proteínas forman a menudo especies tóxicas y se acumulan en agregados, dando lugar a la eventual muerte neuronal y la enfermedad neurológica posterior 3-4. En un esfuerzo para reducir la velocidad o incluso detener la progresión de estas enfermedades, una opción terapéutica puede ser para apuntar directamente y disminuir la proteína causante. Sin embargo, estas proteínas se encuentran a menudo ubicua a través del SNC, lo que hace difícil e<html> ffectively dirigirlos en una escala global. Con el fin de orientar los genes en todo el SNC, administramos OSS ratón en líquido cefalorraquídeo (LCR) a través del ventrículo lateral a pasar por alto la acreditación. Este método específico se aprovecha del sistema ventricular del ratón que baña todo el cerebro y la médula espinal, lo que permite una amplia distribución de los OSS. Utilizamos OSS que son 18-20 mer moléculas de ARN-como que se unen directamente a la secuencia de ARNm diana y, en función de las modificaciones químicas ASO, ya sea A) recluta RNasa H para degradar el ARNm que conduce a la caída o B) cambiar de corte y empalme alternativo 1 , 2,16,17. Debe tenerse en cuenta que existen múltiples moléculas para derribar una proteína específica in vivo, incluyendo shRNA. Dado que estas moléculas no son el foco de este artículo, nos dirigimos al lector a revisar los artículos que mejores mecanismos desmontables detalle de la acción y las ventajas / desventajas de cada uno de 5-6. jove_content &quot;&gt; En el trabajo anterior, hemos utilizado OSS para apuntar la proteína superóxido dismutasa 1 (SOD1) en un modelo de rata transgénica de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) 7 (Figura 4). Las mutaciones en SOD1 producirse en aproximadamente el 2% de todos los ALS 8 casos, a pesar de que ha sido recientemente la hipótesis de que la SOD1 puede desempeñar un papel importante en la ELA esporádica, así 9-10. Mediante la disminución de los niveles totales de SOD1 en la rata transgénica ALS, la supervivencia después de la aparición, fue significativamente superior 7. Estos datos importantes fueron la primera para mostrar que un tratamiento de ASO en el SNC podría tener un profundo impacto positivo en un modelo de enfermedad neurológica. Desde entonces, OSS específicas para SOD1 humanos han entrado y completado con éxito un ensayo clínico de fase I humana con efectos secundarios mínimos (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , tal como se presenta en la 64 ª Academia 2012 Annual Americana de Neurología. Planes para mover los OSS avance a la fase II de los ensayos están en curso. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Mientras dirige SOD1 fue la primera demostración de la utilización de OSS para el tratamiento de una enfermedad neurológica, varios otros estudios ya se han realizado buscando en diferentes enfermedades y sus respectivos objetivos de proteínas. En 2010 y 2011, ASO ese cambio empalme de la supervivencia de proteína de las neuronas motoras 2 (SMN2) fueron utilizados en modelos de ratones transgénicos de la atrofia muscular espinal (SMA) y dio lugar a una mejora significativa en los fenotipos de la enfermedad 11,12. Estos OSS empalme se encuentran ahora en la fase I de ensayos clínicos en niños con AME (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Además, se ha demostrado recientemente que la administración transitoria de OSS dirigidos contra el gen de la huntingtina fueron capaces de rescatar drásticamente el modelo de ratón de Huntington, incluso después de que los niveles de proteína huntingtina volvieron a la línea base 13. En todos estos estudios, OSS fueron entregados al ventrículo lateral para disminuir los niveles totales de genes o alterar empalme de genes a travéstodo el SNC. Ambas bombas osmóticas y una sola inyección de bolo se puede utilizar para entregar OSS a la peste porcina clásica. Bombas permiten una lenta, la entrega continua, mientras que el bolo intracerebroventricular (ICV) es un, inyección rápida de una sola vez. Hemos utilizado ambos métodos con éxito, aunque no han informado de la comparación directa entre la bomba y el bolo en una sola línea transgénica. Usando OSS en el SNC es una poderosa manera de disminuir los niveles totales de proteínas y / o cambio de empalme de varias proteínas. Mientras que utilizamos ASOs exclusivamente como un tratamiento para los trastornos neurológicos, reconocemos que otros campos también pueden beneficiarse de esta técnica. Mientras que la proteína de interés se expresa en el sistema nervioso central y el objetivo final es lograr cambios a nivel del SNC en la expresión génica, utilizando OSS en las técnicas demostradas puede ser muy útil.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 14 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 28 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 42 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5 mm Catheters</td>
 <td>PlasticsOne</td>
 <td>3280PM/SPC</td>
 <td>Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vinyl Catheter Tubing</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>7760</td>
 <td>ID: 0.027", OD: 0.045"</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>2F7124</td>
 <td>NOT to be used in pumps or tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Injection, USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p60 Petri Dish (Sterilized)</td>
 <td>TRP</td>
 <td>93060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical Blades (Sterile)</td>
 <td>Butler Schein</td>
 <td>#007319</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Latex Surgical Gloves (Sterile)</td>
 <td>Micro-Touch</td>
 <td></td>
 <td>CatNo will depend on size of the gloves needed</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Towel Drape</td>
 <td>Dynarex</td>
 <td>4410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>.2um Syringe Filters</td>
 <td>PALL</td>
 <td>4192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe (Sterile)</td>
 <td>BD</td>
 <td>309625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Conical Tubes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PUMP &amp; BOLUS SURGERY PROTOCOLS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>13009-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Sharp Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14060-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Blunt Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14029-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bone Cutter</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>16104-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Straight Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l gas-tight with removable needles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needles</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7758-04</td>
 <td>26 gauge, Point Style: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-0 Nylon Suture Thread</td>
 <td>Covidient</td>
 <td>SN-871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Pads</td>
 <td>Select</td>
 <td>#521</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton Swabs (sterile)</td>
 <td>Puritan</td>
 <td>REF 806-WC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Loctite</td>
 <td></td>
 <td>Longneck Bottles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAUTION: FastGreen Dye</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F7252-5G</td>
 <td>Wear Eyeshields and Gloves when handling this product</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic Cream</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eye Ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electric Shaver</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Provadone Iodine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3% Hydogen Peroxide</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warming Pad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead Sterilizer</td>
 <td>SouthPointe Surgical</td>
 <td>GRM5-1450</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nose Cone</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 923-B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ear Bars</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 921</td>
 <td>This model is optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cannula Driver</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe Holder</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1972</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature Control System</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model TCAT-2LV</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oxygen/Isoflurane System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system

Debido a la imposibilidad de atravesar la barrera hematoencefálica, algunos medicamentos deben ser entregados directamente en el sistema nervioso central (SNC). Nuestro laboratorio se centra específicamente en oligonucleótidos antisentido (ASO), aunque las técnicas que se muestran en el vídeo aquí también se pueden usar para suministrar una gran cantidad de otros fármacos para el SNC. Los oligonucleótidos antisentido (ASO) tienen la capacidad de objetivos específicos de secuencia desmontables 1, así como los ratios isoforma cambio de genes específicos 2. Para lograr generalizada caída gen o empalme en el SNC de ratones, los OSS pueden ser entregados en el cerebro utilizando dos rutas distintas de la administración, los cuales se manifiestan en el video. Los primeros usos bombas osmóticas Alzet, conectados a un catéter que se implanta quirúrgicamente en el ventrículo lateral. Esto permite que los ASO a ser infundido continuamente en el SNC para un período de tiempo designado. El segundo implica una sola inyección en bolo de una high concentración de ASO en el ventrículo lateral derecho. Ambos métodos usan el sistema ventricular cerebral del ratón para entregar el ASO a todo el cerebro y la médula espinal, aunque dependiendo de las necesidades del estudio, un método puede preferirse sobre el otro.

Después de la infusión de la bomba o de un tiempo designado después de la inyección ICV en bolo (usamos rutinariamente cuatro semanas), es importante para poner a prueba la eficacia de los OSS. Le recomendamos que tome varias regiones del cerebro y la médula espinal para medir los niveles / isoformas del gen objetivo, tanto a nivel de ARNm utilizando PCR cuantitativa en tiempo real, así como el nivel de proteínas utilizando Western Blot o ELISA (Figura 4 para un ejemplo publicado ). Esto ayudará a determinar la eficacia ASO en las diferentes regiones del sistema nervioso central. Si la vida media de la proteína específica es largo, se aconseja esperar más tiempo después de la infusión de ASO con el fin de evaluar la caída máxima de proteína o empalme. También es importante para poner a prueba la distribución de oligo. Infusiones bomba resultado en la distribución a través de los hemisferios ipsilateral y contralateral, aunque una concentración de ASO superior se ve a menudo en las áreas más cercanas al sistema ventricular 16. ICV inyecciones en bolo dió un más unifodistribución rm del oligo por el SNC 16, aunque los efectos pueden no durar tanto tiempo. Dirigimos al lector a Southwell et al. Para ver una comparación directa de la bomba versus en bolo de distribución oligo 16. También te recomendamos probar varias dosis, así como la duración de la acción de los ASO ASO ya que cada uno se comporta ligeramente diferente en vivo. OSS suelen tener una duración relativamente larga de la acción, con la caída de destino o empalme que dura varios meses después de la entrega de ASO. Además, algunos OSS funcionarán mejor que otros y algunos genes objetivos serán más fáciles de caída que otros. Debido a esto, cuando la detección Asos para determinar el candidato líder, le recomendamos probar al menos 3-5 Asos en vivo con un n = 4-6 ratones adultos por ASO, como primer paso. Si está usando un medicamento que no sea OSS, también será importante para poner a prueba la concentración ideal de drogas, la duración de la acción de drogas, y las drogas CNSdistribución para ese compuesto específico. <img alt="Tabla 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> Tabla 1. Cirugía Coordenadas. Las coordenadas utilizado para golpear el ventrículo lateral derecho tanto en ratones y ratas, cuando la implantación de bombas osmóticas, así como la realización de un intracerebroventricular (ICV) en bolo. Ambas coordenadas, para bombas y bolo ICV, orientar el ventrículo lateral derecho. Utilizamos dos tipos diferentes debido a que estos son los que tenemos más experiencia y sabemos proporcionan una excelente distribución de la ASO. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> Figura 1. Configuración estereotáxica. (A) El equipo estereotáxico necesaria para la bomba Alzet y cirugías inyección en bolo. I) abalorios Esterilizarr. ii) Lectura Digital. iii) Base estereotáxica con los brazos en movimiento. iv) Temperatura Controlada Placa Térmica. v) El isoflurano / sistema de oxígeno. vi) Cámara isoflurano. (B) Cerca de la ojiva y bares del oído. (C) Dos accesorios necesarios. Izquierda: Jeringa / soporte de la aguja de ICV inyecciones en bolo. Derecha: Conductor Cánula de implantación de la bomba osmótica. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> Figura 2. Alzet implantación de la bomba osmótica. (A) de la bomba osmótica Alzet opciones para los ratones. . 14 bombas días (0,25 l / h), 28 bombas días (0,25 l / h), 42 bombas días (0,15 l / h) (B) Coordenadas para la implantación de la bomba de bregma: -0,5 mm Posterior, -1,1 mm Lateral ( Derecha), y -2,5 mm ventral (longitud del catéter). (C) Después de conducir el catéter a través de lacráneo y encolado de la cánula, colorante se vacía a través del catéter para evaluar la colocación apropiada del catéter en el ventrículo lateral. (D) del cerebro perfundido inmediatamente después de tinte se administra como en (C). Si catéter se colocó con éxito en el ventrículo, el medio de contraste se distribuye por todo el sistema ventricular del ratón. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> Figura 3. Inyección en bolo intracerebroventricular. (A) Coordenadas para la inyección en bolo desde el bregma: 0,3 mm anterior, -1,0 mm lateral (derecha), y -3,0 mm ventrales (B) Después de conducir la aguja a través del cráneo -3,0 mm ventral, tinte es empujado a través de la jeringa. para evaluar la colocación correcta de la aguja en el ventrículo más tarde. (C) cerebro perfundido poco después de tinte se administra como en (B). Si la aguja se colocó con éxito en el ventrículo, latinte se distribuye por todo el sistema ventricular del ratón. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> La Figura 4. Los oligonucleótidos antisentido reducir SOD1 rata in vivo (figura tomada directamente de Smith et al. 7). (AD) oligonucleótidos antisentido SOD1 SOD r146192 SOD o revueltos, se infundieron durante 28 días en el ventrículo lateral derecho de ratas normales a 100 mg / día. (A) endógenos SOD1 los niveles de ARNm de cerebro y la médula espinal tal como se mide mediante qRT-PCR. ( B) SOD1 y a-tubulina los niveles de proteína después de la infusión de ASO. (C y D) Los niveles de proteína para la tubulina y la SOD1 cuantificado para diferentes regiones del cerebro después de la infusión. (E) OSS contra la presenilina 1 o GSK-3 y beta; Se infundieron durante 2 semanas en el ventrículo lateral derecho de ratones no transgénicos y los niveles de mRNA evaluadas en la corteza frontal / temporal derecho. Reproducido con permiso de la Sociedad Americana para la Investigación Clínica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> Figura 5. Ejecución de sutura de colchonero horizontal. 5-0 hilo de sutura de nylon se teje dentro y fuera de la piel, a partir de trabajo anterior y posterior, concentrándose más sobre la cánula. Una vez que han alcanzado el punto más posterior, el hilo de sutura se lleva entonces una copia de seguridad y se pasa a través de la cánula una vez más. Esto asegura el cierre correcto de la herida e impide que la cánula / tubo de trabajo a través de la piel.

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Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Se describe un método para dirigir fármacos al sistema nervioso central ya sea por la implantación de un catéter o la realización de una inyección en bolo en el ventrículo lateral derecho en ratones. Nos centramos específicamente en la entrega de los oligonucleótidos antisentido. Esta técnica es fácilmente adaptable a otras drogas y para ratas.

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

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Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of Psychosis and Mania

SCIENTISTS IN ACTION

59.7K vistas.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Se describe un método para dirigir fármacos al sistema nervioso central ya sea por la implantación de un catéter o la realización de una inyección en bolo en el ventrículo lateral derecho en ratones. Nos centramos específicamente en la entrega de los oligonucleótidos antisentido. Esta técnica es fácilmente adaptable a otras drogas y para ratas.

Video: Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Medicamentos sistémicos y locales de entrega para el Tratamiento de Enfermedades del Sistema Nervioso Central en modelos de roedores

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Investigación

Neurociencias

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigma de Lesiones de investigar reparación del sistema nervioso central en<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

Una batería de pruebas computarizadas para el estudio de efectos farmacodinámicos en el sistema nervioso Central de los fármacos colinérgicos en fase temprana desarrollo de fármacos

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...