Estamos muy agradecidos a la discusión, orientación y apoyo de los Dres. Michael Andreeff MD, PhD., Y Jared Burks PhD. Del MD Anderson Citometría de Flujo y Celular Imaging Fondo Core. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 CA109451 y para la FCM. ELS también es apoyado por el Departamento de Defensa del Ejército (BC083397).

Singenéico murino Trasplante de médula ósea (BMT), aprobados por los protocolos del IACUC institucional (Nota: El éxito de este protocolo requiere la utilización de cualquier tipo de célula marcada (s) como objetivo para el análisis multiespectral, y para facilitar el análisis de aguas abajo, se puede explotar cualquier genética o etiquetado celular estable. Sugerimos que cualquier célula, tejido, u órgano-a-ser puede ser aplicada a un modelo de trasplante y de que el trasplante puede contener tantas poblaciones marcadas únicas como la investigación considere útil. Además, múltiples marcado con sistemas celulares , tales como las que se encuentran en los ratones transgénicos que contiene de linaje múltiple restringido marcadas con fluorescencia poblaciones-pueden ser diseñados para eliminar las complicaciones de trasplante para el estudio de ciertos estados patológicos. <ol><li> Letalmente irradiar ratones receptores de BMT con una sola dosis de 9,5 Gy cuatro horas antes de la reconstitución con médula ósea del donante. (Receptores de BMT GFP deben ser de 6-10 semanas de edad). </li><li> Humedezca la piel de ratón con etanol al 70% antes de la saturación y de la peladura de nuevo para exponer las patas traseras con tijeras quirúrgicas estériles. Retire toda la pierna incluyendo la cresta ilíaca en la articulación sacroilíaca. Deseche el pie cortando justo por encima del tobillo y luego eliminar completamente todos los músculos, los ligamentos y el exceso de tejido de la médula. Ósea ras de la cresta de la tibia, peroné y ilíaca con una aguja 23 G usando 2% de FBS en PBS estéril (PBS-2). (Donantes RFP BMT deben ser sacrificados de acuerdo a las normas institucionales.) </li><li> Rebanada y aplastar suavemente el hueso restante en fragmentos utilizando un escalpelo y pinzas y luego colocar en 50 ml de tubo cónico con 3 mg / ml de colagenasa I durante 1 hora a 37 ° C a 300 rpm. </li><li> Rematar el tubo con PBS-2 y recoger el sobrenadante en un tubo fresco y se combinan con células encendidas. Centrifugar a 250 rpm durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en PBS-2 y filtrar con filtro de 40 nm de células. En este punto, las células se pueden etiquetar para FLUORESCENT de células activadas (FACS) si se quiere manipular poblaciones específicas para el BMT. </li><li> Resuspender 2 x 10 6 células por 100 l de PBS, por ratón. Utilizar 29 g de agujas para inyectar por vía sistémica en ratones receptores GFP irradiados por la cola o retro-orbital vena bisel de arriba abajo. Inyectar un ratón con 100 l de PBS solo como control de injerto. Utilice una lámpara de calor para dilatar los vasos antes de la inyección y utilizar un sistema de retención inyección en la vena de la cola después de la inyección. Tener una gasa estéril disponible para aplicar una ligera presión en la inyección posterior de la cola. </li><li> Tres semanas después de BMT, recogen retro-orbital de sangre y analizar por citometría de flujo para confirmar la presencia de células circulantes GFP y la ausencia de células RFP circulante. El ratón de control habrá muerto en este punto. </li></ol> 2. El injerto del tumor de acuerdo a las directrices del IACUC Institucionales <ol><li> Grow ED8 células tumorales murinos de ovario in vitro antes de la inyección in vivo (1 x 10 6 Cells por ratón). Día de la inyección, trypsinize células, se lavan con PBS y se resuspenden en PBS a 1 x 10 6 células por cada 100 l. </li><li> Inyectar células tumorales en la cavidad intaperitoneal del ratón, la aguja debe estar del lado biselado hacia arriba. Esterilizar la vista de inyección con etanol al 70%. Inyecte en la parte inferior izquierda o en el cuadrante inferior derecho del abdomen (craneal y ligeramente medial al conjunto inferior de pezones abdominales de ratón hembra), evitar golpear los órganos. Restringir ratón por el pescuezo y la celebración de la cola con el dedo meñique o el anillo del dedo. Los ratones pueden ser anestesiados con isoflurano para este procedimiento. </li><li> Sacrificar los ratones cuando los signos de prendimiento del tumor, como la leve hinchazón abdominal, son evidentes. Esto ocurrirá más de 4-12 semanas. </li><li> Tumores Impuestos Especiales de la cavidad IP. Los tumores de la cavidad se verá como nódulos blancos en y alrededor de la superficie de los órganos. Con un bisturí, extirpar los tumores y colocar en un tubo / frasco de formalina al 10% durante 24 horas de fijación. P histológicola reparación puede ser externalizadas a núcleo patología / histología si los reactivos y materiales no son fácilmente disponibles para la inclusión en parafina y preparación. Sección tejido en 5-8 micras rodajas en portaobjetos de vidrio para los procedimientos de tinción posteriores. </li></ol> 3. Multiparamétrico Inmunofluorescencia tinción <ol><li> Preparar diapositivas individuales de control de color para cada sonda fluorescente utilizada en el experimento. En este escenario, se utilizan cuatro colores. Por lo tanto, cuatro diapositivas para cada color individual, así como una diapositiva para el control del ruido de fondo y, finalmente, una diapositiva para la tinción combinación completa. (Diapositivas totales = 6) Todos los portaobjetos se procesan de lado a lado de una manera idéntica para reducir al mínimo la variación experimental. </li><li> Hornee las secciones de parafina a 56 º C durante 1 hora. </li><li> Lavar los portaobjetos 3x 10 min en xileno. </li><li> Lavar 2x 5 min de etanol 100%. </li><li> Lavar 1x 3 min 95% de etanol </li><li> Lavar 1x 2 min90% de etanol. </li><li> Lavar 1x 2 min70% de etanol. </li><li&gt; Lavado 1x 2 min en agua. Lentamente sumerja el dispositivo de tinción dentro y fuera de la 10x agua. </li><li> Durante la última serie de lavado, pre-ebullición tampón de citrato de sodio durante 2 min (microondas a máxima potencia). (Se puede sustituir con tampón tris-EDTA en función de los anticuerpos en el uso) </li><li> Hervir las diapositivas durante 20 minutos en tampón de citrato de sodio (microondas a potencia 10% o en una olla a presión). Si el buffer hierva, apague microondas y dejar reposar. </li><li> Eliminar de la fuente de calor y deje que los portaobjetos descansar durante 30 minutos en el tampón de citrato de sodio que se enfríe. </li><li> Enjuagar los portaobjetos en agua durante 5 min. </li><li> Marcos alrededor de las secciones tumorales con Pap Pen y puso el 2% de BSA / 1% de SFB ácido maleico tampón de bloqueo durante 1 hora. Prepare las diapositivas individualmente como para no dejar que se sequen durante este paso. </li><li> Preparar anticuerpos primarios en dilución óptima en tampón de bloqueo. (Si los anticuerpos en uso son todos de diferentes especies (o IgG cadena de variación ex: IgG1 IgG2a frente de misma especie) que se pueden usar en combinación durante comoperíodo de incubación de la ingle. Si las especies de anticuerpos se solapan, entonces las incubaciones deben llevarse a cabo secuencialmente para minimizar anticuerpo de reacción cruzada.) </li><li> En este punto, dejar dos portaobjetos con tampón de bloqueo solamente. Estos dos diapositivas servirán como control sin mancha y control tinción nuclear. Los otros controles de un solo color se incubaron con anticuerpos primarios individuales. Sólo la diapositiva análisis tendrá una combinación de anticuerpos primarios. </li><li> Incubar los portaobjetos con el anticuerpo primario en un cuadro de cámara de humedad en un agitador lento que gira a 4 ° durante la noche (~ 16-20 hr) (Nota: cuando se trabaja con 4 + fluoróforos, tinción secuencial o conjugación directa puede ser necesario para reducir al mínimo anticuerpo de reacción cruzada . Bajo estas circunstancias se repiten los pasos hasta que todos los anticuerpos 1.16 a 1.21 se aplican a los portaobjetos.) </li><li> Lavar los portaobjetos durante 10 minutos en PBST (2x) suavemente en un agitador </li><li> Mientras lavado se va, preparar Alexafluor 488, 594 y 647 anticuerpos secundarios para una dilución finalde 1:1.000 en tampón de bloqueo. (Asegúrese de que estos anticuerpos y diluciones se mantuvieron a 4 ° C y en la oscuridad en todo momento para preservar la fluorescencia a través de lotes y en el tiempo.) </li><li> En las diapositivas individuales de control de color, colocar diluciones individuales AlexaFluor que coincidan con las especies del anticuerpo primario utilizado. Todos los anticuerpos secundarios se colocarán en la diapositiva análisis. Los portaobjetos de control teñidas sin teñir y el nucleares permanecerán con tampón de bloqueo a lo largo de este paso. </li><li> Incubar en un cuadro de cámara de humedad (cubierto con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz) en un agitador de rotación lenta a TA durante 2 h. </li><li> Lavar los portaobjetos durante 5 minutos en PBST (2x) suavemente en la coctelera. Cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz. </li><li> Añadir DAPI (1:10.000) durante 1 min a la diapositiva-DAPI sólo y la corredera análisis. Cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Las otras diapositivas pueden quedar cubiertos en los recipientes de lavado. </li><li> Lavar dos incubaron DAPI-lalos portaobjetos en un recipiente separado para el primer lavado 5 min como para no contaminar los otros portaobjetos con tinción DAPI. Para el segundo lavado de 5 min, las diapositivas se pueden combinar en PBST (todos los lavados deberían llevarse a cabo en un agitador). Cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz. </li><li> Laminocultivos brevemente en agua antes de la cubierta-deslizamiento (1.5 grosor con los medios de montaje acuoso para preservar la fluorescencia) </li><li> Deje secar 3 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. </li><li> Selle los bordes de la hoja de la cubierta con el endurecedor de uñas. (No use esmalte de uñas como la acetona puede apagar la señal fluorescente). </li><li> Analizar diapositivas inmediatamente o almacenar a 4 ° C para su posterior análisis. </li></ol> 4. Las imágenes multiespectrales <ol><li> Recoge imágenes multiespectrales utilizando una cámara de Nuance EX (que contiene un filtro sintonizable de cristal líquido) en un X-63 microscopio vertical Olympus con el software Nuance para la recolección de datos. </li><li> Recoge imágenes, utilizando un objetivo de aceite para aumentar la resolución. </li><li> Iniciatival puesta a punto incluye establecer el rango espectral para cada fluoróforo en uso. <ol class="lalpha"><li> Para 4 color: <ol class="lroman"><li> DAPI: 420-480nm </li><li> AF488: 490-580nm </li><li> AF594: 590-640nm </li><li> AF647: 650-720nm </li></ol></li></ol></li><li> Tome una imagen inicial de la corredera de análisis para obtener los tiempos de exposición apropiados para cada uno de los rangos espectrales. </li><li> Crear &quot;biblioteca espectral&quot; que el software utilizará para identificar y separar la relación señal-ruido de los fluoróforos unos de otros y la señal de fondo. (Nota: cada fluorocromo debe tener su propio deslizamiento simple control de color con el fin de armar una biblioteca espectral con curvas de longitud de onda adecuadas para garantizar el correcto análisis del conjunto de datos Ejemplo: 3 fluoróforos = 4 portaobjetos de control; 5 fluoróforos = 6 portaobjetos de control.). <ol><li> Imagen primero el portaobjetos sin teñir. Esta diapositiva se designará dentro del bibliotecario espectraly como telón de fondo.&gt; </li><li> Imagen del solo DAPI deslice segundos. Esta diapositiva se utilizará para designar a los núcleos teñidos con DAPI con la herramienta &quot;draw&quot; y se guardará en la biblioteca espectral como DAPI.&gt; </li><li> Imagen de la AF488-sólo deslice tercero. Esta diapositiva se utilizará para designar las regiones teñidas con AF488 con la herramienta &quot;draw&quot; y se guardará en la biblioteca espectral AF488.&gt; </li><li> Imagen del AF594 de sólo deslizar cuarto. Esta diapositiva se utilizará para designar las regiones teñidas con AF594 con la herramienta &quot;draw&quot; y se guardará en la biblioteca espectral AF594.&gt; </li><li> Imagen del AF647 de sólo deslizar quinto. Esta diapositiva se utilizará para designar las regiones teñidas con AF647 con la herramienta &quot;draw&quot; y se guardará en la biblioteca espectral AF647.&gt; </li><li> Después de la recogida de cada componente espectral individuo,guardar la biblioteca espectral y el protocolo.&gt; </li></ol></li><li> Una vez que la biblioteca espectral es completa, encontrar las regiones de interés en la diapositiva análisis en el microscopio y recoger / guardar imágenes.&gt; </li></ol> 5. Análisis cuantitativo de imágenes multiespectrales <ol><li> Importar una variedad representativa de las imágenes de Nuance adquiridos utilizando InForm Software. </li><li> Abra la biblioteca espectral guardado como lo indique el programa de </li><li> Identificar las regiones de tejido de interés a analizar. (Por ejemplo, tejido tumoral en comparación con el tejido adiposo). </li><li> Identificar las células individuales en función de DAPI-manchas. El citoplasma se define automáticamente en función de la forma del núcleo. </li><li> Elige la intensidad de fluorescencia de lectura de la opción para cada parámetro de fluorescencia (por ejemplo, media, desviación estándar) </li><li> Lotes del adquirido imágenes y dejar que el proceso de software utilizando el algoritmo propuesto. </li><li> Cuando el procesamiento de imágenes ha terminado, fusionarlos archivos de resultados. </li><li> Abra los resultados en Excel (o cualquier otro paquete de software de análisis) y trazar dos intensidades fluorescentes de unos contra otros sobre ejes XY. Cada intensidad de fluorescencia se da por célula. Aparecerán las células dobles positivas en el cuadrante superior derecho. El usuario debe definir la intensidad de fluorescencia de línea base. </li></ol>

<ol>
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FCM, CMB, y ELS tienen conflictos y nada que revelar.

Aquí se describe la aplicación de imágenes multiespectrales que describimos como interrogación MIMicc-multiespectral de composiciones celulares multiplexados, para analizar los componentes derivados de la médula ósea del estroma de la microambiente del tumor, sin embargo esta metodología y el concepto se puede aplicar a descifrar otros elementos celulares que componen un complejo tejidos tales como los que se observan durante las reacciones de curación de heridas o durante un tejido regenerativo. En estos experi...

Comprender el desarrollo de tejidos y la reparación es importante para dilucidar los componentes celulares que participan en la cicatrización de heridas, 2,3 medicina regenerativa, la biología del desarrollo y la biología del tumor. En circunstancias de reparación, numerosos tipos de células se infiltran en el microambiente que rodea a la ayuda en la vascularización, la deposición de ECM, la proliferación y la reestructuración del tejido. Factores celulares y fenotipos se pueden identificar sobre la base de multiparamétrico, marcadores multiplexados que pueden identificar la localización, estado de diferenciación y la interacción entre los componentes celulares dentro de la microambiente investigado. Aquí se describe el desarrollo del tumor como un ejemplo prototípico de este modelo de trasplante multicolor multicelular seguido de imágenes multiespectrales y la metodología desmezcla espectral. La progresión tumoral es un proceso de varios pasos que se caracteriza por varias capacidades adquiridas que incluyen una mayor proliferación, unpropiedades ntiapoptotic, invasivos y angiogénicos. 4 Desarrollo de tumores se ve facilitada por las células no neoplásicas que son reclutados en el ambiente circundante para proporcionar factores de crecimiento, matrices estructurales, redes vasculares y la modulación inmune. 1,5,6 Este microhábitat consiste en células derivadas de tejidos locales, vecinos como adiposo y vasos sanguíneos y fuentes distantes, como la médula ósea células derivadas 1. El grado de incorporación de células no-neoplásica depende de la demanda del tumor, que a menudo corresponde con la etapa / grado del tumor. Para comprender el papel del microambiente del tumor de apoyo, hay que entender el origen y el potencial de diferenciación de las poblaciones de células no neoplásicas. Este protocolo ha sido diseñado para ayudar en la interpretación de la progresión del tumor a través de la visualización tanto de los componentes celulares derivadas de médula ósea, y el tejido local Derivcélulas ed. Utilizando ratones transgénicos fluorescentes reportero de genes que expresan, transplantamos GFP (proteína verde fluorescente) de la médula ósea en un RFP irradiados letalmente (proteína roja fluorescente) del ratón. Después de éxito del injerto de médula ósea, una línea celular de tumor singénico se inyecta ortotópicamente y se dejó que se injertan durante 4-8 semanas. El tumor resultante se escindió del ratón y se procesaron para inmunofluorescencia (IF) y la tinción para visualizar los componentes del estroma. Multiplexación IF marcadores es una técnica de uso común que implica una optimización significativa de 7-9, sin embargo el uso de una plataforma de imágenes / desmezcla multiespectral mejora el potencial de combinaciones de marcadores fluorescentes que poseen solapamiento espectral. El presente artículo presenta una técnica que llamamos interrogatorio MIMicc-multiespectral de composiciones celulares multiplexados para teñir y analizar hasta ocho marcadores dentro de una sección del tumor en una sola diapositiva con el fin de analizar los orígenes celulares, diferenciación celular stratos y las interacciones célula-célula de componentes dentro del microambiente del tumor. Este ejemplo simplificado tiene el potencial de ser ampliado a fin de analizar cinco, seis, o más marcadores que utilizan anticuerpos o expresión fluorescente promotor impulsado intracelular. Tabla 1 se enumeran las posibles combinaciones de tinción de anticuerpos fluorescentes con especies apropiadas tomadas en cuenta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Con el deseo de entender las contribuciones de múltiples elementos celulares para el desarrollo de un tejido complejo; tales como los numerosos tipos de células que participan en la regeneración de tejido, la formación del tumor, o la vasculogénesis, ideamos un modelo de trasplante celular multi-color de desarrollo de tumores en que las poblaciones de células se originan de diferentes colores reportero ratones de genes con fluorescencia y se trasplantan, injertados o se inyectan en y alrededor de un tumor en desarrollo. Estas células coloreadas se reclutaron y se incorporan en el estroma tumoral. Con el fin de evaluar cuantitativamente la médula ósea células del estroma derivadas de tumores, transplantamos que expresan GFP transgénica médula ósea entera en RFP letalmente irradiados expresando ratones aprobado por el IACUC. Tumores 0ovarian que fueron inyectados ortotópicamente en los ratones transplantados fueron extirpados 6-8 semanas después del injerto y se analizaron para marcador de médula ósea de origen (GFP), así como marcadores de anticuerpos para detectar tumor asociadoestroma utilizando técnicas de imagen multiespectral. A continuación, se adaptó una metodología que llamamos MIMicc-multiespectral Interrogación de composiciones celulares multiplexados, usando desmezcla multiespectral de fluoroprobes para evaluar cuantitativamente que la etiqueta de células vino de que poblaciones de partida (basados ​​en las etiquetas originales de gen reportero), y como nuestra capacidad para unmix 4, 5 , 6 o más espectros por aumentos de diapositivas, hemos añadido inmunohistoquímica adicional asociada con linajes celulares o diferenciación para aumentar la precisión. La utilización de software para detectar señales multiplexadas fluorescente co-localizados, las poblaciones del estroma tumoral pueden ser rastreados, enumerados y caracterizaron basándose en la tinción marcador. 1

Usando una técnica de imagen multiespectral para analizar tumores injertados en nuestro modelo de ratón transgénico BMT, somos capaces de discernir los componentes de tumores del estroma que son de origen de la médula ósea. El primer trasplante de médula ósea fue, confirmado tres semanas después del trasplante mediante citometría de flujo (Figura 1). Ortotópicamente inyecta tumores ováricos no marcados siguiente confirmaciones injerto BMT fueron extirpados y fijadas en formol 6 semanas despu?...

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Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Masas de tejido complejo, de órganos a los tumores, se componen de diversos elementos celulares. Hemos dilucidado la contribución de los fenotipos celulares dentro de un tejido utilizando ratones transgénicos fluorescentes de múltiples etiquetados en combinación con la tinción de inmunofluorescencia seguido de multiparamétrico desmezcla espectrales de descifrar origen celular, así como características de células basado en la expresión de proteínas.

Análisis Cuantitativo multiespectrales después de un trasplante de tejido fluorescente para la visualización de los Orígenes celulares, tipos y Interacciones

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

quantitative-multispectral-analysis-following-fluorescent-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K vistas.  MD Anderson Cancer Center.  Masas de tejido complejo, de órganos a los tumores, se componen de diversos elementos celulares. Hemos dilucidado la contribución de los fenotipos celulares dentro de un tejido utilizando ratones transgénicos fluorescentes de múltiples etiquetados en combinación con la tinción de inmunofluorescencia seguido de multiparamétrico desmezcla espectrales de descifrar origen celular, así como características de células basado en la expresión de proteínas. 

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Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Visualización y detección cuantitativa de cáncer de piel utilizando imágenes térmica dinámica

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Investigación

Medicina

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada<em&gt; In-situ</em&gt; La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de<em&gt; LacZ</em&gt;-Etiquetados células tumorales

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Murino heterotópico Corazón Trasplante Técnica

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique using the donor aorta to form the arterial anastomosis instead of the renal artery was developed and reported in 1993 by Kalina and Mottram 2 with a further advancement coming from the same laboratory in 1999 3. While one can become proficient in this model, a search of the literature reveals that many labs still experience a high proportion of graft loss due to arterial thrombosis. We describe here a technique that was devised in our laboratory that vastly reduces the arterial thrombus reported by others 4,5. This is achieved by forming a heel-and-toe cuff of the donor infra-renal aorta that facilitates a larger anastomosis and straighter blood flow into the kidney.

The goal of this manuscript is to describe the steps required to perform a kidney transplant in a mouse, paying particular attention to the details of the arterial anastomosis.

Riñón murino Trasplante Técnica

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

La interposición de la vena del modelo: un modelo adecuado para estudiar la permeabilidad del injerto de bypass

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine balloon denudation model, which is comparable with established vessel injury models in large animals. The aorta denudation model with balloon catheters mimics the clinical setting and leads to comparable pathobiological and physiological changes. Briefly, after performing a horizontal incision in the aorta abdominalis, a balloon catheter will be inserted into the vessel, inflated, and introduced retrogradely. Inflation of the balloon will lead to intima injury and overdistension of the vessel. After removing the catheter, the aortic incision will be closed with single stiches. The model shown in this article is reproducible, easy to perform, and can be established quickly and reliably. It is especially suitable for evaluating expensive experimental therapeutic agents, which can be applied in an economical fashion. By using different knockout-mouse strains, the impact of different genes on MH development can be assessed.

This article demonstrates a murine model to study the development of myointimal hyperplasia (MH) after aortic balloon injury.

Lesión basada en globo para inducir la hiperplasia Myointimal de la Aorta Abdominal de ratón

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...