Nos gustaría agradecer a las siguientes personas por su contribución a este proyecto: Kakali Sarkar, de doctorado, Joani Christensen, BS, Kate Buretta, BS, Nance Yuan, BS, William Lehao, MD, Johanna GRAHAMMER, Georg Furtmüller, MD, Erin Rada MD, Mohammed Al-Rakan MD, Karim Sarhane MD, saami Khalifian, BS, Mao Qi, MD, y Angelo Leto Barone MD, VCA Laboratorio, Departamento de Cirugía Plástica y Reconstructiva, Facultad de Medicina, Janis Taube, MD de la Universidad Johns Hopkins, Marcos Fischer, MD, Departamento de Dermatología y Anatomía Patológica de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Sue Eller, Cirugía Mínimamente Invasiva del Centro de Formación de la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins y Cheng-Hung Lin, MD Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, Taiwán. Fuente de financiamiento: Instituto de las Fuerzas Armadas de Medicina Regenerativa (DoD W81XWH-08-2-0.032)

En esta publicación de vídeo, se llevaron a cabo todos los procedimientos con animales de acuerdo con un protocolo de animales aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comité Institucional de la Universidad Johns Hopkins (IACUC). 1. Planificación preoperatoria <ol><li> Utilizamos MHC define-MGH innato cerdo miniatura (15-20 kg) en nuestros estudios de la traducción para la allotransplantation extremidad en la que un donante masculino proporciona extremidades por dos hembras receptoras (Figura 1). Antes de la cirugía, los animales donantes y receptores se someten a una evaluación clínica minuciosa por un veterinario. </li><li> Con el fin de minimizar la anestesia y el tiempo de isquemia, procedimientos de los donantes y receptores se llevan a cabo de forma simultánea en tres mesas de operaciones en una gran sala de operaciones dedicada animales. El trabajo en equipo y la coordinación entre los equipos quirúrgicos, así como el personal veterinario son críticos para el éxito general de este procedimiento. El plan quirúrgico se discute con el equipo veterinario en una reunión formal 1-2 Semanas antes del día de la cirugía. </li><li> Un catéter venoso central tunelizado (7 Fr doble luz Hickman catéter) se coloca en una vena yugular externa o interna de cada animal receptor antes del trasplante para control del nivel de fármaco inmunosupresor y la administración intravenosa de fármacos inmunosupresores y / o fármacos inmunomoduladores. Estos catéteres se colocan bajo visión directa a través de una técnica de cut-down venosa y realizar un túnel posterior para salir de alta en el cuello dorsal y asegurado mediante suturas no absorbibles de monofilamento y el adhesivo del abrigo vendaje alrededor del cuello. </li><li> Mantenga a los animales NPO (sin alimentos sólidos, pero se permite agua ad lib) al menos 12 horas antes de la cirugía. </li><li> En el día de la cirugía, los animales sedar con ketamina 20 mg / kg y xilazina 2 mg / kg IM. </li><li> Coloque un tubo endotraqueal de tamaño adecuado y conectarlo a la máquina de anestesia y ventilación (mantenido en el isoflurano 0,5-3%) </li><li> Coloque un catéter intravenoso en una vena marginal de la oreja y administrarpeso basado 0,9% de solución salina durante todo el procedimiento. </li><li> Administrar la analgesia preventiva (buprenorfina 0,02 mg / kg IV). </li><li> Administrar antibióticos profilácticos (cefazolina 20-25 mg / kg IV) antes de la incisión inicial tanto para los donantes y los animales receptores. </li><li> Utilice una técnica estéril en todos los procedimientos para beneficiarios y donantes. Esto incluye el uso de instrumentos tratados en autoclave o esterilizados gas, máscaras, gorros en la cabeza, batas quirúrgicas estériles y guantes estériles. Afeitar el área de la incisión con una maquinilla y desinfectar con una solución de Betadine y alcohol alterna. </li></ol> Monitorización intraoperatoria: <ol><li> Después de la inducción y la intubación, mantener la anestesia con una mezcla de inhalación 0,5-3% de isoflurano en oxígeno. </li><li> Monitorear la frecuencia cardiaca, oximetría de pulso, ECG, final de la espiración de CO 2 y la temperatura rectal de forma continua y registrar cada 15 min. </li><li> Prevenir hipotermia con una cálida manta de aire forzado Bair Hugger. </li></ol><ol><li> Colocar el animal donante en una posición supina sobre la mesa de operaciones y la caída de una manera estéril. </li><li> Utilice el infrarrojo cercano angiografía láser para identificar los vasos perforantes a la piel anteromedial. Inyectar indocianina verde a aproximadamente 0,06 mg / kg diluidos en 2-5 ml de solución salina normal a través del acceso vascular periférica. Aproximadamente 10 segundos después, realizar 30 seg-2 min de las grabaciones en el infrarrojo cercano. Utilice el vídeo de estas grabaciones para identificar a los perforadores. Sobre la base de las perforantes, marcar un área de la piel (aproximadamente 100 cm 2) para el monitoreo. </li><li> Utilice un bisturí para hacer una incisión en la piel de la ingle en continuidad con las marcas de la paleta cutánea (Figura 2). </li><li> Identificar los vasos femorales y aislarlos distalmente al nivel de las ramas suprageniculado y proximalmente al nivel del ligamento inguinal. </li><li> Diseccionar la piel y el tejido subcutáneo, mientras preserving el área de la paleta cutánea. La sutura de los bordes de la piel subyacente a los músculos para evitar la contracción durante la cosecha colgajo. </li><li> Lleve a cabo una osteotomía justo por encima del tarso con una sierra de vaivén (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA). </li><li> Divida a los músculos en la parte proximal del muslo con electrocauterio. </li><li> Divida el fémur en mitad de la diáfisis dejando un colgajo osteomiocutáneo en un pedículo vascular. La tapa contiene la paleta cutánea, músculos del muslo subyacentes, articulación de la rodilla, el fémur distal y la tibia proximal que incluye intacta la médula ósea vascularizada con sus características inmunológicas únicas. </li><li> Utilice cera de hueso para lograr la hemostasia en los espacios medulares. Hueso suavizar los bordes usando ronjeurs en preparación para el destinatario. </li><li> Mantener el injerto perfundido sobre su pedículo vascular hasta vasos femorales del receptor se preparan (Figura 3). </li><li> Una vez que el destinatario es la disección completa, ligar los vasos femorales donantes como proximal como sea posible unand infundir el injerto con-histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK, Custodiol, Newtown PA) antes del trasplante. NOTA: La extremidad donante se trasplanta en el lado contralateral del destinatario es decir la extremidad izquierda de donantes para el lado derecho del receptor y el miembro donante adecuado para el lado izquierdo del receptor). </li><li> La eutanasia de cerdo donante inmediatamente después de la cosecha de la segunda extremidad posterior utilizando pentobarbital sódico 100 mg / kg IV. La muerte ha sido confirmada por el personal veterinario de acuerdo al protocolo establecido. </li></ol> 4. Procedimiento de destinatarios (Hind extremidades Allotransplantation) <ol><li> Inicie la inducción y la intubación receptor inmediatamente después de la incisión inicial de donantes para permitir la preparación de los vasos receptores, mientras que el miembro donante es ser cosechado. Esto elimina el tiempo de espera innecesario y reduce el tiempo total de la anestesia para el donante y receptores. </li><li> Coloque la supina animal con una rotación de 30 ° en el lado operativo en Allow la exposición de la parte dorsolateral. </li><li> Se practica una incisión en la ingle y exponer los vasos femorales; aislarlos distalmente al nivel de las ramas suprageniculado y proximalmente al nivel del ligamento inguinal. </li><li> Crear un bolsillo subcutáneo desde la ingle a la pared abdominal dorsolateral para la inserción del injerto (Figura 4). </li><li> Ligar los buques cedentes y lave el injerto con HTK. </li><li> Realice la inserción de injerto de forma invertida: Tener la paleta cutánea frente dorsolateral para permitir una fácil monitorización inmune en una posición de pie y los extremos cortados de los vasos femorales enfrenta caudalmente para permitir anastomosis vasculares de extremo a extremo sin ninguna tensión sobre los vasos ( la Figura 5). </li><li> Si está disponible, utilice un dispositivo de acoplamiento vascular (Synovis, St Paul MN) para las anastomosis venosas (tamaño de 2.5 a 3.5 es adecuada para 10-20 kg animales). Esto reduce significativamente el tiempo de isquemia en comparación con los métodos convencionales. </li><li> Realice Anast arterialomoses utilizando una técnica de sutura convencional con sutura 9-0 (Synovis, St Paul MN) </li><li> Después de que se confirmó la permeabilidad vascular, asegurar el injerto en su lugar con 3-0 suturas PDS (Figura 5). Los músculos del injerto se suturan a los músculos de la pared abdominal. Los músculos de injerto no deben ser suturados a los músculos del muslo receptores ya que puede ser perjudicial cuando el animal se mueve alrededor de la jaula. </li><li> Exteriorizar la paleta cutánea en la cara dorsolateral para la vigilancia inmune (Figura 6) y se sutura a la piel adyacente usando Vicryl 3-0 suturas subcutáneas y 4-0 monofilamento absorbibles suturas de la piel interrumpidas. </li><li> Cierre de la piel de la ingle en capas usando Vicryl 3-0 suturas subcutáneas y 4-0 monofilamento absorbibles suturas de la piel interrumpidas. </li><li> Coloque un parche 50-100 mcg / hr fentanyl para analgesia postoperatoria. </li><li> Después del trasplante de aloinjerto de las extremidades posteriores, devolver el animal a su pluma una vez despierto y respirando cómodamente en su propio.</li>
</ol>

<ol>
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K., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+composite+tissue+allotransplant+model+for+preclinical+hand+transplant+studies.">Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies.</a> Microsurgery. 20, 400-406 (2000).</li><li>Ust&#252;ner, E. T., Zdichavsky, M., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+composite+tissue+allograft+survival+in+a+porcine+model+with+cyclosporine/mycophenolate+mofetil+therapy.">Long-term composite tissue allograft survival in a porcine model with cyclosporine/mycophenolate mofetil therapy.</a> Transplantation. 661, 581-587 (1998).</li><li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation:+a+translational+trial+in+swine.">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Históricamente, el protocolo de trasplante heterotópico extremidad posterior incluyó la exteriorización de una paleta cutánea a la pared abdominal ventral y los vasos se anastomosa de forma de extremo a lateral (Hettiarachty 2004). Sin embargo, en nuestro método modificado, una solapa invertida insetting y anastomosis de extremo a extremo de llevar la paleta cutánea más lateralmente y por lo tanto facilita la monitorización inmune en una posición de pie del animal. La identificación de la arteria sural y las ...

Vascularizado compuesto Allotransplantation (VCA), tales como trasplantes de mano y cara son ya una realidad clínica con numerosos trasplantes de mano y cara realizadas en todo el mundo 12. A pesar de que los resultados tempranos e intermedios son favorables y altamente alentando 2, el requisito de la inmunosupresión crónica multirresistente sigue limitando su aplicación clínica generalizada. Los avances en los modelos murinos de VCA incluyendo anastomosis súper microcirugía y técnicas de puño nonsuture 13, 3 han allanado el camino para una mejor comprensión de aloinmunes respuestas en VCA. Se han propuesto Miríadas de protocolos inmunomoduladores para aplicaciones clínicas basadas en nuestro conocimiento de los mecanismos inmunes en VCA pero tienen que ser validados en un modelo animal de gran tamaño que sería razonablemente predictiva de su desempeño en los seres humanos 7. Con base en las similitudes fisiológicas e inmunológicas entre sistemas de órganos humanos y porcinos <sup&gt; 6, modelos porcinos de VCA se pueden considerar alternativas fiables y rentables a canino 9 y modelos de primates no humanos 1. En este artículo se ofrece una descripción detallada de la metodología utilizada en nuestro modelo definido MHC porcina heterotópico trasera del miembro de trasplante, que sirve como base para nuestras estrategias inmunomoduladoras actuales y futuras destinadas a inducir tolerancia inmunológica a VCA y por lo tanto la ampliación de su aplicación clínica. Utilizamos cerdos endogámicas bien caracterizados criados para la homocigosis en el locus del antígeno leucocitario porcino específicamente para su uso en la investigación relacionada con el trasplante 11. Planteamos un colgajo vascularizado osteomiocutáneo basado en los vasos femorales. La aleta contiene intacta médula ósea vascularizada en el fémur distal y la tibia proximal. La piel del muslo anteromedial también está incluido en el injerto y se exterioriza a la cara dorsolateral del animal receptor para la vigilancia inmune del componente o más inmunogénicaf el AVC. Posicionamiento dorsolateral facilita el examen clínico en pie y sentado posiciones y también mantiene la piel del injerto relativamente limpio. Ustener et al. Introducido uno de los primeros grandes modelos animales de traslación en VCA por trasplantar radiales solapas osteomiocutáneo extremidad anterior en cerdos de granja outbred 15. El grupo utilizó este modelo para demostrar por primera vez que el rechazo agudo en el AVC que incluía el componente altamente inmunogénica de la piel podría retrasarse y se trató con una estrategia clínicamente relevante sin complicaciones significativas específicos a los fármacos y efectos secundarios. Los resultados favorables obtenidos en este estudio, posteriormente construyeron un paso fundamental en el diseño de los regímenes de medicamentos para el trasplante reconstructivo humano. Aunque estos modelos VCA cerdo temprana eran muy adecuadas para el desarrollo de protocolos para prevenir el rechazo de la piel, los músculos, huesos, nervios y vasos que carecen de estructuras especializadas como cartilag articularcorreo y las membranas sinoviales de las articulaciones. Los esfuerzos posteriores se centraron en la inclusión de la cifra media del animal, lo que hizo necesaria la colocación de larga duración yeso para evitar el desplazamiento del injerto 14. Aunque son apropiados para investigar el rechazo de todos los componentes principales de los trasplantes de extremidades, una de las principales limitaciones de este modelo era post-trasplante de dificultad caminar por fundido colocación. Por lo tanto, los modelos de alotrasplante extremidad porcina heterotópico, que consiste en la tibia, el peroné, articulación de la rodilla, el fémur distal, músculo circundante, y una paleta cutánea, se crearon principalmente para estudiar los aspectos inmunológicos de la VCA al tiempo que permite al animal a deambular libremente después de la operación con un mínimo de 8 morbidit . El desarrollo de los cerdos endogámicas definidos SLA bien caracterizados por el trabajo pionero del Dr. David H. Sachs dio lugar a una nueva era de investigación traslacional VCA. Utilizando un modelo de trasplante heterotópico de las extremidades posteriores en un entorno desajuste antígeno menor, Mathes et al. 10 demostraron la supervivencia indefinida de los componentes del aparato locomotor con un curso corto de tratamiento con ciclosporina. La supervivencia componente de la piel, sin embargo, fue sólo prolonga en comparación con los controles sin tratamiento. La pérdida del componente de la piel del injerto se atribuyó a una respuesta inmune aislada y altamente vigorosa, en particular, a la epidermis. Del mismo modo, el uso de cerdos plenamente coincidentes con el agotamiento de las células T, un curso corto de la ciclosporina y citoquinas movilizado donantes de células mononucleares de sangre periférica inducida por la tolerancia sólo a los componentes del aparato locomotor y el componente de la piel seguía rechazó 5. Este fenómeno, llamado &quot;tolerancia split &#39;, trajo un cambio de paradigma en la investigación VCA con un mayor énfasis en el componente de la piel altamente inmunogénica, que es un componente integral de la mayoría de los trasplantes de reconstrucción realizados hasta la fecha. En este modelo modificado, utilizamos anastomosis de extremo a extremo por ligating de la arteria femoral destinatario y girándola en sentido cefálico (Figura 1). Esto no sólo reduce el tiempo de isquemia por lo que permite el uso de un dispositivo de acoplamiento convencional, pero también disminuye las posibilidades de fracaso de la anastomosis. No hemos observado ningún evento isquémicas tras la ligadura de la arteria femoral en nuestros destinatarios lo que indica que la circulación colateral fue suficiente para proporcionar la vascularización de la pierna nativo. Además, en este método modificado, se moviliza el componente externalizado de la piel basado en los vasos perforantes subyacentes y se posiciona lateralmente (Figura 1) en contraste con una posición de la ingle ventral en el modelo tradicional 10. Esto permite una fácil visualización del injerto para la vigilancia inmune en un pie o sentado posición del animal. Por lo tanto, un modelo animal grande fiable y reproducible es esencial para investigar las estrategias de inducción de tolerancia hacia el componente de la piel de VCA y para desarrollar nuevos nestrategias oninvasive monitoreo inmunológico para una mejor predicción de la supervivencia del injerto.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HTK</td>
			<td>Custodial</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electric Pen Drive</td>
			<td>Synthes, Westchester PA </td>
			<td>05.001.011 </td>
			<td>Reciprocating saw</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vascular Coupling device</td>
			<td>Synovis, Newtown PA</td>
			<td>21003B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (vca) research

Vascularizado compuesto Allotransplantation (VCA), tales como trasplantes de mano y cara representa una opción de tratamiento viable para el complejo trauma musculoesquelético y la pérdida de tejido devastador. A pesar de los resultados funcionales favorables y altamente alentadores temprana e intermedia, el rechazo del componente de la piel altamente inmunogénica de un AVC, y los posibles efectos adversos de la inmunosupresión crónica múltiples fármacos siguen obstaculizando la aplicación clínica generalizada de VCA. Por lo tanto, la investigación en esta novela campo debe centrarse en estudios de traducción relacionados con las características inmunológicas únicas de VCA y para desarrollar nuevas estrategias de inmunomoduladores para la inmunomodulación y la inducción de tolerancia siguientes VCA sin necesidad de inmunosupresión a largo plazo. Este artículo describe un modelo grande de la traducción fiable y reproducible de los animales del AVC que se compone de una aleta osteomiocutáneo en un porcina alotrasplante extremidad posterior heterotópico definido por el MHC. BriEFLY, una paleta piel bien vascularizado se identifica en la región del muslo anteromedial utilizando cerca de la angiografía láser infrarrojo. Los músculos subyacentes, articulación de la rodilla, el fémur distal y la tibia proximal se cosechan en un pedículo vascular femoral. Este aloinjerto puede ser considerado tanto un VCA y un trasplante de médula ósea vascularizada con sus características privilegiadas inmunes únicas. El injerto se trasplanta a un bolsillo subcutáneo abdominal en el animal receptor con un componente de la piel exteriorizado a la región dorsolateral para la vigilancia inmune. Tres equipos quirúrgicos trabajan simultáneamente de una manera bien coordinada para reducir la anestesia y los tiempos de isquemia, mejorando así la eficacia de este modelo y la reducción de posibles factores de confusión en los protocolos experimentales. Este modelo sirve de base para futuras estrategias terapéuticas destinadas a reducir y posiblemente eliminar la necesidad de inmunosupresión a múltiples fármacos crónica en VCA.

Veinticuatro trasplantes de extremidades posteriores heterotópicas porcina definidos SLA se realizaron utilizando nuestra técnica modificada con un tiempo medio de isquemia de 78 min (rango: 62 a 94 min). Inserción del injerto y dorsolateral posicionamiento paleta cutánea se consiguieron sin dificultad en todos los animales. Cerca de la angiografía láser infrarrojo mostró una excelente perfusión del injerto en todos los destinatarios. Los doce anastomosis venosa iniciales se realizaron utilizando técnicas de su...

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A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Vascularizado Allotransplantations Composite (VCA) se han convertido en una realidad clínica. Sin embargo, la amplia aplicación clínica de AVC está limitada por la inmunosupresión crónica a múltiples fármacos. Los autores presentan un modelo animal grande fiable y reproducible para traducir nuevas estrategias inmunomoduladoras que pueden minimizar o potencialmente eliminar la necesidad de la inmunosupresión en el AVC.

Un modelo de trasplante heterotópico porcina Hind extremidades Modificado traslacional vascularizado compuesto Allotransplantation (VCA) Investigación

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

12.4K vistas.  Johns Hopkins University School of Medicine.  Vascularizado Allotransplantations Composite (VCA) se han convertido en una realidad clínica. Sin embargo, la amplia aplicación clínica de AVC está limitada por la inmunosupresión crónica a múltiples fármacos. Los autores presentan un modelo animal grande fiable y reproducible para traducir nuevas estrategias inmunomoduladoras que pueden minimizar o potencialmente eliminar la necesidad de la inmunosupresión en el AVC. 