El siguiente protocolo describe el desarrollo de redes de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en placas MEA multipozo para electroporar las membranas celulares para mediciones potenciales de acción. Los parámetros potenciales de acción se pueden utilizar para generar esas curvas de respuesta para probar compuestos para electrofisiología. La codificación MEA multipozo y el enchapado de celdas son los pasos más desafiantes que necesitan atención especial.
Uno debe realizar estos pasos diligente y rápidamente para evitar que las gotas se propaguen y se sequen. Con la práctica, esto se puede superar fácilmente. Desarrollamos una interfaz gráfica de usuario personalizada para segmentación única, control de calidad y extracción de parámetros.
Nuestro sólido flujo de trabajo de MATLAB se implementó para reducir rápidamente grandes volúmenes de datos experimentales sin procesar en una agrupación imparcial de formas de onda potenciales de acción. Comience por descongelar cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Suspenda suavemente las células utilizando una pipeta de transferencia para disociar los grumos de la célula.
A continuación, dispensar cuidadosamente dos mililitros de suspensión celular en cada pozo de una placa de seis pozos recubierta de sustrato y colocar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono. Las células deben adherirse a los tracto de gel por 24 horas y latir espontáneamente a las 48 horas después del enchapado. Dos días antes del chapado añadir 0,5 mililitro de medio de cultivo de cardiomiocitos iPSC humanos a cada pozo de una matriz multi-electrodo de 24 pocillos, o placa MEA, y realizar una grabación de línea de base para verificar la relación señal-ruido como un control de calidad de los MEA.
Luego, aspirar los medios, enjuagar los pozos con agua estéril y esterilizar bajo una luz UV en una campana de flujo laminar durante la noche. Al día siguiente, añadir 0,1 mililitros de FBS a cada pozo para el tratamiento hidrófilo de superficies MEA e incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, aspirar el FBS, y enjuagar cada pozo dos veces con 0,5 mililitros de agua estéril.
Deje que la placa se seque en la campana de flujo laminar durante la noche. Al día siguiente, pipetear cinco microlitros de dilución de fibronectina de trabajo y dispensar cuidadosamente la gota en el centro de cada pozo para cubrir los 12 electrodos. Coloque inmediatamente la placa sobre una superficie elevada dentro de una cámara humidificadora que contenga suficiente agua estéril para cubrir toda la superficie del plato.
Coloque la cámara con la placa en la incubadora de cultivo celular durante tres horas y luego proceda con el revestimiento celular. Cuando esté listo para planchar los cardiomiocitos, ajuste la densidad celular a 6.000 células por microlitro diluyéndolas en el medio de descongelación de cardiomiocitos iPSC humanos. Utilice movimientos suaves para evitar que las células se sedimenten.
Lleve la placa MEA a la campana de flujo laminar y retire cuidadosamente la gota de fibronectina con una pipeta P10 sin tocar los electrodos. Dispensar inmediatamente una gota de célula de cinco microlitros al centro del pozo asegurándose de cubrir los 12 electrodos. Haga esto bien a la vez para evitar que la fibronectina se seque.
Cuando termine el chapado, vuelva a colocar la placa MEA en la cámara humidificadora cubierta libremente y devuélvala a la incubadora de cultivo celular durante tres horas. Después de la incubación, utilice una pipeta P200 para agregar cuidadosamente 200 microlitros de cardiomiocitos iPSC humanos descongelando medio a cada pozo sin molestar a las células. Vuelva a colocar la placa MEA en la incubadora de cultivo celular y reemplace el medio de cultivo 24 horas después del enchapado.
Cuando esté listo para adquirir señal de los cardiomiocitos, inicie el software de adquisición e inserte la placa MEA de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Haga clic en el botón Explorar para visualizar la señal en todos los pozos y verificar la calidad de la señal en condiciones de estado estable. Tome notas sobre electrodos con potencial de campo, o FP, señales en el rango de milivoltios.
A continuación, haga clic en el mismo botón para detener la exploración. No se ha registrado ningún dato hasta este punto. Haga clic en el botón Ir para iniciar la grabación.
Los electrodos de cada pozo mostrarán señales FP en la ventana de datos sin procesar. Después de 30 segundos de grabación, haga clic en el botón Estimular y permita que la electroporación tenga lugar en los sitios seleccionados durante 30 segundos. A continuación, haga clic en el mismo botón para detener la simulación y continuar la grabación durante 60 segundos.
Utilice el software personalizado basado en MATLAB para segmentar y extraer varios parámetros de datos potenciales de desarrollo y potenciales de acción. En primer lugar, ejecute el código de análisis de forma de onda y haga clic en Archivo y seleccione Process.h5. Busque y seleccione el mwd creado anteriormente.
h5. Haga clic en el botón Guardar directorio para cambiar la ubicación de almacenamiento de los archivos de salida. A continuación, cree una cola de procesamiento de señal seleccionando el electrodo y las combinaciones de pozos de interés y, a continuación, haciendo clic en el botón Cola.
Repita este paso para agregar más combinaciones de electrodos y pozos a la cola. Si las células fueron tratadas con medicamentos, la cola se puede editar haciendo clic directamente en Med Name, Med Concentration. Una vez finalizada la cola, haga clic en el botón Inicializar formas de onda, que iniciará el procesamiento preliminar donde se identifican y extraen las señales para la segmentación.
Cuando termine el procesamiento, haga clic en el botón Acercar y seleccione el área de interés potencial de acción o AP. Haga clic en el botón Mantener y revise los paneles. Los picos y los valles se detectan para cada forma de onda, y los AP normalizados se superponen.
Cuando haya terminado, haga clic en el botón Mantener para pasar a la siguiente traza en la cola y repita el proceso para el resto del electrodo y las señales de combinación de pozos. La viabilidad y la densidad de chapado de los cardiomiocitos post-descongelados es fundamental para el cultivo multipocillo MEA. El revestimiento adecuado da como resultado un cultivo monocapa saludable con golpes espontáneos a las 48 horas, mientras que la mala viabilidad celular resulta en cultivos con un alto porcentaje de poblaciones no miocitos.
La dispersión de las gotas celulares afecta la densidad del cultivo e incluso puede conducir a la muerte celular, por lo que la colocación precisa de las células es importante. Las células cultivadas en los MEA se someten a un control de calidad de la actividad eléctrica 48 horas después del enchapado. Si el 50% de los electrodos dentro de una red y el 70% de las redes totales no producen señales FP, entonces el cultivo es subóptimo.
Las grabaciones AP mediadas por electroporación se pueden obtener varias veces 48 horas después del revestimiento MEA. Múltiples electroporaciones del mismo sitio celular en cero, 24, 48, 72, y 96 horas no tienen ningún efecto significativo en la forma AP con el tiempo. Además, no se ha observado correlación entre las amplitudes AP de FP y post electroporación del mismo sitio celular.
Una ventaja significativa de este método es que la placa MEA multipocillos se puede reutilizar varias veces. Para demostrar la confiabilidad de esta matriz, 3, 815 formas de onda AP se extraen de tres lotes de restauración, y los datos de duración AP se extraen para examinar la repetibilidad de los resultados. Cuando es de interés, es posible realizar ensayos adicionales, como la expresión génica, mediciones transitorias de calcio y abrazadera de parche para investigar el comportamiento de corrientes iónicas específicas.
Esta técnica allana el camino para que los investigadores mejoren la maduración electrofisiológica, así como para detectar efectos de dosis crónicas en cardiomiocitos.
