JMD y MKB se financian a través de la ciencia Nanomedicina IGERT y el programa de Tecnología en la Universidad Northeastern (fondos de NCI y NSF subvención DGE-0504331). Este trabajo también fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales Grant R01 GM084366. También agradecemos a Saumya Das y Anthony Rosenzweig de BIDMC en Boston para proporcionar los miocitos cardíacos y Kevin Cash, por su contribución en el desarrollo del protocolo de los animales.

1. Preparación de optode Antes de tomar la optode, alícuotas de los componentes se necesitan para que puedan ser fácilmente medidos y guardados. <ol><li> A 50 mg de sodio ionóforo X (Naix) y un vial de 50 mg de sodio tetrakis [3,5-bis (trifluorometil) fenil] borato (NaTFPB) cada uno será educado en tetrahyrdofuran (THF) y alícuotas en tubos de 1,5 ml de centrífuga de poliestireno. En una cabina de humos química, se disuelven 50 mg de Naix en 1 ml de THF en el vial de transporte y mezcla para asegurarse de que el sólido se haya disuelto completamente. Transferencia de 100 l de esta solución en 10 tubos de centrifugación por separado. Repita el procedimiento para NaTFPB. Deje que el THF se evapore en una campana para vapores químicos durante la noche, la etiqueta de los tubos de centrífuga y colocarlos en el refrigerador de 4 grados para el almacenamiento. Esto crea alícuotas de 5 mg de materia seca y Naix NaTFPB. </li><li> Disolver el III Chromoionophore (CHIII) en 1 ml de THF y transferir a un vial de 3 ml de vidrio. Añadir otra 1 ml de THF en el vial de envío CHIII para disolver cualquier CHIII residual y añadir esto a la ampolla de vidrio de 3 ml. Habrá un total de 2 ml ahora. Transferir 1 ml de la solución de THF en CHIII a dos viales separados 1,5 ml de vidrio con tapas de teflón. Guarde la solución CHIII en un refrigerador de 4 grados en la concentración final de 5 mg / ml. </li></ol> Estas alícuotas de las soluciones y se utilizará para hacer el material optode. <ol start="3"><li> Pipeta de 66 l de bis (2-etilhexil) sebacato (DOS) en un vial de 1,5 ml de vidrio con tapón de rosca de teflón - este es el vial optode. DOS es una solución viscosa que se debe tener cuidado para asegurar la cantidad adecuada de solución se transfiere al vial. El volumen corresponde a ~ 60 mg de DOS. </li><li> Pesar 30 mg de alto peso molecular de poli (vinilo) (PVC) y la transferencia de esta a la optode vial. </li><li> Ahora agregue los componentes funcionales de alícuotas para el vial optode para crear el optode deseado. Las concentraciones relativas de CHIII, Naix, y NaTFPB determinará la respuesta del sensor con el sodio. Estas concentraciones se pueden ajustar para tener un sensor que, idealmente, responde a las concentraciones intracelulares, con una Kd de 10 mm, o las concentraciones extracelulares, con una Kd de 150 mM. Además, es probable que haya lotes a la variabilidad del lote de los productos químicos del proveedor y la calibración de los sensores es necesario determinar si la respuesta correcta es que ocurren para cada nuevo lote de componentes químicos. A continuación se describe el método para crear un sensor con las concentraciones que se suelen utilizar para las mediciones de sodio intracelular. </li><li> En una cabina de humos química, la transferencia de 100 l de los 5 mg / ml CHIII en solución de THF en el vial optode. </li><li> Disuélvanse 5 mg de Naix en 300 l de THF y la transferencia de 300 l en el vial optode, esto se correlaciona con 5 mg de Naix. </li><li> Disolver una alícuota de 5 mg de la NaTFPB en 500 l de THF y la transferencia de 20 l de la solución en el vial optode, esto se correlaciona con 0,1 mg de NaTFPB. </li><li> Añadir 80 l de THF en el vial optode. </li><li> La solución en el vial optode contiene 30 mg de PVC, 60 mg de DOS, 5 mg de Naix, 0,2 mg de NaTFPB, 0,5 mg de CHIII en 500 l de THF. Suavemente vórtice de este vial hasta que todo el PVC se ha disuelto. El optode debe ser de un color rojo. La cantidad total de THF añadido al vial debería ser de 500 l, independientemente de la relación de los componentes utilizados. </li><li> Deje que el resto de THF en el Naix y alícuotas NaTFPB que se evapore toda la noche y volver a la etiqueta del tubo con la cantidad correcta de productos químicos. </li></ol> 2. La creación de nanosensores <ol><li> Pipetear 100 L de 10 mg / ml de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N - [metoxi (polietilenglicol) -550] en cloroformo (PEG-lípido) en un vial de 4 copitas de cristal. Deje que el cloroformo se evapore en una cabina de humos química. Este proceso puede ser acelerado por secado de la solución con nitrógeno gaseoso o aire casa. </li><li> Agregar 4 ml de la solución acuosa deseada en el vial con el PEG-lípido. Coloque el vial sobre una toma de laboratorio por debajo de la punta de ultrasonidos y elevar el vial hasta que la punta es de unos 7 mm de profundidad en la solución y ultrasonidos a una potencia de ultrasonidos de baja durante 30 segundos. Aquí se utiliza una Branson digitales Sonifier establece en 15% de la amplitud con un cuerno de ½ pulgada de paso de diámetro de la punta. La solución acuosa puede ser cualquier solución. Por ejemplo, para determinar la respuesta de los sensores que utilizan 10 mM HEPES pH 7,2 con base trizma. </li><li> Mientras que la solución se sonica, mezcla de 50 l de material optode con 50 l de diclorometano en un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml. Mezclar con la pipeta para asegurar una mezcla. </li><li> Ajuste el control de Sonifier de ultrasonidos durante 3 minutos. Iniciar el tratamiento con ultrasonidos y ultrasonidos, mientras que añadir la solución de la mezcla optode al vial mediante la inmersión de la punta de la pipeta en la solución y la dispensación de la l 100 de la solución en un rápido, incluso la inyección. La solución debe ponerse azul, depending en la solución acuosa utilizada. </li><li> Deje que el tratamiento con ultrasonidos para continuar durante unos 30 segundos y luego baje el gato de modo que la punta de ultrasonidos es de aproximadamente 2 mm de profundidad en la solución. Esto debe comenzar a airear la solución y la solución se volverá opaco. Este paso ayuda a eliminar el THF residual y diclorometano de la solución. </li><li> Una vez se haya completado la sonicación, tire hacia arriba la solución nanosensor en una jeringa de 5 ml. Coloque un filtro de 0,2 micras jeringuilla y vierta la solución nanosensor en un frasco de vidrio con tapa de rosca. La solución debe ser transparente y azul si es una solución acuosa que contiene menos de 10 mM de sodio y tiene un pH menor de 9 se utiliza. De lo contrario, no debe tener color o ser de color rosa. </li></ol> 3. Determinación de la respuesta nanonsensor Este método se utiliza para determinar la respuesta de nanosensores diseñado para medir el sodio intracelular. Diferentes concentraciones se recomienda el uso de nanosensores para la concentración de sodio extracelular. <ol><li> Que las soluciones stock de 10 mM HEPES (0 Na) y cloruro de sodio 1M (NaCl) en 10 mM HEPES (1 M Na) y el pH de cada una de estas soluciones a 7,2 usando la base trizma. Mezcle las soluciones madre de 0 y 1 Na Na M en tubos de 50 ml cónicos de centrífuga para crear soluciones con: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 concentraciones mM de NaCl. </li><li> Use un fondo óptico placa de 96 pozos para determinar la respuesta. Añadir 100 ml de cada concentración de sodio al 3 pozos en una columna. Esto producirá una serie de 3 x 10 pozos. </li><li> A cada pocillo se añaden 100 l de nanosensores recién preparados y de carga en un fluorómetro de microplacas. Utilizamos un molecular Spectramax dispositivos M3. </li><li> Lea cada una y con las longitudes de onda siguientes: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Excitación (nm) </td><td> Emisión (nm) </td><td> Cut-Off (nm) </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table> La intensidad de nanosensor en cada longitud de onda depende de la concentración de sodio. El uso de la longitud de onda depende de las aplicaciones. Para las mediciones intracelulares dinámica lenta, utilizamos 488 nm/570 nm (excitación / emisión) y 488 nm/670 nm, que nos permiten la relación entre dos longitudes de onda y reducir el ruido. <ol start="5"><li> Tradicionalmente, optode de datos se convierte en un valor que son: α = (I - I min) / (I max - min I), donde I es la intensidad en una concentración de sodio dado, min es el menor intensidad en las medidas de respuesta , y el máximo es de mayor intensidad en las medidas de respuesta. Convierta que la proporción de intensidad a 570 nm dividida por la intensidad a 670 nm o la intensidad a 680 nm a α. </li><li> Utilice el software de trazado, ya sea Excel o de origen se utilizan normalmente en nuestro laboratorio, para trazar α versus el logaritmo de la concentración de sodio, estableciendo el registro de la concentración de sodio de cero a -1. Ajustar una curva sigmoidal a la respuesta. Partir de la curva, calcular la concentración de sodio en α = 0,5, que representa la concentración en la que el sensor responde de manera óptima. </li><li> Ajustar la relación de CHIII, Naix, y NaTFPB en el optode para crear nanosensores con una respuesta óptima en torno a la concentración de sodio de interés. </li></ol> 4. Imágenes intracelulares <ol><li> Para las mediciones intracelulares, los nanosensores se hacen en 5 mg / ml de glucosa en agua y microinyección en las células. </li><li> Crecer o transferir las células en un plato con fondo de cristal o una cámara de imágenes con un fondo cubreobjetos. </li><li> Se incuban las células en los medios de comunicación clara o una solución de Tyrode. Monte la cámara de imágenes o un plato en un microscopio de epifluorescencia. Utilizamos un Zeiss LSM 7 microscopio confocal. </li><li> Tire capilar de vidrio con un extractor de la pipeta. Nosotros usamos un flamante café Sutter P-97 con 1 mm de diámetro exterior, de vidrio 0,78 mm de diámetro, con un diámetro de la punta final de alrededor de 300-500 nm. </li><li> Rellene la pipeta con la solución de nanosensor con una jeringa y una aguja de Hamilton, o un cargador de micropunta y una pipeta. </li><li> Montaje de la pipeta en un soporte que se adjunta a un micromanipulador y conectado a un sistema de presión de inyección controlada. Aquí se utiliza un micromanipulador Burleigh EXFO 6000 PCS y sistemas médicos de empresa de inyección. </li><li> Inferior de la pipeta en la parte superior de la celda y en el citoplasma, a veces es necesario &quot;tocar&quot; el titular de manipulador de perforar la membrana. Se inyecta la solución nanosensor y rápidamente retirar la pipeta. </li></ol> 5. En vivo imágenes Todos los procedimientos han sido revisados ​​y aprobados por el Cuidado de Animales de la Universidad Northeastern y el empleo. <ol><li> Nanosensoresen vivo, imágenes extracelular se realizan en tampón fosfato salino y ajustado para tener una respuesta óptima al sodio a una concentración de sodio de 135 mm. </li><li> Para la inyección de configuración y la imagen de los nanosensores fluorescente en ratones, se utiliza el IVIS Lumina II y su unidad de anestesia asociado. Desinfectar la inducción y las cámaras de imagen. Lugar CD1 ratones desnudos (aproximadamente 20 g) en la cámara de inducción y los exponen a isoflurano. El porcentaje de caudal isoflurano y oxígeno administrada variará dependiendo de la especie y el peso de los ratones. Espere a que los ratones para convertirse en totalmente anestesiado. </li><li> Después de los ratones anestesiados, eliminar a los ratones de la cámara de inducción y el lugar en la cámara de imágenes. Mantener a los ratones con anestesia. Para cada ratón, desinfectar las áreas de inyección deseada. </li><li> Llene una jeringa de insulina 31G con 10 l de nanosensores y asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire. </li><li> Con unas pinzas, agarre un pequeño pliegue de la piel a lo largo de la parte posterior del ratón en el sitio de la inyección deseado. Mientras sujeta la piel, insertar la aguja en la piel con el bisel hacia arriba y la aguja paralela a la piel. </li><li> Antes de la inyección de los sensores, tire hacia atrás el émbolo de la jeringa para asegurarse de que la aguja no se inserta en un vaso sanguíneo. Luego, mueva suavemente la aguja derecha y la izquierda para crear una bolsa dentro de la piel. Esto reducirá al mínimo la presión trasera que hace que los sensores se escape de la zona de inyección. Inyectar los sensores y retire con cuidado la jeringa. </li><li> Para aplicar una suave presión en el sitio de inyección y limpie cualquier solución que puede haber escapado del lugar de la inyección. Esto minimizará la fluorescencia de los sensores que no se inyectan en la piel. </li><li> Repita los pasos 5.4 a 5.7 hasta que el número de áreas de inyección deseada. Seis puntos de inyección uniformemente espaciados en el lado izquierdo y derecho de la espalda se recomienda. Para cada ratón individual, cambiar las agujas, si la aguja se vuelve difícil de insertar en la piel. Las agujas no deben ser compartidos entre los ratones. Esto reducirá al mínimo la transmisión de enfermedades o la contaminación cruzada entre los ratones. </li><li> Para obtener imágenes de los sensores de sodio fluorescente, adquirimos dos imágenes campo claro y fluorescencia de los ratones con los conjuntos de filtros que se acercaba más a los 640 nm/680 nm (excitación / emisión) del espectro de los nanosensores y que también minimizan la autofluorescencia de la piel. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Curvas de respuesta de cinco grupos diferentes nanosensor de sodio. Cada juego representa nanosensores a partir de formulaciones diferentes optode que había la misma cantidad de CHIII, NaTFPB, PVC y DOS, pero diferentes cantidades de Naix. Los datos se convierten en valores de α con la intensidad de 639/680 nm. Los datos son un promedio de 3 barras de error, omitidas por claridad, con una curva sigmoidal equipado con Origen. En esta curva de respuesta, la concentración máxima de sodio utilizado fue de 500 mM. La Kd de los nanosensores de sodio de sodio fue de 10 mM (los diamantes de color naranja) a unos 150 mm (cuadrados de color negro). <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Inyectado neonatal miocitos cardíacos. Las células fueron cultivadas en cubreobjetos, montada en un microscopio y se inyecta con nanosensores de sodio. Se muestran los fluorescentes (nm de excitación 639), claro, y la superposición. Tenga en cuenta que un agrupamiento de sensores se produce, pero las células tienen una morfología normal, los sensores se han difundido en todo el citosol y no hay ninguna carga nuclear. <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Inyección subcutánea en ratones con nanosensores de sodio. Nueve inyecciones distintas de nanosensores de sodio se realizaron en el espacio subcutáneo de ratones desnudos. Tanto en campo claro y las imágenes fluorescentes (640/680) se superponen.

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La formación de nanosensores no debe tardar más de 10 minutos una vez que la solución optode se ha hecho y se secan los lípidos PEG. Optode no sólo se pueden hacer rápidamente cuando sea necesario, pero cuando se almacenan a 4 grados centígrados, pueden ser estables durante meses. Hemos demostrado que la nansensors, una vez formados, son estables en solución por lo menos durante una semana;. Sin embargo, se debe tener cuidado para evitar que photobleaching durante este tiempo mediante el bloqueo de los nanosensores de la luz 6 Mientras nanosensores de sodio se ha demostrado aquí, optodes han sido creado para la mayoría de los iones biológicamente relevantes, tales como el potasio y cloruro. 10,12 También se ha extendido esta tecnología a pequeñas moléculas como la glucosa 13. Además de generar nanosensores para controlar diferentes analitos, estos nanosensores son susceptibles de otros cambios que los hacen útiles en la mayoría de los experimentos biológicos. Por ejemplo, el revestimiento de la superficie, en este caso poli (etilenglicol), se puede cambiar fácilmente con cualquier molécula anfifílica que es soluble en agua. Esto permite la posibilidad de funcionalización estas nanopartículas para diferentes aplicaciones o destinos. El tamaño de las nanopartículas también se puede ajustar mediante la alteración de la capa superficial, la intensidad de ultrasonidos o utilizar el disolvente. Indicadores fluorescentes de calcio han sido muy valiosa para determinar la señalización del calcio intracelular, sin embargo, sin tintes sensibles al sodio disponibles tienen las características ideales mismo. Optode nanopartículas destinadas a proporcionar un método alternativo para la imagen de los iones intracelulares han estado en desarrollo desde hace años. 14 Hemos construido sobre esta investigación previa para crear nanosensores específicos para obtener imágenes de sodio intracelular que se espera ofrecer un medio para comprender cómo la señalización de sodio afecta la función celular y alteraciones en la señalización que conducen a ciertas enfermedades. El uso de nanosensores fluorescentes en vivo ofrece un tiempo de real alternativa mínimamente invasiva para los analitos de vigilancia respecto a otros métodos, tales como extracciones de sangre. 3 de sodio y glucosa nanosensores basados ​​en la tecnología anterior se ha demostrado que seguir los cambios en el sodio y glucosa, respectivamente, en vivo. 3,13 Sin embargo, actualmente existen limitaciones a este método como una herramienta de monitoreo. Por ejemplo, los sensores deben contener un fluoróforo con un espectro lo suficientemente desplazado hacia el rojo del infrarrojo cercano con el fin de minimizar la autofluorescencia de fondo de la piel. 15 En segundo lugar, la técnica de inyección de corriente no produce la inyección uniforme de los nanosensores que puedan ser causados ​​por tales errores como la variación en la profundidad de la inyección. A pesar de estas limitaciones, el desarrollo de estos nanosensores fluorescentes y su demostración con éxito podría hacer que estos sensores una invaluable herramienta de investigación y método para monitorear la salud del paciente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del producto </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> IVIS Lumina II paquete de instrumentos </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD-1 ratones desnudos </td><td> Charles River </td><td> Código de tensión: 086 </td><td> Inmunodeficientes </td></tr><tr><td> Las jeringas de insulina </td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 3 / 10 cc mL, 8 mm, 31G </td></tr><tr><td> De alto peso molecular del PVC </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Naix </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Capilar de vidrio de paredes delgadas </td><td> Sutter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG lípidos </td><td> Avanti Polar Lípidos </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Proporciona una lista de productos químicos y equipos utilizados en este procedimiento. Todas las sustancias químicas comunes a los mencionados fueron adquiridos de Sigma.

fluorescent nanoparticles for the measurement of ion concentration in biological systems

Homeostasis de iones fuertemente regulado por todo el cuerpo es necesario para la prevención de tales estados debilitantes como la deshidratación. 1 Por el contrario, los flujos rápidos de iones a nivel celular son necesarios para iniciar los potenciales de acción en las células excitables. 2 Reglamento de sodio juega un papel importante en los dos estos casos, sin embargo, ningún método actualmente existe para un seguimiento continuo de los niveles de sodio en vivo 3 y sondas intracelulares de sodio al 4 no ofrecen similares resultados detallados de las sondas de calcio. En un esfuerzo para llenar las dos de estos vacíos, nanosensores fluorescentes se han desarrollado que puede monitorear las concentraciones de sodio in vitro e in vivo. 5,6 Estos sensores se basan en la tecnología optode selectivo de iones y se componen de partículas de polímero plastificado en el que el reconocimiento específico de sodio elementos, fluoróforos sensible al pH, y los aditivos son incorporados. 9.7 Mecánica, el elemento de reconocimiento de sodio de extractos de sodio en el sensor. 10 Esta extracción provoca que el fluoróforo sensible al pH de liberar un ion de hidrógeno para mantener la neutralidad de la carga en el sensor que hace que un cambio en la fluorescencia. Los sensores de sodio es reversible y selectivo de sodio más potasio, incluso a altas concentraciones intracelulares. 6 Son aproximadamente 120 nm de diámetro y están revestidos con polietileno glicol para impartir la biocompatibilidad. Utilizando técnicas de microinyección, los sensores pueden ser entregados en el citoplasma de las células donde se ha demostrado para monitorear la dinámica temporal y espacial de sodio de vencer a los miocitos cardíacos. 11 Por otra parte, también han seguido en tiempo real los cambios en las concentraciones de sodio en vivo cuando se inyecta por vía subcutánea en ratones de 3 En este documento, se explica en detalle y demostrar la metodología para la fabricación de nanosensores fluorescentes de sodio y una breve demostrar las aplicaciones biológicas de nuestro laboratorio utiliza los nanosensores para:. la microinyección de los sensores en las células, y la inyección subcutánea de los sensores en los ratones .

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Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Nanopartículas fluorescentes producidos en nuestro laboratorio se utilizan para las concentraciones de iones de imágenes y los flujos de iones en los sistemas biológicos, como las células en el líquido intersticial y la señalización en la homeostasis fisiológica.

Las nanopartículas fluorescentes para la Medición de la concentración de iones en sistemas biológicos

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

fluorescent-nanoparticles-for-measurement-ion-concentration

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Bioengineering

15.2K vistas.  Northeastern University. Nanopartículas fluorescentes producidos en nuestro laboratorio se utilizan para las concentraciones de iones de imágenes y los flujos de iones en los sistemas biológicos, como las células en el líquido intersticial y la señalización en la homeostasis fisiológica.

Video: Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodología elastografía por resonancia magnética para la Evaluación de los tejidos Diseñado crecimiento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Investigación

Bioingeniería

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

El estudio de la materia y Soft-Sistemas Biológicos en un amplio Longitud escala del nanómetro y el micrómetro Tamaños en el pequeño ángulo de neutrones difractómetro KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

La fusión de polarización de la concentración de iones entre yuxtapuestas Las membranas de intercambio iónico para bloquear la propagación de la Zona de Polarización

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Producción de nanopartículas metálicas por ablación por láser pulsado en líquidos: una herramienta para estudiar las propiedades antibacterianas de las nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash NanoPrecipitation para la encapsulación de compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos en nanopartículas poliméricas

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Ultrasonido Doppler Transcraneal Funcional para el Monitoreo del Flujo Sanguíneo Cerebral

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivos eléctricos y de campo magnético para la estimulación de tejidos biológicos

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Métodos rápidos y enzimáticos para la amplificación de plantillas mínimas y lineales para la creación de prototipos de proteínas utilizando sistemas libres de células

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...