This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director&#8217;s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

NOTA: La información de proveedor para todos los reactivos utilizados en este protocolo ha sido incluido en la Tabla 1 y Lista de Materiales. Todas las soluciones y equipos que entren en contacto con las células deben ser estériles, y una técnica aséptica se deben utilizar en consecuencia. Realice todas las incubaciones de cultivo en un humidificado 37 ° C, 5% de CO2 menos que se especifique lo contrario. En este protocolo, todas las diferenciaciones se realizaron en placas de 6 pocillos, en el que los hiPSCs se siembran. Después de la diferenciación y la purificación, las células se pueden disociar y se volvieron a sembrar para su uso aguas abajo. 1. Preparación Medio <ol><li> Para el medio E8, hacer una solución madre para cada componente del medio (NaHCO 3, ácido L-ascórbico 2-fosfato, selenito de sodio, transferrina, insulina, FGF2, TGFB1) y almacenar las soluciones a -20 ° C. Añadir la cantidad apropiada de soluciones madre a la botella de DMEM / F12 y filtrar para esterilizar. El concentr soluciónación y configuración de la reacción para los componentes de las poblaciones y el medio E8 se pueden encontrar en la Tabla 1. </li><li> Para la solución de la matriz extracelular, descongelar la matriz de la membrana basal (comúnmente suministrado en 10 mg / ml) a 4 ° CO / N. Matrigel se utiliza comúnmente para el cultivo de células madre pluripotentes porque las células madre pluripotentes humanos pueden adherirse bien a este material utilizando la alfa-6-beta-1 integrina 9. Una vez descongelado, hacen 2,25 mg (250 l) alícuotas en el hielo utilizando hielo puntas de pipeta y tubos frío y almacenar las alícuotas a -80 ° C. <ol><li> Cuando un revestimiento previo de placas con CEEM, descongelar y alícuota de la solución de la matriz extracelular (CEEM) en hielo. Mezclar el CEEM y medio DMEM / F12 enfriado en hielo en una proporción de 1: 200 en hielo. Mantener en lugar fresco para evitar la solidificación prematura CEEM. </li></ol></li><li> Para el RPMI / B27 sin medio de la insulina, añadir 10 ml de B27 Minus insulina en 500 ml de medio RPMI. </li><li> Para el RPMI / B27 (con insulina) medio, agregue 10 ml de suplemento B27 (con insulin) y 5 ml de antibiótico Pen-strep en 500 ml de medio RPMI. </li><li> Para el medio bajo de glucosa, añadir 10 ml de suplemento B27 y 5 ml de antibiótico Pen-estreptocócica en 500 ml de medio RPMI libres de glucosa. </li><li> Para el medio / criopreservación de congelación, la mezcla de suero fetal bovino, junto con dimetilsulfóxido (DMSO) a una proporción de 9: 1. El medio de congelación se puede almacenar hasta 1 mes a 4 ° C. NOTA: Todos los medios de comunicación deben ser filtrados y se almacenan en 4 ° C y utilizarse dentro de 2 semanas a menos que se especifique lo contrario. Todos los volúmenes de reactivo / solución utilizados a continuación están destinadas a un solo pozo en una placa de 6 pocillos, a menos que se especifique lo contrario. </li></ol> 2. Pre-recubrimiento de placas de 6 pocillos con CEEM <ol><li> Hacer CEEM mediante la mezcla de matriz de membrana basal (por ejemplo, Matrigel) con medio DMEM / F12 enfriado en hielo en una proporción de 1: 200, a continuación, aplicar 2 ml de recién hecho CEEM a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Cada pocillo en una placa de 6 pocillos recibirán aproximadamente 90 mg CEEM. </li><li> Incubar la ECMPlacas S recubierto durante 1 hora a 37 ° C. Inmediatamente antes de placas células, aspirado DMEM solución / F12 de cada pocillo. Las placas estarán listos para recibir las células. </li></ol> 3. descongelación La hiPSCs congelados NOTA: Seguir de cerca este procedimiento, ya que puede conducir a cultivo óptimo y diferenciación aguas abajo de hiPSCs en hiPSC-CM siguiendo el ciclo de congelación / descongelación. <ol><li> Descongelar un vial de hiPSCs para cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Preparar un tubo cónico de 15 ml con 9 ml de medio de E8 fría con inhibidor de roca (10 mM) para cada vial. Inhibidor ROCA mejora la supervivencia después de la crioconservación hiPSCs 10. Conservar los viales en 37 ° C baño de agua para descongelar las células hasta que un cristal de hielo diámetro aproximadamente 5 mm se deja. </li><li> Pulverizar el exterior de los viales con etanol al 70%. Limpie los viales con un pañuelo de papel antes de moverlos a la campana laminar estéril. </li><li> Transferencia de las células en el tubo cónico preparado. Enjuague tque el vial una vez con 500 l de medio de E8 y transferir el medio que contiene las células descongeladas a la misma tubo cónico. Centrifugar a TA durante 4 min a 200 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante después de la centrifugación y resuspender suavemente el sedimento celular con 2 ml de medio E8 con inhibidor de roca (10 mM). Transferir las células resuspendidas a un pocillo de una placa de 6 pocillos pre-recubierto con CEEM. </li><li> Sustituya el medio con medio E8 sin inhibidor ROCA después de 24 horas de cultivo. Las células deben se han adherido a esta hora. </li></ol> 4. pases de hiPSCs <ol><li> Típicamente, hiPSCs paso después de alcanzar el 75% y el 80% de confluencia en una placa de 6 pocillos. Aspirar el medio de cultivo. Lavarse rápidamente pozos con 1 ml de estéril, RT PBS. Aspirar PBS. <ol><li> Añadir 500 l de EDTA 0,5 mM o solución desprendimiento celular 1x (por ejemplo, Accutase) e incubar durante 1-7 minutos a temperatura ambiente. Momento adecuado para la incubación EDTA varía con la línea hiPSC. Esperar a ver visible de curling or engrosamiento de colonias alrededor de los bordes, ya que esto indicará que la solución de EDTA o desprendimiento de las células está listo para ser eliminado. </li></ol></li><li> Aspirar el EDTA o la solución de desprendimiento de las células. Añadir 1 ml de medio suplementado con inhibidor de E8 Rock 10 mM. Plegar colonias hiPSC en el pozo pipeteando repetidamente arriba y hacia abajo y la pulverización de colonias con una pipeta P1000. Las colonias deben romperse en 5-10 grupos de células después de la finalización. </li><li> Transferir las colonias que están suspendidas en 1 ml de medio E8 con inhibidor ROCA en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Interrumpir los grandes grupos de células en pequeños grupos en el medio E8. Añadir un volumen apropiado de los medios de comunicación E8 con el inhibidor a la suspensión celular para diluir las células. El volumen de los medios para agregar para la dilución depende de la densidad celular y el número de pozos que se sembró. Lo ideal sería que una sola, el 80% así confluente de hiPSCs debe diluirse 01:12. <ol><li> Añadir 11 ml de medio E8 con inhibidor de roca a la 1 ml de ce existentesll en solución antes mencionado tubo cónico de 15 ml para obtener una dilución 01:12. </li></ol></li><li> Triturar Además los grupos de células en fragmentos de células pequeñas (alrededor de 50 a 200 células en cada fragmento es el mejor). Evitar el exceso de trituración ya que esto reduce la supervivencia celular. </li><li> Aspirar CEEM de las placas pre-recubierto y añadir 2 ml de células resuspendidas en cada pocillo. Aproximadamente 100.000 células por pocillo de una placa de 6 pocillos es ideal. Objetivo para dispensar las células uniformemente alrededor del pozo para evitar la agrupación de células en el centro del pozo. </li><li> Después de 24 horas de cultivo, sustituir el medio con medio E8 sin inhibidor ROCA. Cambiar el medio de cultivo cada 24 horas hasta que las células se convierten en 80% de confluencia. Entonces, las células están listas para pasaje de nuevo. Tarda generalmente 3-6 días entre pasajes para llegar a 80% de confluencia. </li></ol> 5. hiPSCs Congelación NOTA: Estrechamente siga este procedimiento, ya que puede conducir a cultivo óptimo y diferenciación aguas abajo de la caderaSC en hiPSC-CM siguiendo el ciclo de congelación / descongelación. <ol><li> Etiquetar los tubos criogénicos con el nombre de la línea de células, tipo de célula, número de pases, y la fecha de congelación. Como pauta general, utilizar un vial para cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Preparar un tubo cónico de 15 ml llena con 9 ml de medio de E8 con inhibidor de roca (10 mM). Preparar medio de congelación con 90% de FBS y 10% de DMSO, y mantener el medio a 4 ° C hasta su utilización. </li><li> Aspirar los medios de cultivo, añadir 500 l de EDTA 0,5 mM o solución desprendimiento celular 1x y se incuba durante 2-7 minutos a temperatura ambiente. La duración de la exposición solución de EDTA o desprendimiento de las células varía de línea celular a línea celular. </li><li> Aspirar EDTA o solución desprendimiento de las células. Añadir 1 ml de medio de E8. </li><li> Plegar colonias hiPSC en el pozo pipeteando arriba y abajo y rociar colonias con una pipeta P1000. Las colonias no deben romperse en partes más pequeñas de 100 grupos de células. Transferir las células suspendidas en el tubo cónico preparado que contiene E8. Centrifugar a RT durante 4 min a 200 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante y añadir 500 l de medio de congelación frío al sedimento. Resuspender el precipitado pipeteando una a dos veces. La supervivencia celular se mejora manteniendo las células en grandes grupos. </li><li> Transferencia de las células resuspendidas en un tubo criogénico etiquetado. Mover rápidamente los viales en un recipiente que contiene isopropanol congelación, lo que permitirá un enfriamiento gradual. Mantener el envase con las células a -80 ° C durante 24 h, a continuación, transferir las células a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 6. cardíaca Diferenciación de IPSC Humano NOTA: Todos los medios deben estar al menos a temperatura ambiente cuando se añade. <ol><li> Después de la disociación con solución de EDTA o desprendimiento celular 1x, semilla de aproximadamente 100.000 iPSCs humanos en CEEM recubiertas placas de cultivo de 6 pocillos para la diferenciación (mismos pasos que los procedimientos de pases de células). Cuando las células alcanzan 85% de confluencia, cambiar el medio a RPMI / B27 sin medio de la insulina con 6mM CHIR99021 inhibidor de GSK3-beta (CHIR) y mantener durante 48 horas. </li><li> Después de 48 horas, sustituya el medio de cultivo que contiene CHIR con RPMI / B27 sin medio de la insulina y la dejara en paz durante 24 horas (hasta el día 3). </li><li> En el día 3, cambiar el medio a RPMI / B27 sin insulina con 5 mM Wnt inhibidor IWR1 y mantener durante 48 horas (hasta el día 5). NOTA: Wnt inhibición también se puede intentar el uso de otros compuestos de moléculas pequeñas, como se describe en estudios anteriores 11. IWR1 fue seleccionado sobre otros inhibidores de Wnt de molécula pequeña debido a la mayor rango en el que se ha demostrado ser eficaz en la inhibición de la señalización de Wnt 11. </li><li> En el día 5, cambiar el medio de nuevo a RPMI / B27 sin medio de la insulina y se deja durante 48 horas (hasta el día 7). </li><li> En el día 7, sustituir el medio con medio RPMI / B27 (con insulina) y reemplazar el medio cada 3 días a partir de entonces con el mismo medio. Latido espontáneo de los cardiomiocitos debe primero ser visibles en aproximadamente el día 8 a día10. </li></ol> 7. Purificación de cardiomiocitos humanos a través de inanición glucosa <ol><li> En el día 10 post-diferenciación, cambiar el medio en cada pocillo de la placa de 6 pocillos a 2 ml de medio de bajo nivel de glucosa y mantener las células en este medio durante 3 días (hasta el día 13). </li><li> En el día 13, las células volver a medio RPMI / B27 (con insulina). </li><li> Opcionalmente, replate cardiomiocitos antes de la segunda ronda de la inanición glucosa para ayudar a aflojar los no cardiomiocitos de la placa de cultivo, lo que facilita la disociación de los no cardiomiocitos durante la inanición glucosa. <ol><li> Al día 13, el medio aspirado, lavar una vez con PBS, y disociar las células en células individuales usando 500 l de enzima disociación celular durante 5 min a 37 ° C. Específicamente, después de 5 min de tratamiento con enzimas, utilizar una pipeta de 1000 l para disociar manualmente los cardiomiocitos de la placa de 6 pocillos tirando repetidamente la enzima disociación celular y pulverización contra el cardiomyomonocapa cyte. Hasta 30 repeticiones de pipeteo puede ser necesaria para disociar los cardiomiocitos en células individuales. </li><li> Después las células se disocian y están en forma de una sola célula, recoger todas las células en un tubo cónico de 15 ml llena con 5 ml de medio RPMI / B27 con la insulina para diluir la enzima disociación celular y centrifugar durante 4 min a 200 x g. Aspirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender las células con el medio 2 ml RPMI / B27 y placa sobre una nueva placa de 6 pocillos recubiertos de CEEM. Típicamente, el aumento de la confluencia de los cardiomiocitos ayuda con la supervivencia celular durante la resiembra. Trate de replate 2.000.000 células por plato nuevo de 6 pocillos para la supervivencia óptima durante la resiembra. </li></ol></li><li> En el día 14, cambiar el medio de nuevo a 2 ml de medio-bajo de glucosa para un segundo ciclo de la privación de glucosa. Cultivar las células en este estado bajo nivel de glucosa durante 3 días más. La mayoría de los no cardiomiocitos morirán en esta condición de cultivo bajo en glucosa. </li><li> En el día 17, cambiar el medio a 2 ml de RMedio PMI / B27 con insulina. Las células restantes serán cardiomiocitos altamente purificados. Estos cardiomiocitos se pueden utilizar para el análisis de la expresión génica, la selección de fármacos, el análisis metabólico, y varios otros ensayos de aguas abajo. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (6), 150 (2013).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Kattman, S. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation.">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells:+the+matrix+sandwich+method.">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li></ol>

The authors do not declare competing interests.

La obtención de una gran cantidad de cardiomiocitos hiPSC derivado altamente purificada es crítica para la investigación cardiaca básica, así como las aplicaciones clínicas y de la traducción. Protocolos de diferenciación cardíacos han sufrido grandes mejoras en los últimos años, la transición de métodos basados ​​en el cuerpo embrioides que utilizan el crecimiento cardiogénico los factores 2, a la matriz métodos sándwich 12, y finalmente a los métodos basados ​​en pequeña...

Cardiomiocitos humanos primarios son difíciles de obtener debido a la necesidad de biopsias cardíacas invasivas, dificultad de disociar a las células individuales, y debido a la mala supervivencia celular a largo plazo en la cultura. Dada esta falta de cardiomiocitos humanos primarios, células madre pluripotentes inducidas humanas cardiomiocitos derivados de células específicos para cada paciente tecnología (hiPSC-CM) ha sido considerada como una poderosa fuente de cardiomiocitos alternativa para la investigación básica, así como aplicaciones clínicas y de traducción, tales como el modelado de la enfermedad y la droga descubrimiento 1. Los primeros esfuerzos en la diferenciación de células madre pluripotentes en cardiomiocitos emplean protocolos de diferenciación utilizando cuerpos embrioides (EBS), pero este método es ineficiente en cardiomiocitos producen porque a menudo menos de 25% de las células en un EB están latiendo cardiomiocitos 2,3. Comparativamente, un protocolo de diferenciación basada en monocapa utilizando las citoquinas activina A y BMP4 muestra una eficiencia superior a EBS, peroeste protocolo es todavía relativamente ineficiente, requiere factores de crecimiento caro, y sólo funciona en un número limitado de pluripotentes humano líneas de células madre 4. Recientemente, un protocolo de diferenciación de cardiomiocitos altamente eficiente basado monocapa-hiPSC fue desarrollado por la modulación de Wnt / β-catenina señalización 5. Estos hiPSC-CM expresar troponina T cardiaca y actinina alfa, dos proteínas sarcoméricas que son marcadores estándar de cardiomiocitos 6. El protocolo describe aquí es una adaptación de este pequeño basado en la molécula, libre de células de alimentación, la diferenciación monocapa método 5,7. Estamos en condiciones de obtener superando los cardiomiocitos de hiPSCs después de 7-10 días (Figura 1). Sin embargo, tras una diferenciación de los cardiomiocitos que resulta en 50% de células de latir, la inmunotinción consistentemente muestra la existencia de una población de los no cardiomiocitos que son negativos para los marcadores-cardiomiocitos específica como la troponina-T cardíaca específica y alfa-actinina. Para further purificar cardiomiocitos y eliminar los no cardiomiocitos, las poblaciones heterogéneas de células diferenciadas fueron sometidos a la glucosa inanición tratándolos con un medio de cultivo de glucosa extremadamente bajo para múltiples días (Figura 2). Este tratamiento elimina selectivamente los no cardiomiocitos debido a la capacidad de los cardiomiocitos, pero no los no cardiomiocitos, para metabolizar el lactato como fuente de energía primaria con el fin de sobrevivir en un entorno de baja glucosa 8. Después de esta etapa de purificación, se observa un aumento del 40% en la relación de los cardiomiocitos a los no cardiomiocitos, (Figura 3, Figura 4) y estas células se puede utilizar para el análisis de la expresión génica aguas abajo, el modelado de la enfermedad, y los ensayos de cribado de fármacos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="550">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:207px;">Name</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Matrigel (9-12 mg/mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glucose free RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11879-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Minus Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1895601</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Supplement (w/ insulin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>BenchMark</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>688000</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">CHIR99021</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>508306</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">IWR1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0161</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cell lifter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-100-240</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cryovial</td>
			<td>Fisher (NUNC tubes)</td>
			<td>375418</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12563-011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation

Madre pluripotentes cardiomiocitos derivados de células de origen humano (hiPSC-CM) se han convertido en una fuente de células importantes para abordar la falta de cardiomiocitos primarios disponibles para aplicaciones de investigación básica y traslacional. Para diferenciar hiPSCs en cardiomiocitos, diversos protocolos, incluyendo el cuerpo embrioide (EB) con base en la diferenciación y factor de crecimiento de inducción se han desarrollado. Sin embargo, estos protocolos son ineficientes y muy variable en su capacidad de generar cardiomiocitos purificados. Recientemente, un pequeño protocolo que utiliza la modulación basada en la molécula de la señalización de Wnt / β-catenina se muestra para promover la diferenciación cardiaca con alta eficiencia. Con este protocolo, mayor que 50% -60% de las células diferenciadas se cardiomiocitos de troponina-positivo cardiacas se observaron consistentemente. Para aumentar aún más la pureza de los cardiomiocitos, las células diferenciadas fueron sometidos a la glucosa inanición para eliminar específicamente no cardiomiocitos basado en la diferencia metabólicas entre los cardiomiocitos y los no cardiomiocitos. Usando esta estrategia de selección, se obtuvieron consistentemente un incremento mayor que 30% en la relación de los cardiomiocitos a los no cardiomiocitos en una población de células diferenciadas. Estos cardiomiocitos altamente purificadas deben mejorar la fiabilidad de los resultados de humano a base de IPSC en estudios de modelos de la enfermedad in vitro y ensayos de cribado de fármacos.

Los cambios morfológicos durante hiPSC diferenciación. El hiPSC cultivaron en placas libres de alimentador creció colonias planas, bidimensionales. Al llegar a alrededor de 85% de confluencia, hiPSCs fueron tratados con 6 mM CHIR para la diferenciación (Figura 1A). Se observaron cantidades sustanciales de la muerte celular, un fenómeno normal y común, después de 24 horas de tratamiento CHIR. Después de dos días de tratamiento CHIR, los hiPSCs contin...

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Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Derivación de cardiomiocitos altamente purificada de células madre humanas pluripotentes inducidas Uso Pequeño Diferenciación molécula modulada y posterior glucosa inanición

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

18.4K vistas.  Stanford University School of Medicine. Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening. 

Video: Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Derivación sin alimentador de melanocitos partir de células madre pluripotentes

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

La diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes Uso del antagonista de BMP Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Integración Derivación Gratuita de Células Madre Pluripotentes Inducidas Humanas Usando Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.