Conversaciones útiles con ISJA de Feijter y Matt Baker Se agradecen.

1. Síntesis de los Sensores <ol><li> En la siguiente sección, se proporciona un procedimiento para la conjugación de indicadores de pH a dendrímeros PAMAM. El mismo protocolo se puede aplicar con modificaciones mínimas a dendrímeros de amina de soporte de alternativas. 5,17,13,14 dendrímeros y colorantes comercialmente disponibles pueden ser utilizados sin más purificaciones. </li><li> Disolver el dendrímero en DMSO anhidro (concentración final 50 mM). Preparar soluciones madre 10 mM de fluoresceína-NHS y tetrametil-rodamina-NHS (TMR) en DMSO anhidro. </li><li> Añadir a la solución dendrímero la cantidad deseada de fluoresceína y TMR. La relación molar en la mezcla reflejará la cantidad de colorantes cargados en el dendrímero. Típicamente 1 ml de solución de dendrímero PAMAM G4 en un tubo de microcentrífuga se hace reaccionar con 8 eq (40 mu l) de fluoresceína y 8 eq (40 mu l) de TMR. Se agita la solución a temperatura ambiente durante 12 h. </li><li> Diluir 1:10 con agua desionizada y cargar la reacciónmezcla en una bolsa de diálisis (MWCO = 10 kDa). Se dializa durante 24 horas frente a agua desionizada reemplazar con frecuencia el agua en el depósito. </li><li> Transfiera la solución a un vial y se liofiliza durante 24 horas. Un polvo de color púrpura se debe obtener. Peso del sólido obtenido y se disuelven en agua MilliQ a una concentración final de 10 mM. Alícuota de la solución y se almacenan a -20 ° C. </li></ol> 2. In Vitro de pH Las mediciones <ol><li> Para la calibración in vitro preparar una solución 500 nM de dendrímero en PBS (fosfato 2 mM) en una cubeta de cuarzo. Se recomienda el uso de un tampón de PBS muy diluidas (2 mM) para evitar cambios bruscos de pH durante la valoración. </li><li> Medir los espectros de emisión de la fluoresceína (exc 488 nm) y TMR (exc 550 nm) y optimizar la configuración ópticas del fluorímetro para lograr una buena relación señal-ruido. </li><li> Realizar una valoración del pH mediante la adición de pequeñas cantidades de NaOH 0,1 N y HCl 0,1 N. Después de cada adición agitar la cubetapara mezclar, esperar 1 min para el equilibrio y medir el pH por medio de un microelectrodo de pH. Espectros de emisión de la fluoresceína y TMR debe registrarse para cada paso sin ningún cambio en la configuración óptica. </li><li> Trazar la intensidad de fluorescencia vs pH para la titulación. La señal de rodamina no debería verse afectada por el pH (&lt;10%). La señal de fluoresceína debe ser una curva sigmoidal y debe ser equipado con un modelo de una sola unión con pK = 6,4. </li></ol> 3. Cultivo celular y electroporación <ol><li> Cultivar las células HeLa en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina (Invitrogen). Mantener el cultivo de células a 37 ° C en el 5% de CO 2 humidificado atmósfera. </li><li> Para la electroporación dendrímero, cuando las células son confluentes, extraiga el soporte y lavar las células mediante DPBS (fosfato de Dulbecco-Buffered Saline). Retire el DPBS y añadir tripsina-EDTA. Neutralizar el tryppecar mediante la adición de un medio que contiene suero, pero no antibióticos. Centrifugar a 900-1.200 rpm durante 2 min a temperatura ambiente. Retire el papel y enjuague el pellet con DPBS. </li><li> Contar las células y tomar 4 * 10 6 células. Centrifugar a 1.200-1.500 rpm durante 2 min a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender el sedimento de células en 200 l de tampón de microporos (proporcionado por el fabricante microporator) y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir solución acuosa dendrímero en células resuspendidas. La cantidad de dendrímero requerido por muestra es dependiente del tipo PAMAM (típicamente 250 nM para catiónico y 2 M durante dendrímeros neutros). </li><li> Añadir tampón de electroporación (proporcionado por el fabricante microporator) en un tubo de microporos. Pipetear las células y los dendrímeros mezclas con punta de electroporación de 100 l de volumen de tamaño. Inserte la pipeta microporator en la estación de la pipeta. Establecer la condición de impulsos para microporación: tensión de impulso = 1005 V; wid pulsoth = 35 ms, el número de pulsos = 2. </li><li> Después de que las células de transferencia de impulsos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar las células durante 5 min a 1200 rpm para eliminar el exceso de dendrímero en el medio. Placa de 10 l de células sometidas a electroporación en 35 mm platos con fondo de cristal (Willco plato GWSt-3522) con un nuevo medio w / o antibióticos. </li></ol> 4. Detección de pH en las células vivas HeLa <ol><li> Celdas de imagen con un microscopio confocal de 12 horas después de la electroporación. </li><li> Conjunto de filtros estándar de fluoresceína y rodamina se puede utilizar. Si los filtros sintonizables están disponibles un conjunto de canal verde 500-550 nm y un canal rojo de 580 nm a 650 nm. La excitación a 488 nm es óptimo para la fluoresceína mientras rodamina podría ser reflejado ya sea con el 543nm o la línea de láser 561. </li><li> Enfoque la muestra y ajustar la energía láseres y detectores de ganar para maximizar la relación señal-ruido. Si la electroporación fue el de células exitosos deben ser fluorescentes brillantes en ambos canales. Lala localización depende del tamaño y la carga del dendrímero utilizado. A menudo, algunos de localización lisosomal (pequeñas vesículas perinuclear) está presente debido a la endocitosis o la compartimentación. Si la localización lisosomal es predominante, es decir, la mayor parte de la fluorescencia se localiza en el interior de las vesículas y se observa mala señal en el citosol, esto significa la toxicidad y la medición deben ser desechados. Adquirir secuencialmente los dos canales, si es necesario adquieren varias imágenes y un promedio de las imágenes para mejorar la calidad de la imagen. </li><li> Para abrazadera de calibración de pH celular utilizando tampones con ionóforos a diferentes pH y adquirir al menos 20 células por pH como se describe anteriormente. Para una descripción detallada del procedimiento y la composición de los tampones consulte Bizzarri y compañeros de trabajo. 16 Sugerimos para medir al menos 5 puntos de pH = 5,5 a pH = 7,5. pH inferior a 6 son tóxicos para las células, pero tolerada por poco tiempo, le sugerimos adquirir las imágenes lo más rápido posible. Si las célulasdemostrar signos de apoptosis, desechar las células y se reinicie. </li><li> Utilice ImageJ o software similar para el análisis de datos. Importe las imágenes del canal verde y rojo, restar fondo y crear un pixel por pixel ratio de la imagen con la herramienta &quot;Calculadora de la imagen&quot;. </li><li> Dibujar una región de interés (ROI) seleccionar la celda deseada y medir la proporción de verde a rojo intracelular. Analizar todas las imágenes obtenidas y luego trazar la relación frente al pH. En el rango de 5,5 a 7,5 la tendencia debe ser lineal. El ajuste lineal de los puntos obtenidos dará la curva de calibración que se utiliza para convertir la relación de verde a rojo a pH. </li><li> Como un control adicional adquirir varias células no tratadas (no ionóforos) y tratar de calcular el pH con la curva de calibración obtenida. Se debe obtener un valor de entre 7,2 y 7,4. </li></ol> 5. In Vivo Preparación de la muestra <ol><li> Los experimentos se realizaron en C57Bl/6J (hombres y mujeres) entre postnatal day 28 y 70. Anestesiado el ratón con una inyección intraperitoneal de uretano (es decir, carbamato de etilo) (20% w / v en solución salina fisiológica, 20 mg / kg de uretano). Los animales fueron sacrificados después de experimentar con una sobredosis de uretano seguido de una inyección intracardiaca de la misma anestesia. </li><li> Realice una inyección intramuscular de dexametasona fosfato de sodio (2 mg / kg de peso corporal) para reducir la respuesta al estrés cortical y el edema cerebral durante la cirugía. </li><li> Afeitarse la cabeza del animal y aplicar 2,5% en gel de lidocaína al cuero cabelludo. </li><li> Utilice unas tijeras para cortar el colgajo de piel que cubre el cráneo de ambos hemisferios </li><li> Lave el hueso expuesto con solución salina y retire suavemente el periostio utilizando fórceps. Esto proporcionará una mejor base para el pegamento y el cemento dental que se adhieran con. </li><li> Aplique un poste de acero de cabeza a medida con una cámara de imágenes central y pegarlo con cianoacrilato en un plano aproximadamente paralelo al cráneo sobre la región cortical del il interés y fijar en su lugar con cemento dental blanca (Paladur). </li><li> Fijar la cabeza del ratón con el fin de realizar una craneotomía de 2-3 mm de diámetro perforado más de la región de interés. </li><li> Trate de minimizar el calentamiento de la corteza durante la cirugía, desgarros durales o sangrado. </li><li> Mantenga la corteza superfused con ACSF estéril (NaCl 126 mM, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO 3, 2,4 mM CaCl 2, glucosa 15 mM, 1,2 mM HEPES en H 2 O destilada , pH = 7,4). </li></ol> 6. imágenes pH en cerebro de ratón <ol><li> Durante la respiración animal ayuda experimento proporcionar O aire enriquecido-2. El oxígeno es enriquecido hasta el 80%. Presión parcial de O2 y el flujo se ajusta con frecuencia para obtener una ayuda a la respiración adecuada. Mantener la temperatura constante del cuerpo a 37 ° C con una manta de calefacción realimentación controlada. </li><li> Fijar el animal a través del poste de acero bajo el objetivo de una foto de dosconfiguración n de imagen. </li><li> Con el fin de inyectar el sensor en la corteza cerebral cargar una pipeta de vidrio que contiene un electrodo AgCl (diámetro de la punta de 4 mm) con la solución de dendrímero (1 M). El electrodo permitirá grabar los potenciales de campo extracelulares. </li><li> Con una configuración de microinyección insertar la pipeta en la corteza a unos 150 m de profundidad. Inyectar durante 1-2 min a una presión de 0,5 psi. </li><li> Optimizar la configuración óptica para obtener imágenes. Potencia del láser debe ser ajustado para minimizar fotoblanqueo y fotodaño. Típicamente la potencia del láser empleado es de alrededor de 20 mW y la ganancia de PMT se mantuvo constante a 667 V ya calibraciones anteriores mostraron que esta tensión ofrece la mejor relación S / N. </li><li> Para imágenes excitar el sensor a 820 nm y detectar simultáneamente fluoresceína y rodamina a través de filtros de fluorescencia FITC y TRITC estándar. </li><li> Para el tiempo de las mediciones resueltas adquieren serie lapso de tiempo a 2 Hz. </li><li> Para la corrección de fondo adquiere un marco oscuro con la laser obturador cerrado para medir el ruido térmico promedio que surge en los PMT y el pedestal normalmente añadidos por el sistema electrónico. </li><li> Para el análisis de los datos siga el mismo procedimiento indicado en el apartado 4. </li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure+termination+by+acidosis+depends+on+ASIC1a.">Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a.</a> Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).</li></ol>

Por defecto: Los autores tienen nada que revelar.

Los pasos críticos para formación de imágenes de pH éxito con sensores basados ​​en dendrímeros son: i) la selección del andamio dendríticas correcta y el número de indicadores conjugados a la misma y ii) la optimización de protocolo de entrega sensor en células o in vivo. El procedimiento de síntesis es bastante fácil y se puede aplicar prácticamente a cada polímero hiperramificado amina-cojinete. Los sensores se pueden obtener de dendrímeros disponibles comercia...

El uso de moléculas fluorescentes para etiquetar moléculas biológicamente relevantes específicos ha cambiado completamente la forma en que estudiamos sistemas biológicos. Widefield y microscopía confocal permitió un tiempo real de alta resolución de visualización de procesos biológicos y en la actualidad se encuentran entre las técnicas más populares para estudiar los eventos biológicos in vitro, en células e in vivo. 1 Una mejora relevante estuvo representado por el desarrollo de indicadores de fluorescencia , es decir, colorantes cuya fluorescencia es dependiente de la concentración de una entidad molecular específica. indicadores de pH y calcio, en particular, han tenido un impacto dramático en el estudio de la fisiología de las células debido a la enorme relevancia de H + y Ca 2 + iones en la biología. 2,3 Sin embargo, la mayoría de los tintes de detección presentan varias limitaciones intrínsecas relacionadas con su comportamiento pequeña molécula, tales como: i) dificultades en targeti subcelularng; ii) escasa solubilidad en agua y por lo tanto pobre biocompatibilidad;. y iii) la fuga de células y por lo tanto la falta de tiempo la capacidad de time-lapse 4 Por otra parte, la señal de muchas sondas no se puede corregir para la dependencia de la concentración de colorante (no radiométrica de imágenes) y, por lo tanto, una medida absoluta en células o in vivo no es posible. Recientemente hemos descrito una metodología sencilla y eficaz para superar estas limitaciones, basado en la conjugación de los tintes de detección en un andamio dendrímero. 5 Los dendrímeros son polímeros hiperramificados monodispersas con propiedades muy atractivas para aplicaciones biológicas. 6 En particular, varias arquitecturas dendríticas se han desarrollado y utilizado de drogas 7 y la entrega de genes. 8 Sólo muy recientemente varios grupos comenzaron a explorar el potencial de estas moléculas como andamio para dispositivos de detección. 9,10,11 Anteriormentese describe una ruta sintética fácil hacia la funcionalización de diferentes poliamidoamina (PAMAM) andamios sobre la base de ésteres activados-NHS. 12 Los conjugados se pueden obtener en una sola etapa por medio de diálisis como sólo la purificación. Curiosamente este enfoque se puede aplicar fácilmente a una variedad de andamios dendríticas o poliméricos. 13,14 Para lograr dendrímeros de formación de imágenes radiométricas fueron doble marcado con dos conjuntos de colorantes: i) un indicador de pH (es decir, fluoresceína) y ii) un resto fluorescente independiente del pH (es decir, la rodamina). Esto nos permitió realizar imágenes pH preciso como el cociente entre la fluoresceína y rodamina sólo depende del pH y no más de la concentración de la sonda. Otro enfoque interesante para este problema está representada por el uso de sondas basadas en toda la vida. 15 Como el tiempo de vida no depende de la concentración de la sonda estas mediciones no necesitan una corrección radiométrica. Sin embargo, LIFmediciones Etime requieren una configuración de instrumento más complicado y su resolución temporal es sub-óptimo para los procesos fisiológicos rápidos, lo que limita sus posibles aplicaciones. Con el fin de realizar las imágenes de intracelular, la sonda tiene que ser entregado a través de la membrana plasmática en el citosol. Como los dendrímeros no están membrana permeable debido a su tamaño y la hidrofilia, la administración intracelular podría lograrse mediante electroporación. Por medio de esta técnica, ampliamente utilizado en biología para la transfección, macromoléculas marcadas se pueden entregar de manera efectiva en las células para realizar las imágenes de alta calidad. Por otra parte, con la electroporación las complicaciones relacionadas con la endocitosis dendrímero se pueden evitar como las macromoléculas son entregados directamente al citoplasma. Curiosamente después de electroporación diferentes dendrímeros muestran localizaciones distintas dentro de las células, incluso en ausencia de una secuencia de acceso específica. 5 Este passive focalización, sólo se debe a las propiedades físico-químicas del dendrímero, se puede aprovechar para lograr imágenes pH-orgánulo específico. Radiométrico de imágenes se puede realizar utilizando microscopía confocal. Fluoresceína y rodamina, covalentemente conjugado con el andamio dendríticas, se obtuvieron imágenes por separado y una relación de mapa píxel por píxel se ha creado. Se informó de varios procedimientos para controlar el pH intracelular en las células vivas mediante ionóforos. Los ionóforos son pequeñas moléculas hidrófobas capaces de transportar iones a través de la membrana plasmática; ionóforos de iones H +, tales como nigericina, están disponibles y se puede utilizar para calibrar sensores basados ​​en dendrímeros 16 Estas mediciones revelaron una respuesta lineal a pH de manera similar a lo observado. in vitro. Sobre la base de que el pH intracelular de calibración podría ser medido con precisión. Estas mediciones demostraron que el sensor basado en dendrímero puede ser una herramienta valiosa en el estudio de H + homeostasis en las células vivas y los procesos patológicos que implican un mal funcionamiento de regulación de pH. Recientemente hemos demostrado que los sensores de pH basados ​​en dendrímeros también se pueden aplicar in vivo, la realización de imágenes de pH en el cerebro de los ratones anestesiados. 17 Debido a la complejidad del entorno de los tejidos vivos de una alta calidad en la detección in vivo es técnicamente difícil. Aquí se muestra una descripción detallada del procedimiento experimental para obtener imágenes de pH in vivo con énfasis de los temas cruciales que deben abordarse para realizar una imagen precisa del pH en el cerebro. Microscopía de dos fotones ha sido empleado por dos razones principales: i) el uso de la luz infrarroja permite superar la falta de penetración en el tejido de la microscopía confocal estándar; ii) la amplia absorción de dos fotones de fluoresceína y rodamina permite evitar su excitación simultánea del complicaciones relacionadas con el uso de dos longitudes de onda para la excitación. mediciones de pH en el cerebro de ratones fueronllevaron a cabo con éxito; sensores responden fácilmente a la hipoxia induce el cambio de pH en el espacio extracelular del cerebro. Estas mediciones demuestran que los indicadores basados ​​en dendrímeros pueden ser utilizados con éxito para resaltar cambio fisiológico y patológico de pH in vivo en un modelo animal.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
		 <td>Company</td>
		 <td>Catalogue number</td>
		 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
	 <tr>
	 <td>PAMAM G4</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>412449</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Carboxyfluorescein NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1311</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>TMR NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1171</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>DMSO</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>D8418</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Dyalsis bags</td>
		 <td>Spectrum Labs</td>
		 <td>132117</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>WillCo Dishes</td>
		 <td>WillCo Wells</td>
		 <td>GWSt-3512</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Urethane</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>U2500</td>
		 <td></td>
	 </tr>
 </tbody>
</table>

synthesis, cellular delivery and in vivo application of dendrimer-based ph sensors

El desarrollo de indicadores fluorescentes representó una revolución para las ciencias de la vida. Genéticamente codificados y fluoróforos sintéticas con capacidades de detección permite la visualización de las especies de importancia biológica con alta resolución espacial y temporal. Los colorantes sintéticos son de particular interés, gracias a su elevada capacidad de ajuste y la amplia gama de analitos medibles. Sin embargo, estas moléculas sufren varias limitaciones relacionadas con la pequeña molécula de la conducta (mala solubilidad, las dificultades en la selección, a menudo no hay imagen radiométrica permitido). En este trabajo presentamos el desarrollo de sensores basadas en dendrímeros y presentamos un procedimiento para la medición de pH in vitro, en células vivas y en vivo. Elegimos dendrímeros como plataforma ideal para nuestros sensores por sus muchas propiedades deseables (monodispersidad, propiedades sintonizables, multivalencia) que los de un andamio ampliamente utilizado por varios dispositivos biomédicos hechos. La conjugación del pH fluorescenteindicadores al andamio dendrímero condujeron a una mejora de sus actuaciones de detección. En particular, los dendrímeros presentan reduce las fugas de células, mejorando la orientación intracelular y permitir mediciones radiométricas. Estos nuevos sensores se emplean con éxito para medir el pH en las células HeLa que viven e in vivo en cerebro de ratón.

La figura 1 muestra una representación esquemática de la conjugación de detección de colorantes a diferentes andamios dendríticas. Los indicadores resultantes se pueden obtener en una etapa sintética fácil a partir de productos disponibles comercialmente. -Dendrímeros que llevan amina se hacen reaccionar con colorantes activada con NHS en DMSO y se purificaron por diálisis. Este procedimiento general ha sido ya utilizado con éxito para el etiquetado de varios dendrímeros: i) generación del d...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Sensores de fluorescencia son herramientas poderosas en ciencias de la vida. Aquí se describe una metodología para sintetizar y utilizar sensores fluorescentes basadas en dendrímeros para medir el pH en las células vivas e in vivo. El andamio dendríticas mejora las propiedades de los tintes fluorescentes conjugados que conducen a propiedades mejoradas de detección.

Síntesis, Entrega y Celular<em&gt; En vivo</em&gt; Aplicación de sensores de pH basadas en dendrímeros

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Unit 1

Acid–Base Titration

Acid-base and Solubility Equilibria

SCIENTISTS IN ACTION

11.6K vistas.  Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR.  Sensores de fluorescencia son herramientas poderosas en ciencias de la vida. Aquí se describe una metodología para sintetizar y utilizar sensores fluorescentes basadas en dendrímeros para medir el pH en las células vivas e in vivo. El andamio dendríticas mejora las propiedades de los tintes fluorescentes conjugados que conducen a propiedades mejoradas de detección. 

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Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. The synthesis of hypervalent iodonium alkynyl triflates can be facile, but difficulties stem from their isolation and reactivity. In particular, the necessity to use filtration under inert atmosphere at -45 &deg;C for some HIATs requires special care and equipment. Once isolated, the compounds can be stored and used in reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. 
The evidence for cyanocarbene generation is shown by visible extrusion of dinitrogen as well as the characterization of products that occur from O-H insertion, sulfoxide complexation, and cyclopropanation. A side reaction of the cyanocarbene formation is the generation of a vinylidene-carbene and the conditions to control this process are discussed. There is also potential to form a hypervalent iodonium alkenyl triflate and the means of isolation and control of its generation are provided. The O-H insertion reaction involves using a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and methanol as solvent/substrate. The sulfoxide complexation reaction uses a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and dimethyl sulfoxide as solvent. The cyclopropanations can be performed with or without the use of solvent. The azide source must be tetrabutylammonium azide and the substrate shown is styrene.

Herein is described the synthesis, isolation, and reactions of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) with azides to generate cyanocarbenes. The procedures will involve air-sensitive and cryogen techniques, including cold filtration under an inert atmosphere. Handling and safety of the synthesized compounds will also be discussed.

Síntesis de hipervalente iodonio Alquinilo triflatos para la Aplicación de Generación Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Investigación

Química

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

Evaluación de dopado con boro Diamond Electrodo Calidad y Aplicación a<em&gt; In Situ</em&gt; Modificación del pH local por agua Electrólisis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and engineers. Growth of such anisotropic nanocrystals through a simple chemical method is a challenging task. In this study, we fabricate discotic nanodisks of zirconium phosphate [Zr(HPO4)2&#183;H2O] as a model material using hydrothermal, reflux and microwave-assisted methods. Growth of crystals is controlled by duration time, temperature, and concentration of reacting species. The novelty of the adopted methods is that discotic crystals of size ranging from hundred nanometers to few micrometers can be obtained while keeping the polydispersity well within control. The layered discotic crystals are converted to monolayers by exfoliation with tetra-(n)-butyl ammonium hydroxide [(C4H9)4NOH, TBAOH]. Exfoliated disks show isotropic and nematic liquid crystal phases. Size and polydispersity of disk suspensions is highly important in deciding their phase behavior.

A two dimensional model material of discotic zirconium phosphate was developed. The inorganic crystal with lamellar structure was synthesized by hydrothermal, reflux, and microwave-assisted methods. On exfoliation with organic molecules, layered crystals can be converted to monolayers, and nematic liquid crystal phase was formed at sufficient concentration of monolayers.

Síntesis y exfoliación de Discotic circonio fosfatos para obtener cristales líquidos coloidal

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Síntesis de Proteínas bioconjugados<em&gt; vía</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). Their purpose is to enhance the relaxation rate of water protons in tissue, thus increasing the MR image contrast and the specificity of the MRI measurements. Current clinically approved contrast agents are low molecular weight molecules that are rapidly cleared from the body. The use of dendrimers as carriers of paramagnetic chelators can play an important role in the future development of more efficient MRI contrast agents. Specifically, the increase in local concentration of the paramagnetic species results in a higher signal contrast. Furthermore, this CA provides a longer tissue retention time due to its high molecular weight and size. Here, we demonstrate a convenient procedure for the preparation of macromolecular MRI contrast agents based on poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers with monomacrocyclic DOTA-type chelators (DOTA &#8211; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). The chelating unit was appended by exploiting the reactivity of the isothiocyanate (NCS) group towards the amine surface groups of the PAMAM dendrimer to form thiourea bridges. Dendrimeric products were purified and analyzed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry, and elemental analysis. Finally, high resolution MR images were recorded and the signal contrasts obtained from the prepared dendrimeric and the commercially available monomeric agents were compared.

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

This protocol describes the preparation and characterization of a dendrimeric magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent that carries cyclen-based macrocyclic chelates coordinating paramagnetic gadolinium ions. In a series of MRI experiments in vitro, this agent produced an amplified MRI signal when compared to the commercially available monomeric analogue.

Preparación y<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterización de los agentes de contraste basados ​​en dendrímeros de Imágenes por Resonancia Magnética

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical properties, which allow for the absorption of near-infrared (NIR) light and can subsequently convert it into multiplexed emissions that span over a broad range of regions from the UV to the visible to the NIR. This article presents detailed experimental procedures for high-temperature co-precipitation synthesis of core-shell UCNs that incorporate different lanthanide ions into nanocrystals for efficiently converting deep-tissue penetrable NIR excitation (808 nm) into a strong blue emission at 480 nm. By controlling the surface modification with biocompatible polymer (polyacrylic acid, PAA), the as-prepared UCNs acquires great solubility in buffer solutions. The hydrophilic nanocrystals are further functionalized with specific ligands (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) for localization on the cell membrane. Upon NIR light (808 nm) irradiation, the upconverted blue emission can effectively activate the light-gated channel protein on the cell membrane and specifically regulate the cation (e.g., Ca2+) influx in the cytoplasm. This protocol provides a feasible methodology for the synthesis of core-shell lanthanide-doped UCNs and subsequent biocompatible surface modification for further cellular applications.

A protocol is presented for the synthesis of core-shell lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) and their cellular applications for channel protein regulation upon near-infrared (NIR) light illumination.

Síntesis de Core-shell dopados con lantánidos Upconversion nanocristales para aplicaciones celulares

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Un método de síntesis rápida de Au, Pd y Pt Aerogels vía reducción directa basada en la solución

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Soft Polysiloxane-urea Elastomers for Intraocular Lens Application

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses (a-IOLs). Aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes (PDMS) were previously prepared via the ring-chain equilibration of the cyclic siloxane octamethylcyclotetrasiloxane (D4) and 1,3-bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane (APTMDS). Phenyl groups were introduced into the siloxane backbone via the copolymerization of D4 and 2,4,6,8-tetramethyl-2,4,6,8-tetraphenyl-cyclotetrasiloxane (D4Me,Ph). These polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers were synthesized for increasing the refractive indices of polysiloxanes. For applications as an a-IOL, the refractive index of the polysiloxanes must be equivalent to that of a young human eye lens. The polysiloxane molecular weight is controlled by the ratio of the cyclic siloxane to the endblocker APTMDS. The transparency of the PSU elastomers is examined by the transmittance measurement of films between 200 and 750 nm, using a UV-Vis spectrophotometer. Transmittance values at 750 nm (upper end of the visible spectrum) are plotted against the PDMS molecular weight, and &#62; 90% of the transmittance is observed until a molecular weight of 18,000 g&#183;mol&#8722;1. Mechanical properties of the PSU elastomers are investigated using stress-strain tests on die-cut dog-bone-shaped specimens. For evaluating mechanical stability, mechanical hysteresis is measured by repeatedly stretching (10x) the specimens to 5% and 100% elongation. Hysteresis considerably decreases with the increase in the PDMS molecular weight. In vitro cytotoxicity of some selected PSU elastomers is evaluated using an MTS cell viability assay. The methods described herein permit the synthesis of a soft, transparent, and noncytotoxic PSU elastomer with a refractive index approximately equal to that of a young human eye lens.

This study describes synthetic routes for aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes and polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers and for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers. It presents the application of PSUs as accommodating an intraocular lens. An evaluation method for in vitro cytotoxicity is also described.

Síntesis de elastómeros suaves de polisiloxano-urea para aplicación de Lente Intraocular

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the designing of poly(ethylenimine) grafted with polyethylene glycol (PEI-g-PEG) copolymer functionalized gold nanoparticles (AuNPs) with loaded aptamer (AS1411) and DOX through amide reactions. AS1411 is specifically bonded with targeted nucleolin receptors on cancer cells so that DOX targets cancer cells instead of healthy cells. First, PEG is carboxylated, then grafted to branched PEI to obtain a PEI-g-PEG copolymer, which is confirmed by 1H NMR analysis. Next, PEI-g-PEG copolymer coated gold nanoparticles (PEI-g-PEG@AuNPs) are synthesized, and DOX and AS1411 are covalently bonded to AuNPs gradually via amide reactions. The diameter of the prepared AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39.9 nm, with a zeta potential of -29.3 mV, indicating that the nanoparticles are stable in water and cell medium. Cell cytotoxicity assays show that the newly designed DOX loaded AuNPs are able to kill cancer cells (A549). This synthesis demonstrates the delicate arrangement of PEI-g-PEG copolymers, aptamers, and DOX on AuNPs that are achieved by sequential amide reactions. Such aptamer-PEI-g-PEG functionalized AuNPs provide a promising platform for targeted drug delivery in cancer therapy.

In this protocol, doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modified gold nanoparticles are synthesized via three-step amide reactions. Then, doxorubicin is loaded and delivered to target cancer cells for cancer therapy.

Síntesis De Aptamer-PEI-g-PEG Nanopartículas De Oro Modificadas Cargadas Con Doxorrubicina Para La Administración De Fármacos Dirigidos

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...