Vorremmo ringraziare le seguenti persone per il loro contributo a questo progetto: Kakali Sarkar, PhD, Joani Christensen, BS, Kate Buretta, BS, Nance Yuan, BS, William Lehao, MD, Johanna GRAHAMMER, Georg Furtmüller, MD, Erin Rada MD, Mohammed Al-Rakan MD, Karim Sarhane MD, Sami Khalifian, BS, Mao Qi, MD, e Angelo Leto Barone MD, VCA Laboratorio, Dipartimento di Chirurgia Plastica e Ricostruttiva, Johns Hopkins University School of Medicine, Janis Taube, MD, Mark Fischer, MD, Dipartimento di Dermatologia e Patologia, Johns Hopkins University School of Medicine, Sue Eller, Chirurgia Mini-invasiva Training Center, Johns Hopkins University School di Medicina e Cheng-Hung Lin, MD Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, Taiwan. Fonte di finanziamento: Armed Forces Institute of Regenerative Medicine (DoD W81XWH-08-2-0032)

In questa pubblicazione video, sono state effettuate tutte le procedure di polizia in base ad un protocollo animali approvato dalla Institutional Animal Care ed uso commissione Johns Hopkins University (IACUC). 1. Pianificazione preoperatoria <ol><li> Utilizziamo MHC-definito MGH inbred suina in miniatura (15-20 kg) nei nostri studi traslazionali per allotrapianto arto in cui un donatore maschio fornisce arti per due destinatari di sesso femminile (Figura 1). Prima dell&#39;intervento, animali donatori e riceventi sottoposti a valutazione clinica approfondita da un veterinario. </li><li> Per ridurre al minimo l&#39;anestesia e tempo di ischemia, procedure donatori e riceventi sono condotte simultaneamente su tre tavoli operatori in una grande sala operatoria animale dedicata. Il lavoro di squadra e il coordinamento tra i team chirurgici, nonché il personale veterinario sono fondamentali per il successo globale di questa procedura. Il piano chirurgico è discusso con il team veterinario in un incontro formale 1-2 Settimane prima del giorno dell&#39;intervento. </li><li> Un catetere venoso centrale tunnel (7 ve doppio lume Hickman catetere) viene inserito in una vena giugulare esterna o interna di ciascun animale ricevente prima del trapianto di monitorare i livelli farmaco immunosoppressivo e somministrazione endovenosa di immunosoppressiva e / o farmaci immunomodulatori. Questi cateteri sono posti sotto visione diretta attraverso una tecnica cut-down venosa e tunneling posteriore per uscire in alto sul collo dorsale e fissata con monofilamento suture assorbibili e avvolgere bendaggio adesivo intorno al collo. </li><li> Tenere gli animali NPO (nessun cibo solido, ma sono autorizzati ad acqua lib) almeno 12 ore prima dell&#39;intervento chirurgico. </li><li> Il giorno della chirurgia, animali sedare con ketamina 20 mg / kg e xilazina 2 mg / kg IM. </li><li> Inserire un tubo endotracheale di dimensioni adeguate e collegarlo alla macchina per anestesia e ventilazione (mantenuta su isoflurane 0.5-3%) </li><li> Inserire un catetere endovenoso in una vena marginale dell&#39;orecchio e amministrarepeso basa 0,9% soluzione salina durante tutta la procedura. </li><li> Somministrare analgesia pre-emptive (buprenorfina 0,02 mg / kg IV). </li><li> Somministrare profilassi antibiotica (cefazolina 20-25 mg / kg IV) prima della incisione iniziale per il donatore e animali recipienti. </li><li> Utilizzare una tecnica sterile in tutte le procedure sia per i beneficiari e donatori. Ciò include l&#39;uso di strumenti autoclavato o gas sterilizzati, maschere, cappellini testa, camici chirurgici sterili e guanti sterili. Radere l&#39;area di incisione con un clipper e disinfettare con alternanza di soluzione Betadine e alcool. </li></ol> Monitoraggio intraoperatorio: <ol><li> Dopo l&#39;induzione e l&#39;intubazione, mantenere l&#39;anestesia con una miscela di inalazione 0,5-3% isoflurano in ossigeno. </li><li> Monitorare la frequenza cardiaca, pulsossimetria, ECG, end-tidal CO 2 e temperatura rettale continuo e registrare ogni 15 min. </li><li> Prevenire l&#39;ipotermia con una calda coperta ad aria forzata Bair Hugger. </li></ol><ol><li> Posto l&#39;animale donatore in posizione supina sul tavolo operatorio e drappeggio in modo sterile. </li><li> Utilizzare rosso vicino-infrarosso laser angiografia per identificare le navi perforanti per la pelle antero-mediale. Iniettare indocianina verde a circa 0,06 mg / kg diluiti in 2-5 ml di soluzione fisiologica attraverso l&#39;accesso vascolare periferica. Circa 10 secondi più tardi, eseguire 30 sec-2 min di registrazioni vicino infrarosso. Utilizzare il video da queste registrazioni per identificare perforanti. Sulla base perforanti, contrassegnare un&#39;area della pelle (circa 100 cm 2) per il monitoraggio. </li><li> Utilizzare un bisturi per fare una incisione cutanea inguinale in continuità con marcature per l&#39;paddle pelle (Figura 2). </li><li> Identificare vasi femorali e isolarli distalmente al livello dei rami suprageniculate e prossimalmente al livello del legamento inguinale. </li><li> Sezionare la cute e del tessuto sottocutaneo, mentre preserving zona della pala pelle. Suturare i bordi della pelle sottostante muscoli per evitare la contrazione durante la raccolta lembo. </li><li> Eseguire una osteotomia appena sopra il tarso utilizzando una sega alternativo (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA). </li><li> Dividere i muscoli della coscia prossimale utilizzando elettrocauterizzazione. </li><li> Dividere il femore a metà albero lasciando un lembo osteomyocutaneous su un peduncolo vascolare. Il lembo contiene la pagaia pelle, muscoli della coscia sottostanti, ginocchio, femore distale e della tibia prossimale che comprende intatta midollo osseo vascolarizzato con le sue caratteristiche immunologiche uniche. </li><li> Utilizzare cera ossea per ottenere l&#39;emostasi negli ambienti osseo. Osso smussare gli angoli utilizzando ronjeurs in preparazione per il destinatario. </li><li> Mantenere l&#39;innesto perfuso sul suo peduncolo vascolare fino vasi femorali del destinatario vengono preparati (Figura 3). </li><li> Una volta che la dissezione destinatario è completa, legare i donatori vasi femorali come prossimale possibile unnd infondere l&#39;innesto con istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK, Custodiol, Newtown PA) prima del trapianto. NOTA: L&#39;arto donatore viene trapiantato sul lato controlaterale del destinatario ovvero l&#39;arto donatore sinistra per il lato destro del destinatario e l&#39;arto donatore destra per il lato sinistro del destinatario). </li><li> Euthanize il maiale donatore subito dopo la raccolta la seconda parte posteriore con 100 mg / kg IV sodio pentobarbital. La morte è confermata dal personale veterinario al protocollo stabilito. </li></ol> 4. Procedura destinatario (Hind Limb allotrapianto) <ol><li> Avviare l&#39;induzione e l&#39;intubazione destinatario immediatamente dopo l&#39;incisione donatore iniziale per consentire la preparazione di vasi riceventi mentre l&#39;arto donatore viene raccolto. Questo elimina il tempo di attesa inutili e riduce il tempo di anestesia totale per il donatore e riceventi. </li><li> Posizionare la supina animale con una rotazione di 30 ° sul lato operativo da destinare all&#39;assegnazioneL&#39;esposizione w del lato dorsolaterale. </li><li> Effettuare una incisione inguinale ed esporre i vasi femorali; isolarli distalmente al livello dei rami suprageniculate e prossimalmente al livello del legamento inguinale. </li><li> Creare una tasca sottocutanea dall&#39;inguine alla parete addominale dorsolateral del kit di innesto (figura 4). </li><li> Legare le navi cedenti e lavare l&#39;innesto con HTK. </li><li> Eseguire l&#39;inserto innesto in maniera invertita: Hanno la paletta pelle rivolta verso dorsolaterale per consentire il monitoraggio facile immunitario in posizione eretta e le estremità tagliate dei vasi femorali fronte caudale per consentire end-to-end anastomosi vascolari senza alcuna tensione sui vasi ( Figura 5). </li><li> Se disponibile, utilizzare un dispositivo di aggancio vascolare (Synovis, St Paul MN) per anastomosi venose (formato 2.5-3.5 è adatto per 10-20 kg animali). Ciò riduce significativamente il tempo di ischemia rispetto ai metodi convenzionali. </li><li> Eseguire anast arteriosaomoses utilizzando una tecnica di sutura convenzionale con 9-0 sutura (Synovis, St Paul MN) </li><li> Dopo pervietà vascolare è confermata, fissare l&#39;innesto in posizione con suture 3-0 PDS (Figura 5). I muscoli dell&#39;innesto sono suturate ai muscoli della parete addominale. I muscoli innesto non devono essere suturati i muscoli della coscia destinatari poiché può essere deleterio con i movimenti intorno alla gabbia. </li><li> Estrinsecare la paletta pelle sul lato dorsolaterale per il monitoraggio immunitario (Figura 6) e suturare alla pelle adiacente utilizzando 3-0 Vicryl suture sottocutanee e 4-0 monofilamento suture assorbibili pelle interrotti. </li><li> Chiudere la pelle dell&#39;inguine a strati con 3-0 punti di sutura Vicryl sottocutanei e 4-0 monofilamenti assorbibili suture cutanee interrotti. </li><li> Posizionare un cerotto 50-100 mcg / hr fentanil per l&#39;analgesia post-operatoria. </li><li> Dopo il trapianto allogenico arti posteriori, rispedire l&#39;animale verso la sua penna, una volta sveglio e respirare comodamente sul proprio.</li>
</ol>

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K., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+composite+tissue+allotransplant+model+for+preclinical+hand+transplant+studies.">Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies.</a> Microsurgery. 20, 400-406 (2000).</li><li>Ust&#252;ner, E. T., Zdichavsky, M., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+composite+tissue+allograft+survival+in+a+porcine+model+with+cyclosporine/mycophenolate+mofetil+therapy.">Long-term composite tissue allograft survival in a porcine model with cyclosporine/mycophenolate mofetil therapy.</a> Transplantation. 661, 581-587 (1998).</li><li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation:+a+translational+trial+in+swine.">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Storicamente, il protocollo trapianto dell&#39;arto posteriore eterotopico inclusa esteriorizzazione di una pagaia pelle alla parete addominale ventrale e le navi sono stati anastomosi in modo end-to-side (Hettiarachty 2004). Tuttavia, nel nostro metodo modificato, un lembo invertito insetting e end-to-end anastomosi portare la paletta pelle più lateralmente e quindi facilita il monitoraggio immunitario in posizione eretta dell&#39;animale. L&#39;identificazione dell&#39;arteria surale e le zone di massima perfusione u...

Vascolarizzato composito allotrapianto (VCA), come mani e viso trapianti sono ormai una realtà clinica con numerose mani e viso trapianti eseguiti in tutto il mondo 12. Nonostante il fatto che i risultati iniziali e intermedi sono favorevoli e altamente incoraggiando 2, il requisito di immunosoppressione multidrug cronica continua a limitare la sua vasta applicazione clinica. I progressi in modelli murini di VCA compreso anastomosi super-microchirurgia e tecniche gemelli senza sutura 13, 3 hanno aperto la strada a una migliore comprensione di alloimmune risposte in VCA. Miriadi di protocolli immunomodulatori sono stati proposti per le applicazioni cliniche basate sulla nostra migliore comprensione dei meccanismi immunitari in VCA, ma hanno bisogno di essere convalidati in un grande modello animale che sarebbe ragionevolmente predittiva delle loro prestazioni negli esseri umani 7. Sulla base di somiglianze fisiologiche e immunologiche tra i sistemi di organi umani e suini <sup&gt; 6, i modelli VCA suina possono essere considerate alternative affidabili e convenienti a canino 9 e modelli di primati non umani 1. Questo articolo fornisce una panoramica dettagliata della metodologia utilizzata nel nostro eterotopico arto posteriore modello suina trapianto MHC-definito, che serve come basi per i nostri attuali e future strategie di immunomodulazione volte ad indurre tolleranza immunitaria al VCA e quindi ampliando la sua applicazione clinica. Utilizziamo i suini consanguinee ben caratterizzati allevati a omozigosi al leucociti suina antigene locus specifico per il loro uso nel trapianto-correlata di ricerca 11. Alziamo un lembo osteomyocutaneous vascolarizzato basato su vasi femorali. Il lembo contiene intatto midollo osseo vascolarizzato nel femore distale e della tibia prossimale. La pelle della coscia anteromedial è anche incluso l&#39;innesto e viene esteriorizzato all&#39;aspetto dorsolaterale del destinatario animale per il monitoraggio immunitario del componente più immunogenica of VCA. Posizionamento dorsolaterale facilita esame clinico in piedi e seduti posizioni e inoltre mantiene la pelle allotrapianto relativamente pulito. Ustener et al. Ha introdotto uno dei primi modelli di grandi dimensioni traslazionali animale in VCA di trapianto radiali lembi forelimb osteomyocutaneous nei suini da allevamento outbred 15. Il gruppo ha utilizzato questo modello per dimostrare per la prima volta che il rigetto acuto in VCA che comprendeva la componente della pelle altamente immunogeno potrebbe essere ritardata e trattati con una strategia clinicamente rilevante, senza significative complicazioni specifiche del farmaco e gli effetti collaterali. I risultati favorevoli ottenuti in questo studio successivamente costruito un passo fondamentale nella progettazione di cicli di terapia per il trapianto ricostruttiva umano. Anche se questi modelli VCA maiale presto erano adatte per lo sviluppo di protocolli per prevenire il rigetto della pelle, dei muscoli, ossa, nervi e vasi che mancavano strutture specializzate quali articolare cartilagE e membrane sinoviali delle articolazioni. Ulteriori sforzi sono stati concentrati sulla cifra compresa mediale dell&#39;animale, che ha richiesto full-length posizionamento cast per impedire innesto dislocazione 14. Sebbene adatto per indagare il rifiuto di tutte le principali componenti del trapianto dell&#39;arto, uno dei principali limiti di questo modello era post-trapianto difficoltà ambulatoriale a causa di lanciare il posizionamento. Così, eterotopici modelli arto allotrapianto suini, composta da tibia, perone, ginocchio, femore distale del muscolo circostante, e una pagaia pelle, sono stati creati per studiare soprattutto gli aspetti immunologici della VCA, consentendo all&#39;animale di deambulare liberamente dopo l&#39;intervento con il minimo morbidit 8 . Lo sviluppo di ben caratterizzati suini consanguinee SLA definiti attraverso il lavoro pionieristico del dottor David H. Sachs ha portato ad una nuova era della ricerca traslazionale VCA. Utilizzando un arto posteriore modello di trapianto eterotopico in un ambiente antigene mancata corrispondenza minore, Mathes et al. 10 hanno dimostrato la sopravvivenza indefinita dei componenti muscolo-scheletrici, con un breve ciclo di trattamento con ciclosporina. La sopravvivenza componente pelle, tuttavia, è stato prolungato solo rispetto ai controlli senza trattamento. La perdita della componente pelle dell&#39;innesto è stata attribuita ad una risposta immunitaria isolato e altamente vigorosa, in particolare, per l&#39;epidermide. Allo stesso modo, utilizzando i maiali completamente non corrispondenti con deplezione delle cellule T, un breve corso di ciclosporina e citochine mobilitato donatori cellule mononucleari del sangue periferico indotto tolleranza solo ai componenti muscolo-scheletriche e la componente pelle è stata ancora respinta 5. Questo fenomeno, chiamato &#39;tolleranza dividere&#39;, ha portato un cambiamento di paradigma nella ricerca VCA con una maggiore attenzione alla componente della pelle altamente immunogenico, che è parte integrante della maggior parte dei trapianti ricostruttivi eseguiti fino ad oggi. In questo modello modificato, utilizziamo anastomosi end-to-end ligating destinatario arteria femorale e ruotandola cefalica (Figura 1). Questo non solo riduce il tempo di ischemia, consentendo l&#39;uso di un dispositivo di accoppiamento convenzionale, ma anche diminuisce le probabilità di guasto per anastomosi. Non abbiamo osservato eventi ischemici seguenti legatura dell&#39;arteria femorale nei nostri destinatari indicando che la circolazione collaterale era sufficiente a fornire vascolarizzazione alla gamba nativo. Inoltre, in questo metodo modificato, il componente pelle esteriorizzato si mobilita basato sui vasi perforanti sottostanti ed è posizionato lateralmente (figura 1) in contrasto con una posizione all&#39;inguine ventrale nel modello tradizionale 10. Ciò consente una facile visualizzazione dell&#39;innesto per il monitoraggio immunitario in piedi o seduta posizione dell&#39;animale. Quindi, una grande modello animale affidabile e riproducibile è essenziale per studiare strategie induzione di tolleranza verso la componente pelle di VCA e di sviluppare nuovi noninvasive strategie di monitoraggio del sistema immunitario per una migliore previsione della sopravvivenza del trapianto.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HTK</td>
			<td>Custodial</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electric Pen Drive</td>
			<td>Synthes, Westchester PA </td>
			<td>05.001.011 </td>
			<td>Reciprocating saw</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vascular Coupling device</td>
			<td>Synovis, Newtown PA</td>
			<td>21003B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (vca) research

Vascolarizzato composito allotrapianto (VCA), come mani e viso trapianti rappresentano una valida opzione di trattamento per i complessi traumi muscoloscheletrici e perdita di tessuto devastante. Nonostante i risultati funzionali favorevoli e molto incoraggianti precoce e intermedi, il rifiuto della componente pelle altamente immunogenica di un VCA e potenziali effetti negativi di immunosoppressione multi-farmaco cronica continuano ad ostacolare diffusa applicazione clinica della VCA. Pertanto, la ricerca in questo campo romanzo deve concentrarsi su studi traslazionali relative a caratteristiche immunologiche uniche di VCA e di sviluppare nuove strategie immunomodulatori per immunomodulazione e induzione della tolleranza seguenti VCA senza la necessità di immunosoppressione a lungo termine. Questo articolo descrive una traslazione grande modello animale affidabile e riproducibile di VCA che si compone di un lembo osteomyocutaneous in un suino allotrapianto eterotopico arto posteriore MHC-definito. BriEfly, una pagaia pelle ben vascolarizzato, è identificato nella regione antero-mediale della coscia usando vicino angiografia laser a infrarossi. I muscoli sottostanti, ginocchio, femore distale e della tibia prossimale sono raccolte su un peduncolo vascolare femorale. Questo allogenico può essere considerato sia un VCA e vascolarizzato trapianto di midollo osseo, con le sue caratteristiche uniche privilegiati immuni. L&#39;innesto viene trapiantato in una tasca sottocutanea addominale nell&#39;animale destinatario con un componente pelle esteriorizzato alla regione dorso laterale per il monitoraggio immunitario. Tre squadre chirurgiche lavorano contemporaneamente in modo ben coordinato per ridurre l&#39;anestesia e tempi di ischemia, migliorando così l&#39;efficienza di questo modello e di ridurre i potenziali fattori confondenti in protocolli sperimentali. Questo modello serve come basi per le future strategie terapeutiche volte a ridurre e, potenzialmente, eliminando la necessità di immunosoppressione cronica multi-droga in VCA.

Ventiquattro i trapianti degli arti posteriori eterotopici suina SLA definiti sono state eseguite utilizzando la nostra tecnica modificata con un tempo di ischemia media di 78 minuti (range: 62-94 min). Innesto inserto e dorsolaterale posizionamento paddle pelle sono stati raggiunti senza difficoltà in tutti gli animali. Vicino infrarosso laser angiografia ha mostrato eccellente perfusione innesto in tutti i destinatari. I primi dodici anastomosi venose sono state eseguite utilizzando tecniche di sutura convenzionali m...

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A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Vascolarizzato Composite Allotransplantations (VCA) sono diventati una realtà clinica. Tuttavia, la vasta applicazione clinica di VCA è limitata dalla immunosoppressione multi-farmaco cronica. Gli autori presentano un modello animale grande affidabile e riproducibile per tradurre nuove strategie immunomodulatori che possono minimizzare o potenzialmente eliminare la necessità di immunosoppressione in VCA.

Un modificata eterotopica suina Hind Arto Trapianto Modello traslazionale vascolarizzato composito allotrapianto (VCA) La ricerca

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

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Research

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A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

12.4K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine.  Vascolarizzato Composite Allotransplantations (VCA) sono diventati una realtà clinica. Tuttavia, la vasta applicazione clinica di VCA è limitata dalla immunosoppressione multi-farmaco cronica. Gli autori presentano un modello animale grande affidabile e riproducibile per tradurre nuove strategie immunomodulatori che possono minimizzare o potenzialmente eliminare la necessità di immunosoppressione in VCA. 