Las imágenes intravitales nos permiten observar interacciones fisiológicas dentro del microambiente tumoral. Y mediante el uso de este método, los comportamientos dinámicos específicos que se observan se pueden compartimentar utilizando características locales del tejido. Este protocolo utiliza solo una señal ubicua sin etiquetas de fibras de colágeno o metabolitos autofluorescentes para segmentar la TME, minimizando así la cantidad de manipulaciones al ratón.
Este método es ampliamente aplicable a cualquier sistema intravital donde se requiera la comprensión de las interacciones dinámicas relativas a las estructuras de la matriz extracelular o las estructuras vasculares. Demostrando este procedimiento estarán Dave Inman, especialista senior en investigación, y Erica Hoffmann, una estudiante graduada del laboratorio. Comience a preparar un vidrio de cubierta de ventana de imágenes mamarias remojando un vidrio de cubierta redonda de 1.5 12 milímetros en etanol al 100% durante 10 minutos, luego seque el vidrio de la cubierta debajo de una lámpara de calor y asegure el vidrio al marco de la ventana de imágenes mamarias de metal con adhesivo de cianoacrilato.
Curar el adhesivo durante la noche. Al día siguiente, use un hisopo empapado de acetona para limpiar la ventana de imágenes mamarias ensamblada del exceso de adhesivo antes de sumergir la ventana de imágenes mamarias en etanol al 70% durante al menos 10 minutos para ayudar con la limpieza. Después del secado, guarde la ventana de imágenes mamarias limpias en una placa de Petri estéril.
Antes de comenzar la cirugía para la implantación de la ventana, autoclave las herramientas quirúrgicas y desinfecte las superficies con etanol al 70%. Prepare una mesa desinfectada para la cirugía con una manta caliente cubierta con un campo estéril. Coloque la manta de calentamiento de tal manera que la temperatura medida en la parte superior del campo estéril sea de 40 grados centígrados.
Use iluminación fría auxiliar y lupas para el procedimiento quirúrgico. Use EPP que consista en una bata de laboratorio estéril de un solo uso, mangas quirúrgicas, guantes, protección ocular y máscara facial. A continuación, retire el pelaje del ratón anestesiado en la cuarta glándula mamaria inguinal con una crema depilatoria y enjuague el sitio quirúrgico con una gasa empapada de agua estéril.
Luego prepare el sitio quirúrgico depilado para la cirugía desinfectando la superficie de la piel con tres exfoliantes alternados de Betadine y etanol. Cuando haya terminado, levante suavemente la piel sobre la glándula mamaria número cuatro con fórceps. Una vez que la piel se aleja de la pared del cuerpo, retire una sección de un milímetro de la capa dérmica en la punta de las pinzas con microscisoras quirúrgicas.
Sin cortar la glándula subyacente, cree una incisión de 10 milímetros y luego libere la glándula mamaria de la capa dérmica con el movimiento suave de los fórceps. Agregue PBS para cubrir la glándula expuesta. Use una sutura trenzada de seda 5-0 para crear una sutura de cuerda de bolso a lo largo de la periferia de la abertura, luego inserte un borde de la ventana de imágenes mamarias para que la capa dérmica se enganche en la muesca receptora de la ventana de imágenes mamarias.
Mientras estira el epitelio en el extremo opuesto de la ventana de imágenes mamarias, empuje la ventana de imágenes mamarias de metal en su lugar de modo que la capa dérmica enganche completamente la muesca receptora alrededor de toda la circunferencia de la ventana de imágenes mamarias. Luego aprieta la cuerda del bolso para dibujar la capa dérmica en la muesca y ata la capa para asegurar la ventana. Aplique un antibiótico tópico a la capa dérmica en la ventana de imágenes mamarias y monitoree continuamente al ratón.
Después de recuperar la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal, aloje la ventana de imágenes mamarias implantada por separado en la ropa de cama blanda con un iglú colocado en la jaula y permita que el ratón se recupere durante 48 horas antes de la toma de imágenes. Para las imágenes, use un sistema de aire forzado configurado a 30 grados centígrados. Use un calentador de objetivo adicional para evitar la deriva en el enfoque Z y permita que el sistema llegue al equilibrio a 30 grados Celsius durante al menos una hora antes de la toma de imágenes.
Luego configure una cámara de calentamiento en el escenario del microscopio. Después de confirmar la anestesia con el método de pellizco del dedo del pie, agregue un ungüento para los ojos al ratón. Para mantener una hidratación adecuada, inyecte 0,5 mililitros de PBS por vía subcutánea cada dos horas durante la duración de la sesión de imágenes.
Aplique un gel a base de agua en lugar de agua al objetivo y limpie el exterior del vidrio de la ventana de imágenes mamarias con un aplicador de algodón y un limpiador de vidrio antes de transferir el mouse a la etapa de microscopio precalentado. Después de colocar el ratón en el escenario del microscopio, presione el collar de la ventana de imágenes mamarias en un orificio de recepción de 14 milímetros en el inserto del escenario para estabilizar las imágenes y ajustar la manguera de isoflurano. Luego, enfoque el campo de imágenes utilizando los oculares del microscopio y la iluminación de Campo Brillante, observando la vasculatura con el flujo sanguíneo.
Compruebe la estabilidad del campo de visión. Si hay artefactos de movimiento respiratorio, aplique una compresión suave en la parte posterior de la glándula con un pequeño bloque de espuma y un trozo de cinta adhesiva similar a una cintura. Después de aplicar la compresión, verifique que el flujo sanguíneo se mantenga en todo el campo de visión.
Una vez que el ratón esté sedado y colocado de forma segura en la etapa de microscopio invertido, comience a localizar las regiones de interés. Usando una fuente de luz dirigida a la ventana de imágenes mamarias, use los oculares del microscopio para identificar áreas potenciales para la investigación. El enfoque debe estar en ver la vasculatura y el flujo sanguíneo.
Agregue y guarde las posiciones XY en el software. Cuando se establezcan los niveles de potencia adecuados, configure la pila Z y observe la aparición de abundantes fibras de colágeno a 20 a 50 micrómetros debajo de la superficie de vidrio de la ventana de imágenes mamarias. El colágeno se volverá menos prevalente a medida que el microscopio se seccione más profundamente en el tumor.
Los vacíos en la segunda generación armónica o SHG revelan la ubicación de las masas tumorales. Coloque la rebanada Z superior debajo de la capa de células solitarias con las primeras fibras de colágeno que aparecen de 50 a 100 micras. Coloque la rebanada Z inferior a 250 micrómetros donde las fibras se desvanecen y la mala señal domina.
A continuación, repita el procedimiento para todas las posiciones XY guardadas. Una vez que se haya establecido el rango de pila Z, aumente el tiempo de permanencia a ocho microsegundos y optimice la configuración de potencia y detector. Optimice los niveles de potencia necesarios para excitar el tejido para cada experimento y use potencias de hasta 90 milivatios a 750 nanómetros o 70 milivatios a 890 nanómetros en la abertura posterior del objetivo.
A continuación, comience con intervalos de 10 minutos entre los puntos de recolección para la mayoría de las películas de migración intravital y ajuste los intervalos de tiempo de acuerdo con los objetivos experimentales. Si se observan signos de fototoxicidad como sangrado celular o autofluorescencia en rápido aumento y fotoblanqueo excesivo, reduzca la potencia del láser o aumente los intervalos de lapso de tiempo según lo indiquen las condiciones. Para imágenes de fluorescencia de por vida o FLIM de NADPH, inicie el escaneo de vista previa y ajuste la potencia del láser hasta que la lectura del discriminador de fracción constante o CFD esté entre 10 a la quinta y 10 a la sexta.
Exceder CFD más allá de 10 al sexto resultado en acumulación de fotones y malos resultados generales. Una vez establecido el nivel de potencia, establezca el tiempo de integración entre 90 y 120 segundos e inicie la colección FLIM para adquirir fotones del campo de visión durante el tiempo asignado. Un campo de visión típico dentro de un tumor mamario sin etiqueta demostró abundantes fibras de colágeno cerca de la ventana y una disminución en la abundancia más profundamente en el tumor.
El uso de fluorescencia de por vida o NADPH ayudó en la identificación de la vasculatura. Algunas regiones oscuras en las imágenes eran pliegues tumorales o el glúteo de los lóbulos tumorales adyacentes. Para identificar la vasculatura, se validó una imagen compuesta utilizando NDPH FLIM comparando las proyecciones de máxima intensidad de la pila intravital antes y después de la inyección de dextrano fluorescente en la vena de la cola.
El análisis representativo muestra la cuantificación de cuatro ratones y los campos de visión. Para delinear los límites de las masas tumorales libres de etiquetas, se utilizó la autofluorescencia NADPH. Las imágenes informaron las firmas metabólicas de las células y la ubicación de los vasos sanguíneos.
La autofluorescencia afD también identificó los macrófagos. Con el esquema de segmentación, el tumor libre de etiquetas se segmentó en compartimentos para el nido tumoral, el estroma y la vasculatura utilizando solo autofluorescencia SHG y NADPH. Además, las fibras de estroma y colágeno también se pueden clasificar en regiones locales de las fibras alineadas.
Lo más importante que debe recordar para este protocolo es asegurarse de que el mouse esté correctamente sedado y restringido para que el campo de visión permanezca estable para la obtención de imágenes.
