Nos gustaría agradecer a las siguientes personas por su contribución a este proyecto: Kakali Sarkar, de doctorado, Joani Christensen, BS, Kate Buretta, BS, Nance Yuan, BS, William Lehao, MD, Johanna GRAHAMMER, Georg Furtmüller, MD, Erin Rada MD, Mohammed Al-Rakan MD, Karim Sarhane MD, saami Khalifian, BS, Mao Qi, MD, y Angelo Leto Barone MD, VCA Laboratorio, Departamento de Cirugía Plástica y Reconstructiva, Facultad de Medicina, Janis Taube, MD de la Universidad Johns Hopkins, Marcos Fischer, MD, Departamento de Dermatología y Anatomía Patológica de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Sue Eller, Cirugía Mínimamente Invasiva del Centro de Formación de la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins y Cheng-Hung Lin, MD Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, Taiwán. Fuente de financiamiento: Instituto de las Fuerzas Armadas de Medicina Regenerativa (DoD W81XWH-08-2-0.032)

En esta publicación de vídeo, se llevaron a cabo todos los procedimientos con animales de acuerdo con un protocolo de animales aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comité Institucional de la Universidad Johns Hopkins (IACUC). 1. Planificación preoperatoria <ol><li> Utilizamos MHC define-MGH innato cerdo miniatura (15-20 kg) en nuestros estudios de la traducción para la allotransplantation extremidad en la que un donante masculino proporciona extremidades por dos hembras receptoras (Figura 1). Antes de la cirugía, los animales donantes y receptores se someten a una evaluación clínica minuciosa por un veterinario. </li><li> Con el fin de minimizar la anestesia y el tiempo de isquemia, procedimientos de los donantes y receptores se llevan a cabo de forma simultánea en tres mesas de operaciones en una gran sala de operaciones dedicada animales. El trabajo en equipo y la coordinación entre los equipos quirúrgicos, así como el personal veterinario son críticos para el éxito general de este procedimiento. El plan quirúrgico se discute con el equipo veterinario en una reunión formal 1-2 Semanas antes del día de la cirugía. </li><li> Un catéter venoso central tunelizado (7 Fr doble luz Hickman catéter) se coloca en una vena yugular externa o interna de cada animal receptor antes del trasplante para control del nivel de fármaco inmunosupresor y la administración intravenosa de fármacos inmunosupresores y / o fármacos inmunomoduladores. Estos catéteres se colocan bajo visión directa a través de una técnica de cut-down venosa y realizar un túnel posterior para salir de alta en el cuello dorsal y asegurado mediante suturas no absorbibles de monofilamento y el adhesivo del abrigo vendaje alrededor del cuello. </li><li> Mantenga a los animales NPO (sin alimentos sólidos, pero se permite agua ad lib) al menos 12 horas antes de la cirugía. </li><li> En el día de la cirugía, los animales sedar con ketamina 20 mg / kg y xilazina 2 mg / kg IM. </li><li> Coloque un tubo endotraqueal de tamaño adecuado y conectarlo a la máquina de anestesia y ventilación (mantenido en el isoflurano 0,5-3%) </li><li> Coloque un catéter intravenoso en una vena marginal de la oreja y administrarpeso basado 0,9% de solución salina durante todo el procedimiento. </li><li> Administrar la analgesia preventiva (buprenorfina 0,02 mg / kg IV). </li><li> Administrar antibióticos profilácticos (cefazolina 20-25 mg / kg IV) antes de la incisión inicial tanto para los donantes y los animales receptores. </li><li> Utilice una técnica estéril en todos los procedimientos para beneficiarios y donantes. Esto incluye el uso de instrumentos tratados en autoclave o esterilizados gas, máscaras, gorros en la cabeza, batas quirúrgicas estériles y guantes estériles. Afeitar el área de la incisión con una maquinilla y desinfectar con una solución de Betadine y alcohol alterna. </li></ol> Monitorización intraoperatoria: <ol><li> Después de la inducción y la intubación, mantener la anestesia con una mezcla de inhalación 0,5-3% de isoflurano en oxígeno. </li><li> Monitorear la frecuencia cardiaca, oximetría de pulso, ECG, final de la espiración de CO 2 y la temperatura rectal de forma continua y registrar cada 15 min. </li><li> Prevenir hipotermia con una cálida manta de aire forzado Bair Hugger. </li></ol><ol><li> Colocar el animal donante en una posición supina sobre la mesa de operaciones y la caída de una manera estéril. </li><li> Utilice el infrarrojo cercano angiografía láser para identificar los vasos perforantes a la piel anteromedial. Inyectar indocianina verde a aproximadamente 0,06 mg / kg diluidos en 2-5 ml de solución salina normal a través del acceso vascular periférica. Aproximadamente 10 segundos después, realizar 30 seg-2 min de las grabaciones en el infrarrojo cercano. Utilice el vídeo de estas grabaciones para identificar a los perforadores. Sobre la base de las perforantes, marcar un área de la piel (aproximadamente 100 cm 2) para el monitoreo. </li><li> Utilice un bisturí para hacer una incisión en la piel de la ingle en continuidad con las marcas de la paleta cutánea (Figura 2). </li><li> Identificar los vasos femorales y aislarlos distalmente al nivel de las ramas suprageniculado y proximalmente al nivel del ligamento inguinal. </li><li> Diseccionar la piel y el tejido subcutáneo, mientras preserving el área de la paleta cutánea. La sutura de los bordes de la piel subyacente a los músculos para evitar la contracción durante la cosecha colgajo. </li><li> Lleve a cabo una osteotomía justo por encima del tarso con una sierra de vaivén (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA). </li><li> Divida a los músculos en la parte proximal del muslo con electrocauterio. </li><li> Divida el fémur en mitad de la diáfisis dejando un colgajo osteomiocutáneo en un pedículo vascular. La tapa contiene la paleta cutánea, músculos del muslo subyacentes, articulación de la rodilla, el fémur distal y la tibia proximal que incluye intacta la médula ósea vascularizada con sus características inmunológicas únicas. </li><li> Utilice cera de hueso para lograr la hemostasia en los espacios medulares. Hueso suavizar los bordes usando ronjeurs en preparación para el destinatario. </li><li> Mantener el injerto perfundido sobre su pedículo vascular hasta vasos femorales del receptor se preparan (Figura 3). </li><li> Una vez que el destinatario es la disección completa, ligar los vasos femorales donantes como proximal como sea posible unand infundir el injerto con-histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK, Custodiol, Newtown PA) antes del trasplante. NOTA: La extremidad donante se trasplanta en el lado contralateral del destinatario es decir la extremidad izquierda de donantes para el lado derecho del receptor y el miembro donante adecuado para el lado izquierdo del receptor). </li><li> La eutanasia de cerdo donante inmediatamente después de la cosecha de la segunda extremidad posterior utilizando pentobarbital sódico 100 mg / kg IV. La muerte ha sido confirmada por el personal veterinario de acuerdo al protocolo establecido. </li></ol> 4. Procedimiento de destinatarios (Hind extremidades Allotransplantation) <ol><li> Inicie la inducción y la intubación receptor inmediatamente después de la incisión inicial de donantes para permitir la preparación de los vasos receptores, mientras que el miembro donante es ser cosechado. Esto elimina el tiempo de espera innecesario y reduce el tiempo total de la anestesia para el donante y receptores. </li><li> Coloque la supina animal con una rotación de 30 ° en el lado operativo en Allow la exposición de la parte dorsolateral. </li><li> Se practica una incisión en la ingle y exponer los vasos femorales; aislarlos distalmente al nivel de las ramas suprageniculado y proximalmente al nivel del ligamento inguinal. </li><li> Crear un bolsillo subcutáneo desde la ingle a la pared abdominal dorsolateral para la inserción del injerto (Figura 4). </li><li> Ligar los buques cedentes y lave el injerto con HTK. </li><li> Realice la inserción de injerto de forma invertida: Tener la paleta cutánea frente dorsolateral para permitir una fácil monitorización inmune en una posición de pie y los extremos cortados de los vasos femorales enfrenta caudalmente para permitir anastomosis vasculares de extremo a extremo sin ninguna tensión sobre los vasos ( la Figura 5). </li><li> Si está disponible, utilice un dispositivo de acoplamiento vascular (Synovis, St Paul MN) para las anastomosis venosas (tamaño de 2.5 a 3.5 es adecuada para 10-20 kg animales). Esto reduce significativamente el tiempo de isquemia en comparación con los métodos convencionales. </li><li> Realice Anast arterialomoses utilizando una técnica de sutura convencional con sutura 9-0 (Synovis, St Paul MN) </li><li> Después de que se confirmó la permeabilidad vascular, asegurar el injerto en su lugar con 3-0 suturas PDS (Figura 5). Los músculos del injerto se suturan a los músculos de la pared abdominal. Los músculos de injerto no deben ser suturados a los músculos del muslo receptores ya que puede ser perjudicial cuando el animal se mueve alrededor de la jaula. </li><li> Exteriorizar la paleta cutánea en la cara dorsolateral para la vigilancia inmune (Figura 6) y se sutura a la piel adyacente usando Vicryl 3-0 suturas subcutáneas y 4-0 monofilamento absorbibles suturas de la piel interrumpidas. </li><li> Cierre de la piel de la ingle en capas usando Vicryl 3-0 suturas subcutáneas y 4-0 monofilamento absorbibles suturas de la piel interrumpidas. </li><li> Coloque un parche 50-100 mcg / hr fentanyl para analgesia postoperatoria. </li><li> Después del trasplante de aloinjerto de las extremidades posteriores, devolver el animal a su pluma una vez despierto y respirando cómodamente en su propio.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barth, R. N., Rodriguez, E. D., Mundinger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+bone+marrow-based+immunosuppression+inhibits+rejection+of+vascularized+composite+allografts+in+nonhuman+primates.">Vascularized bone marrow-based immunosuppression inhibits rejection of vascularized composite allografts in nonhuman primates.</a> Am. J. Transplant. 11 (7), 1407-1416 (2011).</li><li>Brandacher, G., Gorantla, V. S., Schneeberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand/Forearm+transplantation+using+a+novel+cell-based+immunomodulatory+protocol-experience+with+five+patients.">Hand/Forearm transplantation using a novel cell-based immunomodulatory protocol-experience with five patients.</a> Am. J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+bridge:+large+animal+models+in+translational+transplantation+research.">Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research.</a> Immunol. Rev. 19, 176-196 (2003).</li><li>Lee, W. P., Rubin, J. P., Cober, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+swine+model+in+transplantation+of+vascularized+skeletal+tissue+allografts.">Use of swine model in transplantation of vascularized skeletal tissue allografts.</a> Transplant Proc. 30, 2743-2745 (1998).</li><li>Mathes, D. W., Hwang, B., Graves, S. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histocompatible+miniature+swine:+an+inbred+largeanimal+model.">Histocompatible miniature swine: an inbred largeanimal model.</a> Transplantation. 75 (6), 904-907 (2003).</li><li>Petruzzo, P., Lanzetta, M., Dubernard, J. 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K., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+composite+tissue+allotransplant+model+for+preclinical+hand+transplant+studies.">Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies.</a> Microsurgery. 20, 400-406 (2000).</li><li>Ust&#252;ner, E. T., Zdichavsky, M., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+composite+tissue+allograft+survival+in+a+porcine+model+with+cyclosporine/mycophenolate+mofetil+therapy.">Long-term composite tissue allograft survival in a porcine model with cyclosporine/mycophenolate mofetil therapy.</a> Transplantation. 661, 581-587 (1998).</li><li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation:+a+translational+trial+in+swine.">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Históricamente, el protocolo de trasplante heterotópico extremidad posterior incluyó la exteriorización de una paleta cutánea a la pared abdominal ventral y los vasos se anastomosa de forma de extremo a lateral (Hettiarachty 2004). Sin embargo, en nuestro método modificado, una solapa invertida insetting y anastomosis de extremo a extremo de llevar la paleta cutánea más lateralmente y por lo tanto facilita la monitorización inmune en una posición de pie del animal. La identificación de la arteria sural y las ...

Vascularizado compuesto Allotransplantation (VCA), tales como trasplantes de mano y cara son ya una realidad clínica con numerosos trasplantes de mano y cara realizadas en todo el mundo 12. A pesar de que los resultados tempranos e intermedios son favorables y altamente alentando 2, el requisito de la inmunosupresión crónica multirresistente sigue limitando su aplicación clínica generalizada. Los avances en los modelos murinos de VCA incluyendo anastomosis súper microcirugía y técnicas de puño nonsuture 13, 3 han allanado el camino para una mejor comprensión de aloinmunes respuestas en VCA. Se han propuesto Miríadas de protocolos inmunomoduladores para aplicaciones clínicas basadas en nuestro conocimiento de los mecanismos inmunes en VCA pero tienen que ser validados en un modelo animal de gran tamaño que sería razonablemente predictiva de su desempeño en los seres humanos 7. Con base en las similitudes fisiológicas e inmunológicas entre sistemas de órganos humanos y porcinos <sup&gt; 6, modelos porcinos de VCA se pueden considerar alternativas fiables y rentables a canino 9 y modelos de primates no humanos 1. En este artículo se ofrece una descripción detallada de la metodología utilizada en nuestro modelo definido MHC porcina heterotópico trasera del miembro de trasplante, que sirve como base para nuestras estrategias inmunomoduladoras actuales y futuras destinadas a inducir tolerancia inmunológica a VCA y por lo tanto la ampliación de su aplicación clínica. Utilizamos cerdos endogámicas bien caracterizados criados para la homocigosis en el locus del antígeno leucocitario porcino específicamente para su uso en la investigación relacionada con el trasplante 11. Planteamos un colgajo vascularizado osteomiocutáneo basado en los vasos femorales. La aleta contiene intacta médula ósea vascularizada en el fémur distal y la tibia proximal. La piel del muslo anteromedial también está incluido en el injerto y se exterioriza a la cara dorsolateral del animal receptor para la vigilancia inmune del componente o más inmunogénicaf el AVC. Posicionamiento dorsolateral facilita el examen clínico en pie y sentado posiciones y también mantiene la piel del injerto relativamente limpio. Ustener et al. Introducido uno de los primeros grandes modelos animales de traslación en VCA por trasplantar radiales solapas osteomiocutáneo extremidad anterior en cerdos de granja outbred 15. El grupo utilizó este modelo para demostrar por primera vez que el rechazo agudo en el AVC que incluía el componente altamente inmunogénica de la piel podría retrasarse y se trató con una estrategia clínicamente relevante sin complicaciones significativas específicos a los fármacos y efectos secundarios. Los resultados favorables obtenidos en este estudio, posteriormente construyeron un paso fundamental en el diseño de los regímenes de medicamentos para el trasplante reconstructivo humano. Aunque estos modelos VCA cerdo temprana eran muy adecuadas para el desarrollo de protocolos para prevenir el rechazo de la piel, los músculos, huesos, nervios y vasos que carecen de estructuras especializadas como cartilag articularcorreo y las membranas sinoviales de las articulaciones. Los esfuerzos posteriores se centraron en la inclusión de la cifra media del animal, lo que hizo necesaria la colocación de larga duración yeso para evitar el desplazamiento del injerto 14. Aunque son apropiados para investigar el rechazo de todos los componentes principales de los trasplantes de extremidades, una de las principales limitaciones de este modelo era post-trasplante de dificultad caminar por fundido colocación. Por lo tanto, los modelos de alotrasplante extremidad porcina heterotópico, que consiste en la tibia, el peroné, articulación de la rodilla, el fémur distal, músculo circundante, y una paleta cutánea, se crearon principalmente para estudiar los aspectos inmunológicos de la VCA al tiempo que permite al animal a deambular libremente después de la operación con un mínimo de 8 morbidit . El desarrollo de los cerdos endogámicas definidos SLA bien caracterizados por el trabajo pionero del Dr. David H. Sachs dio lugar a una nueva era de investigación traslacional VCA. Utilizando un modelo de trasplante heterotópico de las extremidades posteriores en un entorno desajuste antígeno menor, Mathes et al. 10 demostraron la supervivencia indefinida de los componentes del aparato locomotor con un curso corto de tratamiento con ciclosporina. La supervivencia componente de la piel, sin embargo, fue sólo prolonga en comparación con los controles sin tratamiento. La pérdida del componente de la piel del injerto se atribuyó a una respuesta inmune aislada y altamente vigorosa, en particular, a la epidermis. Del mismo modo, el uso de cerdos plenamente coincidentes con el agotamiento de las células T, un curso corto de la ciclosporina y citoquinas movilizado donantes de células mononucleares de sangre periférica inducida por la tolerancia sólo a los componentes del aparato locomotor y el componente de la piel seguía rechazó 5. Este fenómeno, llamado &quot;tolerancia split &#39;, trajo un cambio de paradigma en la investigación VCA con un mayor énfasis en el componente de la piel altamente inmunogénica, que es un componente integral de la mayoría de los trasplantes de reconstrucción realizados hasta la fecha. En este modelo modificado, utilizamos anastomosis de extremo a extremo por ligating de la arteria femoral destinatario y girándola en sentido cefálico (Figura 1). Esto no sólo reduce el tiempo de isquemia por lo que permite el uso de un dispositivo de acoplamiento convencional, pero también disminuye las posibilidades de fracaso de la anastomosis. No hemos observado ningún evento isquémicas tras la ligadura de la arteria femoral en nuestros destinatarios lo que indica que la circulación colateral fue suficiente para proporcionar la vascularización de la pierna nativo. Además, en este método modificado, se moviliza el componente externalizado de la piel basado en los vasos perforantes subyacentes y se posiciona lateralmente (Figura 1) en contraste con una posición de la ingle ventral en el modelo tradicional 10. Esto permite una fácil visualización del injerto para la vigilancia inmune en un pie o sentado posición del animal. Por lo tanto, un modelo animal grande fiable y reproducible es esencial para investigar las estrategias de inducción de tolerancia hacia el componente de la piel de VCA y para desarrollar nuevos nestrategias oninvasive monitoreo inmunológico para una mejor predicción de la supervivencia del injerto.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HTK</td>
			<td>Custodial</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electric Pen Drive</td>
			<td>Synthes, Westchester PA </td>
			<td>05.001.011 </td>
			<td>Reciprocating saw</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vascular Coupling device</td>
			<td>Synovis, Newtown PA</td>
			<td>21003B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (vca) research

Vascularizado compuesto Allotransplantation (VCA), tales como trasplantes de mano y cara representa una opción de tratamiento viable para el complejo trauma musculoesquelético y la pérdida de tejido devastador. A pesar de los resultados funcionales favorables y altamente alentadores temprana e intermedia, el rechazo del componente de la piel altamente inmunogénica de un AVC, y los posibles efectos adversos de la inmunosupresión crónica múltiples fármacos siguen obstaculizando la aplicación clínica generalizada de VCA. Por lo tanto, la investigación en esta novela campo debe centrarse en estudios de traducción relacionados con las características inmunológicas únicas de VCA y para desarrollar nuevas estrategias de inmunomoduladores para la inmunomodulación y la inducción de tolerancia siguientes VCA sin necesidad de inmunosupresión a largo plazo. Este artículo describe un modelo grande de la traducción fiable y reproducible de los animales del AVC que se compone de una aleta osteomiocutáneo en un porcina alotrasplante extremidad posterior heterotópico definido por el MHC. BriEFLY, una paleta piel bien vascularizado se identifica en la región del muslo anteromedial utilizando cerca de la angiografía láser infrarrojo. Los músculos subyacentes, articulación de la rodilla, el fémur distal y la tibia proximal se cosechan en un pedículo vascular femoral. Este aloinjerto puede ser considerado tanto un VCA y un trasplante de médula ósea vascularizada con sus características privilegiadas inmunes únicas. El injerto se trasplanta a un bolsillo subcutáneo abdominal en el animal receptor con un componente de la piel exteriorizado a la región dorsolateral para la vigilancia inmune. Tres equipos quirúrgicos trabajan simultáneamente de una manera bien coordinada para reducir la anestesia y los tiempos de isquemia, mejorando así la eficacia de este modelo y la reducción de posibles factores de confusión en los protocolos experimentales. Este modelo sirve de base para futuras estrategias terapéuticas destinadas a reducir y posiblemente eliminar la necesidad de inmunosupresión a múltiples fármacos crónica en VCA.

Veinticuatro trasplantes de extremidades posteriores heterotópicas porcina definidos SLA se realizaron utilizando nuestra técnica modificada con un tiempo medio de isquemia de 78 min (rango: 62 a 94 min). Inserción del injerto y dorsolateral posicionamiento paleta cutánea se consiguieron sin dificultad en todos los animales. Cerca de la angiografía láser infrarrojo mostró una excelente perfusión del injerto en todos los destinatarios. Los doce anastomosis venosa iniciales se realizaron utilizando técnicas de su...

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A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Vascularizado Allotransplantations Composite (VCA) se han convertido en una realidad clínica. Sin embargo, la amplia aplicación clínica de AVC está limitada por la inmunosupresión crónica a múltiples fármacos. Los autores presentan un modelo animal grande fiable y reproducible para traducir nuevas estrategias inmunomoduladoras que pueden minimizar o potencialmente eliminar la necesidad de la inmunosupresión en el AVC.

Un modelo de trasplante heterotópico porcina Hind extremidades Modificado traslacional vascularizado compuesto Allotransplantation (VCA) Investigación

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

12.4K vistas.  Johns Hopkins University School of Medicine.  Vascularizado Allotransplantations Composite (VCA) se han convertido en una realidad clínica. Sin embargo, la amplia aplicación clínica de AVC está limitada por la inmunosupresión crónica a múltiples fármacos. Los autores presentan un modelo animal grande fiable y reproducible para traducir nuevas estrategias inmunomoduladoras que pueden minimizar o potencialmente eliminar la necesidad de la inmunosupresión en el AVC. 

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A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents available. A difficulty is presented due to the small size of the animal and the considerable technical challenges of the microsurgery involved in heart transplantation. In particular, a high rate of technical failure early after transplantation may result from recipient death and post-operative complications such as hind limb paralysis or a non-beating heart. Here, the complete technique for heterotopic mouse heart transplantation is demonstrated, involving harvesting the donor heart and its subsequent implantation into a recipient mouse. The donor heart is harvested immediately following in situ perfusion with cold heparinized saline and transection of the ascending aorta and pulmonary artery. The recipient operation involves preparation of the abdominal aorta and inferior vena cava (IVC), followed by end-to-side anastomosis of the donor aorta with the recipient aorta using a single running 10-0 microsuture and a similar anastomosis of the donor pulmonary artery with the recipient IVC. Following the operation the animal is injected with 0.6 ml normal saline subcutaneously and allowed to recover on a 37&#160;&#176;C heating pad. The results from 227 mouse heart transplants are summarized with a success rate at 48 hr of 86.8%. Of the 13.2% failures within 48 hr, 5 (2.2%) experienced hind limb paralysis, 10 (4.4%) had a non-beating heart due to graft ischemic injury and/or thrombosis, while 15 (6.6%) died within 48 hr.

A technique is demonstrated for the microsurgical procedure for heterotopic transplantation of hearts in mice, including simplified methods for donor harvesting and recipient vessel anastomosis.

Un método modificado para heterotópico Ratón Corazón TRASPLANTE

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Investigación

Medicina

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Murino heterotópico Corazón Trasplante Técnica

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Un microquirúrgica Modelo Novela de heterotópico, en bloque, pared torácica, el timo y el trasplante cardiaco en ratones

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

Ortotópico de la extremidad posterior de trasplante en el ratón

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Modelo murino de trasplante de páncreas mediante una técnica modificada del pun ¢ o

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic options have significant risk of failure and substantial morbidity.
Use of bone vascularized composite allotransplantation (VCA) would offer both a close match of resected bone size and shape and the healing and remodeling potential of living bone. At present, life-long drug immunosuppression (IS) is required. Organ toxicity, opportunistic infection and neoplasm risks are of concern to treat such non-lethal indications.
We have previously demonstrated that bone and joint VCA viability may be maintained in rats and rabbits without the need of long-term-immunosuppression by implantation of recipient derived vessels within the VCA. It generates an autogenous, neoangiogenic circulation with measurable flow and active bone remodeling, requiring only 2 weeks of IS. As small animals differ from man substantially in anatomy, bone physiology and immunology, we have developed a porcine bone VCA model to evaluate this technique before clinical application is undertaken. Miniature swine are currently widely used for allotransplantation research, given their immunologic, anatomic, physiologic and size similarities to man. Here, we describe a new porcine orthotopic tibial bone VCA model to test the role of autogenous surgical angiogenesis to maintain VCA viability.
The model reconstructs segmental tibial bone defects using size- and shape-matched allogeneic tibial bone segments, transplanted across a major swine leukocyte antigen (SLA) mismatch in Yucatan miniature swine. Nutrient vessel repair and implantation of recipient derived autogenous vessels into the medullary canal of allogeneic tibial bone segments is performed in combination with simultaneous short-term IS. This permits a neoangiogenic autogenous circulation to develop from the implanted tissue, maintaining flow through the allogeneic nutrient vessels for a short time. Once established, the new autogenous circulation maintains bone viability following cessation of drug therapy and subsequent nutrient vessel thrombosis.

Currently any kind of vascularized composite allotransplantation depends on long-term-immunosuppression, difficult to support for non-life-critical indications. We present a new porcine tibial VCA model that can be used to study bone VCA and demonstrate the use of surgical angiogenesis to maintain bone viability without the need of long-term immune-modulation.

Angiogénesis quirúrgica en porcino Allotransplantation Tibial: un hueso de Animal grande nuevo vascularizado compuesto Allotransplantation modelo

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

Modelo preclínico de isquemia de extremidades traseras en conejos diabéticos

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand and face transplants and, more recently, abdominal wall, uterus, and urogenital transplants. Functional outcomes have exceeded initial expectations, and most recipients enjoy an improved quality of life. However, as clinical experience accumulates, chronic rejection and complications from the immunosuppression must be addressed. In many cases where grafts have failed, the causative pathology has been ischemic vasculopathy. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">The biological mechanisms of the acute and chronic rejection associated with VCA, especially ischemic vasculopathy, are important areas of research. However, due to the very small number of VCA patients, the evaluation of proposed mechanisms is better addressed in an experimental model. Multiple groups have used animal models to address some of the relevant unsolved questions in VCA rejection and vasculopathy. Several model designs involving a variety of species are described in the literature. Here we present a reproducible model of VCA heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap in the rat that can be utilized for translational VCA research. This model allows for the serial evaluation of the graft, including biopsies and different imaging modalities, while maintaining a low level of morbidity.

Vascularized composite allograft offers life-altering benefits to transplant recipients, but the biological causes of graft rejection and vasculopathy remain poorly understood. The rodent surgical model presented here offers a reproducible, clinically relevant model of transplantation, allowing researchers to evaluate rejection events and potential therapeutic strategies to prevent their occurrence.

Modelo de colgajo Osteomiocucutáneo de extremidades posteriores modificados en la rata para investigación de compuestos alotransplante de compuesto translacional vascularizado

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity

The spleen is a unique lymphoid organ that plays a critical role in the homeostasis of the immune and hematopoietic systems. Patients that have undergone splenectomy regardless of precipitating causes are prone to develop an overwhelming post-splenectomy infection and experience increased risks of deep venous thrombosis and malignancies. Recently, epidemiological studies indicated that splenectomy might be associated with the occurrence of cardiovascular diseases, suggesting that physiological functions of the spleen have not yet been fully recognized. Here, we introduce a mouse model of vascularized heterotopic spleen transplantation, which not only can be utilized to study the function and behavioral activity of splenic immune cell subsets in different biologic processes, but also can be a powerful tool to test the therapeutic potential of spleen transplantation in certain diseases. The main surgical steps of this model include donor spleen harvest, the removal of recipient native spleen, and spleen graft revascularization. Using congenic mouse strains (e.g., mice with CD45.1/CD45.2 backgrounds), we observed that after syngeneic transplantation, both donor-derived splenic lymphocytes and myeloid cells migrated out of the graft as early as post-operative day 1, concomitant with the influx of multiple types of recipient cells, thus generating a unique chimera. &#160;Despite relatively challenging techniques, this procedure can be performed with &#62;90% success rate. This model allows tracking the fate, longevity, and function of splenocytes during steady state and in a disease setting following a spleen transplantation, thereby offering a great opportunity to discover the distinct role for spleen-derived immune cells in different disease processes.

This protocol details the surgical steps of a mouse model of vascularized heterotopic spleen transplantation, a technically challenging model that can serve as a powerful tool in studying the fate and longevity of spleen cells, the mechanisms of distinct spleen cell populations in disease progression, and transplant immunity.

Un modelo de ratón del trasplante de bazo heterotópico vascularizado para estudiar biología de células del bazo y inmunidad al trasplante

The spleen is a unique lymphoid organ that plays a critical role in the homeostasis of the immune and hematopoietic systems. Patients that have undergone ...

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current limitations in immunosuppression and functional neuromotor recovery. Many animal models have been developed for studying unique features of VCA, but here we present a robust reproducible model of orthotopic hind limb transplant in rats designed to simultaneously investigate both aspects of current VCA limitation: immunosuppression strategies and functional neuromotor recovery. At the core of the model rests a commitment to meticulous, time-tested microsurgical techniques such as hand sewn vascular anastomoses and hand sewn neural coaptation of the femoral nerve and the sciatic nerve. This approach yields durable limb reconstructions that allow for longer lived animals capable of rehabilitation, resumption of daily activities, and functional testing. With short-term treatment of conventional immunosuppressive agents, allotransplanted animals survived up to 70 days post-transplant, and isotransplanted animals provide long lived controls beyond 200 days post-operatively. Evidence of neurologic functional recovery is present by 30 days post operatively. This model not only provides a useful platform for interrogating immunological questions unique to VCA and nerve regeneration, but also allows for in vivo testing of new therapeutic strategies specifically tailored for VCA.

This protocol presents a robust, reproducible model of vascularized composite allotransplant (VCA) geared toward simultaneous study of immunology and functional recovery. The time invested in meticulous technique in a right mid-thigh hind limb orthotopic transplant with hand sewn vascular anastomoses and neural coaptation yields the ability to study functional recovery.

Dar el siguiente paso: un modelo de trasplante de extremidades hindópicos ortotópicos de coaptación neuronal para maximizar la recuperación funcional en rata

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current ...