Este protocolo permite la entrega directa de terapias en el sistema nervioso central de la rata para evaluar la farmacocinética, farmacodinámica y eficacia de nuevas terapias en modelos de enfermedad de rata. Este procedimiento es seguro, eficaz y no requiere equipos costosos ni herramientas quirúrgicas. Demostrando el procedimiento serán Yi Chen y Yi Luo, científicos de investigación de mi laboratorio.
Para preparar las cánulas guía especiales, utilice una herramienta giratoria con una rueda cortada para cortar ambos extremos de una aguja de calibre 19 para obtener una cánula guía de aproximadamente un centímetro y medio a dos centímetros de largo. A continuación, utilice la rueda de rectificación de la herramienta giratoria para suavizar ambos extremos. Para preparar el conjunto de alambre del catéter, corte una pieza de ocho centímetros de largo de tubo PE10 de 011 pulgadas de diámetro para servir como el catéter intratecal para cada animal.
Utilice un rotulador resistente al etanol para hacer una marca a dos centímetros de un extremo de cada pieza de tubo. Para cada animal, inserte un alambre de estilo de 11 centímetros de largo cortado de alambre de acero inoxidable recubierto de politetrafluoroetileno en el lumen del catéter PE10 de ocho centímetros de largo. Para preparar el conjunto del catéter de entrega, corte una pieza de cinco a 10 centímetros 023 pulgadas de diámetro de catéter PE50 e inserte un adaptador de tubo de calibre 23 en un extremo del catéter.
A continuación, inserte una aguja de calibre 30 con un cubo cortado en una pieza de aproximadamente 0,5 centímetros de tubo PE10 y conecte el tubo PE10 al otro extremo del catéter. Para preparar un conjunto guía de cánula-aguja, coloque una cánula guía sobre el extremo de una aguja de calibre 23. Antes de comenzar la cirugía, coloque una almohadilla de calentamiento en la mesa de la cirugía y cubra la almohadilla con una sábana de cortina estéril.
Coloque un tubo de centrífuga cónica de 50 ml en la lámina y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo en la rata experimental anestesiada. Después de pesar al animal, afeitar la espalda de la cola a la columna torácica caudal y colocar la rata afeitada en la hoja estéril en la posición propensa. Coloque el tubo de 50 ml debajo del abdomen para flexionar la columna vertebral en la región lumbar y aplique pomada oftálmica a los ojos.
A continuación, inyectar por vía subcutánea un miligramo por kilogramo de buprenorfina de liberación sostenida y limpiar la piel expuesta con povidona secuencial y exfoliaciones de alcohol. Escurre al animal con una lámina transparente estéril fenestrada. Para la colocación del catéter y la inyección del compuesto, identifique los dos hoyos naturales entre los músculos por encima de la pelvis afeitada, y con una mano sosteniendo los hoyos, utilice la otra mano para presionar suavemente y sentir la columna vertebral desde la dirección caudal a rostral para localizar la primera sangría mayor entre las vértebras.
Después de identificar el espacio intervertebral entre las vértebras S1 y L6, muévase ligeramente rostralmente para identificar el espacio intervertebral entre las vértebras L5 y L6. Utilice un bisturí para hacer una incisión de no más de dos centímetros de largo en la piel y la cápsula muscular en este sitio a lo largo de la línea media de la dirección rostral a caudal para que el lugar de inyección esté en el centro de la incisión. Utilice tijeras de disección para diseccionar el tejido conectivo hasta que se pueda visualizar la capa muscular.
Haga una incisión de un centímetro en la cápsula muscular inmediatamente lateral al proceso espinal dorsal de la vértebra lumbar L6. Coloque el conjunto de aguja de la cánula guía cerca del aspecto anterior de la sexta vértebra lumbar y empuje el ensamblaje hacia el espacio intervertebral a lo largo del aspecto anterior de la sexta vértebra para que el extremo de la aguja penetre en el canal espinal. Utilice fórceps contundentes para localizar el proceso espinal dorsal de la vértebra lumbar L6 y luego empuje la aguja a lo largo del aspecto anterior de la sexta vértebra en el espacio invertebrata.
Empuje la cánula guía en su lugar a lo largo de la aguja, retire la aguja e inserte el conjunto del alambre del catéter en la cánula guía. Angling el catéter en un ángulo de aproximadamente 45 grados al canal espinal, forzar el extremo del catéter aproximadamente 0,3 centímetros en el canal. Retire el alambre de estilo aproximadamente 2,5 centímetros de la punta intratecal del catéter y avance el catéter hacia el canal espinal hasta que el marcado de dos centímetros en el catéter sea simplemente visible debajo del músculo.
Cuando el catéter esté en su lugar, retire la cánula guía para dejar el catéter y el alambre de estilo en su lugar. Avance el catéter en el canal espinal hasta que la marca de dos centímetros esté en la entrada del canal y retire completamente el cable de estilo. El líquido cefalorraquídeo se puede visualizar entrando en el catéter implantado.
A continuación, conecte el conjunto del catéter de entrega al extremo distal del catéter implantado a través del extremo de la aguja del calibre 30. A continuación, cargue 60 microlitros de solución salina estéril en una jeringa de 100 microlitros y cargue un bolo de 30 microlitros del compuesto de prueba en una segunda jeringa. Conecte la jeringa salina al extremo del adaptador de tubería del conjunto del catéter de entrega y enjuague 20 microlitros de solución salina estéril en el espacio intratecal.
Cuando se haya lavado toda la solución salina, sustituya la jeringa salina por la jeringa cargada en bolo e inyecte 30 microlitros del compuesto de ensayo en el espacio intratecal durante un período de 30 segundos. Cuando se haya entregado todo el bolo, sustituya la jeringa cargada de bolo por otra jeringa cargada con solución salina y enjuague el catéter con 40 microlitros adicionales de solución salina. Cuando se haya entregado el segundo volumen de solución salina, desprenda el conjunto del catéter de entrega del catéter implantado y utilice un par de fórceps de disección esterilizados con calor muy caliente para sujetar el tubo para cortar y sellar térmicamente el catéter implantado.
Utilice suturas monofilamento absorbibles para fijar el catéter termosellado al tejido conectivo y luego utilice suturas no absorbibles para cerrar la piel. Luego use gasas y solución salina para lavar cualquier sangre de la piel y coloque la rata en una incubadora calentada con monitoreo hasta la plena recomprensión. En este experimento representativo, se obtuvo un muy buen derribo en todas las regiones recolectadas después de un solo parto de oligonucleótido de bolo antisenfoto como se demostró.
Sin embargo, se midió cierto grado de variabilidad regional con la médula espinal que presenta el mayor porcentaje de derribo. Después de una inyección exitosa del oligonucleótido antisenso, u otras terapias, en un modelo adecuado, se puede evaluar la farmacocinética, farmacodinámica y eficacia de las terapias.
