Este trabajo es apoyado por ARRA NSF MRI Instrument Development Grant # 0923179 de FMF. Agradecemos aguamarina Asberry, Coordinador del Laboratorio para la Parker H. Petit Instituto de Bioingeniería y Ciencias Biológicas Histología Core, para obtener ayuda con seccionamiento de tejidos.

1. Tejido seccionamiento <ol><li> La tienda de tejido congelado instantáneamente, todo en congelador -80 ° C hasta que esté listo para seccionar. </li><li> Dejar que la muestra de tejido para llegar a la temperatura en el criomicrotomo antes de seccionamiento (30 min). Ajuste la hoja y temperatura de la muestra a -30 ° C. </li><li> Una vez que el tejido ha alcanzado la temperatura, el manejo de la muestra con pinzas, corte frontal o posterior del cerebro dependiendo de qué parte del cerebro es de interés para la superficie de montaje suficiente (es decir, si la parte frontal del cerebro es de importancia primaria, montar parte trasera del cerebro el mandril). <ol><li> Aplicar ~ 0,5 ml de corte óptimo Compuesto Temperatura (OCT, Tissue-Tek, Sakura) a chuck en el centro y, con unas pinzas, colocar la muestra en el lugar en octubre hasta que se solidifica. Una vez que octubre está completamente congelado, montaje del mismo en soporte de la muestra. </li><li> Se prefiere una cantidad mínima de la OCT se utiliza para montar la muestra (en contraste con el montaje de la muestra en un bloque de la OCT como se hace comúnmente en otra histoprocedimientos lógicos) para reducir al mínimo la contaminación de la muestra. La contaminación de la muestra mediante OCT es perjudicial para la DESI y proceso de formación de imágenes debido a la supresión de iones. </li></ol></li><li> Las secciones típicas de tejidos necesarios para la gama MS de imágenes 12-18 micras de espesor. Tejidos Sección de espesor deseado dentro del rango recomendado. Descongelar a montar cada tejido seccionado por tocar ligeramente una temperatura ambiente portaobjetos de vidrio sobre la sección. Una vez que se monta una muestra, tenga cuidado de no tocar la sección de tejido, ya que cambiará la distribución de productos químicos y composiciones. </li></ol> Nota: Se recomienda montar dos secciones por diapositivas, utilizando una sección para la optimización y el otro para la imagen. Si las secciones no son para formación de imágenes inmediata, diapositivas almacenar en congelador -80 ° C en una caja de portaobjetos hasta que esté listo para el análisis. <ol start="5"><li> Si el análisis de secciones almacenados, quite deslizante del congelador, transfiera inmediatamente al desecador de vacío, y permitir ~ 15-20min para descongelar. Dejar la muestra en el desecador ya se seca la muestra y reducir la eficiencia DESI. La optimización de la fuente de iones DESI se llevará a cabo con la muestra de tejido una vez que se ha descongelado, sin embargo, en el interés de tiempo, el período durante el cual la muestra se está derritiendo sirve como un tiempo ideal para la inicialización del equipo. <ol><li> Uso de acetonitrilo con ácido acético al 1% como disolvente de DESI, encender la bomba de jeringa con un caudal de 5 l / min. Una velocidad de flujo baja reducirá el lado de punto de impacto de la pulverización de DESI y tamaño efectivo de píxel, pero una velocidad de flujo más alta puede ser necesario para la sensibilidad suficiente. Por lo tanto la velocidad de flujo (típicamente 1-5 l / min) debe ser optimizado para cada aplicación y la sensibilidad y la resolución deseada. Asegúrese de que la jeringa contiene suficiente disolvente para la optimización completa y de imágenes a una velocidad de flujo dada. </li><li> Una vez que el disolvente parece que gotea de la punta de la fuente, encender el gas de nebulización nitrógeno con un pressure de 160 psi. </li><li> Encienda la fuente de alimentación de alta tensión conectado a la fuente de iones de aplicar 3.600 V. </li></ol></li><li> Coloque el cursor en la fase de movimiento y comenzar fuente de iones y MS optimización </li></ol> 2. Optimización DESI <ol><li> El sistema de DESI consta de una sonda de fuente (véase la figura 2), una jeringa y la bomba o sistema de suministro de disolvente alternativo, nitrógeno comprimido, etapa de la muestra traducción y montaje. Proceda con optimización de la fuente DESI una vez que el espectrómetro de masas se ha optimizado para la gama y analitos de interés masa apropiada. <ol><li> Si los componentes de origen no se han activado todavía, consulte las secciones 1.5.1-3 para las direcciones. </li><li> Se recomiendan las variables discutidas en estas secciones para obtener imágenes de los tejidos biológicos. Sin embargo estas variables deben ser optimizados para diferentes tipos de tejido o muestra. Disolventes alternativos, caudales, presiones de gas de nebulización y tensiones se han reportado para imaging de tejidos biológicos. 16-18 </li></ol></li><li> Asegúrese de que inicialmente la fuente DESI no toque el portaobjetos de vidrio, y no se dirige a ninguna parte de la sección de tejido. Esto asegurará que la sonda no se daña en el proceso de optimización inicial y no contaminará cualquier parte de la puesta en marcha al entrar en contacto con la muestra de tejido. <ol><li> Una buena posición de partida es con la punta 3 mm de la superficie de la muestra y 5 mm desde el capilar de entrada MS, con la sonda en un ángulo de 55 ° con respecto a la superficie de la muestra. El capilar interior de la sonda, debe hacerse extensivo DESI ~ 1 mm más allá del capilar externo. Todos estos parámetros se pueden optimizar. </li></ol></li><li> La interfaz de MS capilar debe tener un ángulo de colección de ~ 15 ° con respecto a la superficie de la muestra para la transferencia óptima de iones. Ajustar la altura del escenario para que la MS se cierne capilares más de la superficie de la muestra; la capilares deben ser &lt;1 mm de la superficie, lo más cerca posiblesin tocar. </li><li> Alinear la sonda DESI en la dimensión x con respecto a la entrada capilar MS para que estén directamente en línea. </li><li> Ajuste las yyz posiciones de la fuente DESI para una sensibilidad óptima usando la sección de tejido adicional. Tenga en cuenta que a medida que la sonda DESI se dirige a un área de la muestra, con el tiempo se desorber e ionizar todos los analitos en esa zona y la señal disminuirá gradualmente a medida que este se produce. La ejecución de este paso tan pronto como sea posible es importante. <ol><li> Por lo tanto, durante todo el proceso de optimización, la muestra necesita ser movido por debajo de la cabeza de pulverización para asegurarse de que está siendo analizada muestra fresca y que cualquier cambio en la señal son debido a la optimización de la fuente, no el agotamiento de la muestra. Sin embargo, teniendo en cuenta que la composición química variada de diferentes regiones del tejido, una comparación directa de la intensidad de iones a través de toda la sección del tejido no es del todo precisa. El tálamo del cerebro proporciona un área bastante grande de tamaño concomposición química más consistente, pero todavía no es perfectamente uniforme. Alternativamente, un marcado de Sharpie rojo, que contiene el colorante rodamina 6G ([M] +, m / z 443), en el portaobjetos de vidrio lejos de la muestra proporciona una fuerte respuesta de MS por DESI y también se puede utilizar para la optimización, pero dada la diferente forma de muestra y analito, estas condiciones no pueden todavía se correlacionan con una puesta a punto ideal para los tejidos biológicos. </li><li> Y la separación recomendada entre la punta y la fuente de entrada capilar: ~ 4 mm, z separación recomendada entre la punta y la superficie de la muestra: ~ 1,5 mm. Aunque estos parámetros serán ligeramente diferentes para cada montaje experimental. </li><li> Teniendo en cuenta la geometría y el ángulo de la sonda, tener en cuenta que la Y y posiciones dimensión Z están relacionados entre sí con respecto a la transmisión efectiva de las gotitas de disolvente y que contiene el analito. Un cambio en una variable requiere una modificación posterior en la otra para mantener la misma posición de impacto de pulverización ysus ángulos de transmisión. </li></ol></li><li> Ajuste la distancia las extrusiones capilares internas del capilar externo de la fuente para la máxima sensibilidad, y el impacto del tamaño mínimo de punto. Precaución: Asegúrese de que el alto voltaje está apagado mientras realiza este ajuste. </li><li> La geometría de la fuente se considera óptimo cuando se observa la señal máxima. <ol><li> Las variables optimizadas en las secciones 2.5 a 2.6 están relacionados entre sí, por lo tanto, el ajuste de uno será inherentemente requiere el reajuste de la otra para mantener la geometría necesaria fuente-muestra-de entrada, o el ajuste de las condiciones discutido en la sección 1.5.1- 3. </li></ol></li><li> Además, un elemento de calentamiento que rodea la transferencia capilar para el espectrómetro de masas puede mejorar la sensibilidad mediante la facilitación desolvatación de las gotitas de analitos cargados producidos durante el proceso de ionización. Aquí se utiliza un calentador de cuerda enrollada alrededor de la transferencia capilar ajustado a 100 ° C. </li></ol> 3. Tissue imágenes <ol><li> Durante el proceso de formación de imágenes, la etapa de la muestra se mueve la muestra por debajo de la sonda de DESI y entrada de MS capilar y todos los otros componentes permanecen estacionarios. Los parámetros de movimiento del escenario deben ser seleccionados en función del impacto DESI tamaño de columna y la sensibilidad óptima. <ol><li> Un penacho de impacto más grande resultará en una mayor intensidad de iones, dado que está siendo desorbido más de la muestra, sin embargo, para formación de imágenes, sino que también dará lugar a un tamaño de píxel más grande y con ello una peor resolución de la imagen. </li></ol></li><li> La etapa de conversión utilizado en este experimento es el hogar-construido y controlado por un programa de LabVIEW que permite el control de la velocidad y el interlineado rastering una imagen de dimensiones dadas. La etapa VI de control de movimiento utilizado en este experimento es disponible en omnispect.bme.gatech.edu. Por otra parte, una fuente DESI disponible comercialmente y el estadio podría ser utilizado como el Omni fuente 2D automatizado spray de Prosolia Inc. (Indianapolis, IN EE.UU.). <ol><li> Para los tejidos del cerebro de unTamaño de imagen típica es de 10 x 15 mm y teniendo en cuenta los parámetros de movimiento de la etapa de segunda mano, la imagen tomará aproximadamente 3 horas. <ol><li> Programe el LabView VI o software de control equivalente para las condiciones de formación de imágenes que desee, utilizando una velocidad de fase de exploración de 80 m / s, y el interlineado entre líneas de 200 micras. Cuando se utiliza la fuente de spray Omni, parámetros de movimiento se deben establecer para una velocidad de escaneo de 100 a 200 m / s, y un interlineado de 200 micras. Tenga en cuenta que estos parámetros de movimiento se pueden cambiar en función del número de píxeles deseados en cada dimensión y sensibilidad necesaria. <ol><li> Un espaciado de línea más pequeña se ha demostrado que mejora la calidad de imagen, con la velocidad de exploración que tiene menos de un efecto. 25 Sin embargo, es importante señalar que esto no indica necesariamente y la mejora de resolución de la imagen, ya que es fuertemente dependiente de punto de impacto tamaño. Una velocidad de muestreo más lento y espaciado más pequeño aumentará significativamente el tiempo de análisis y por lo tanto deben ser optimized para cada tipo de tejido o muestra. </li></ol></li><li> Con la adquisición espectral MS fija en 1 exploraciones / segundo, y la imagen creada como 1 píxel / exploración, la velocidad de fase se define el tamaño de píxel en la dimensión x, mientras que el espaciado de línea determina el tamaño de píxel en la dimensión y. Aunque el tamaño de pixel verdadero de la imagen es más grande que esto debido a la difusión de rociar, de movimiento más lento permite más tiempo para la desorción y la detección de analitos. </li></ol></li><li> Dale ruta del directorio y el nombre de archivo para los archivos de la posición y la duración de las imágenes grabadas durante en el LabView VI. </li></ol></li><li> En la preparación para la adquisición de datos de espectro de masas, calcular el tiempo total requerido para la formación de imágenes. El programa Labview utilizado por nuestro grupo proporciona automáticamente este valor, pero si se utiliza el control de fase alternativa, este cálculo es necesario para la configuración de adquisición de datos de MS. <ol><li> Cuando se utiliza un spray de fuente y la etapa automatizado Omni, cada línea de la imagen se adquiere como encorre individuo. El-por-línea del tiempo y el número de líneas necesarias para las dimensiones de imagen dados se calcularon utilizando el software de control Omni spray para ser introducidos en el software del espectrómetro de masas. </li></ol></li><li> Asegúrese de que la velocidad del análisis del espectrómetro de masas es el 1 de espectro / seg, y establecer el tiempo de adquisición de instrumentos para que coincida con el tiempo total calculado. <ol><li> Ajuste la velocidad de barrido espectral espectro 1 / sec. </li><li> Adquirir datos en modo de perfil y asegurarse de que el rango de m / z es apropiado para las especies de interés. Recuerde que DESI también produce analitos cargados multiplican, como en ESI. </li><li> Establezca el tiempo de adquisición para que coincida con el tiempo total de la imagen dada por LabView. </li></ol></li><li> Coloque el punto de impacto de pulverización en la parte superior izquierda del área a explorar. </li><li> Comience adquisición de datos de MS y el movimiento escenario al mismo tiempo. </li><li> Al concluir la adquisición de datos, vuelva espectrómetro de masas al modo de espera. </li><li> Apague alta tensión de la fuente DESI. </li><li> Encienda ogas nitrógeno y ss. </li><li> Apague la bomba de jeringa. </li></ol> 4. Procesamiento de Imágenes <ol><li> Los datos de espectros de masas, en combinación con el tiempo y los datos de posición etapa guardados como archivos de texto a través de LabVIEW deben ser &quot;dobladas&quot; en una imagen 2D correlación de coordenadas de píxeles con los espectros correspondiente. Las imágenes que aquí se presentan fueron procesados ​​con el software Matlab basado en que está disponible gratuitamente en: omnispect.bme.gatech.edu. Si los datos se adquieren utilizando la fuente de aerosol Omni, el software de conversión de datos de luciérnaga se utiliza para crear el cubo de datos para la visualización de la imagen en BioMAP (www.maldi-msi.org). </li><li> Para los datos adquiridos en el AccuTOF espectrómetro de masas Jeol, el cromatograma registrado deberá ser exportado. Cdf formato para su posterior análisis. <ol><li> Utilizando el Data Manager dentro MassCenter, primero convierta los datos adquiridos a los datos centroided (Herramientas → Convertir datos Adquisición de centroide). A continuación, exportar datos en formato. Cdf formato utilizando la combinación de teclas Ctrl + Shift + E folseguido por Herramientas → Exportar. </li></ol></li><li> Cargar los datos en bruto. Cdf medios espectrales y los dos archivos de texto, la posición y la hora, el sitio web OmniSpect. Datos de imágenes Firefly-procesados ​​pueden ser visualizados en BioMAP. <ol><li> El tratamiento posterior de los datos, incluyendo análisis estadístico Matriz de factorización no negativa o trazado de un solo ion de interés puede realizarse directamente en el sitio web. </li><li> Alternativamente, el cubo de datos sin procesar se pueden exportar para su análisis en Matlab. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Biological+Samples:+Localization+of+Peptides+and+Proteins+Using+MALDI-TOF+MS.">Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Pacholski, M. L., Winograd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+Mass+Spectrometry.">Imaging with Mass Spectrometry.</a> Chem. Rev. 99, 2977-3006 (1999).</li><li>Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Song, Q., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Imaging+at+Atmospheric+Pressure+Using+Desorption+Electrospray+Ionization+(DESI)+Mass+Spectrometry.">Tissue Imaging at Atmospheric Pressure Using Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7188-7192 (2006).</li><li>Nemes, P., Laser Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+for+Atmospheric+Pressure,+in+Vivo,+and+Imaging+Mass+Spectrometry.">Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric-pressure+Molecular+Imaging+of+Biological+Tissues+and+Biofilms+by+LAESI+Mass+Spectrometry.">Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (43), e2097 (2010).</li><li>Van Berkel, G. J., Kertesz, V., Koeplinger, K. A., Vavrek, M., Kong, A. -. N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+microjunction+surface+sampling+probe+electrospray+mass+spectrometry+for+detection+of+drugs+and+metabolites+in+thin+tissue+sections.">Liquid microjunction surface sampling probe electrospray mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections.</a> J. Mass Spectrom. 43, 500-508 (2008).</li><li>Tak&#225;ts, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Sampling+Under+Ambient+Conditions+with+Desorption+Electrospray+Ionization.">Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization.</a> Science. 306, 471-473 (2004).</li><li>Venter, A., Sojka, P. E., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Dynamics+and+Ionization+Mechanisms+in+Desorption+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Droplet Dynamics and Ionization Mechanisms in Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 8549-8555 (2006).</li><li>Costa, A. B., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+atmospheric+transport+and+droplet-thin+film+collisions+in+desorption+electrospray+ionization.">Simulation of atmospheric transport and droplet-thin film collisions in desorption electrospray ionization.</a> Chem. Commun. , 3915-3917 (2007).</li><li>Costa, A. B., Graham Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+splashes:+Elucidating+the+mechanism+of+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Simulated splashes: Elucidating the mechanism of desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Chem. Phys. Lett. 464, 1-8 (2008).</li><li>Konermann, L., Ahadi, E., Rodriguez, A. D., Vahidi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+Mechanism+of+Electrospray+Ionization.">Unraveling the Mechanism of Electrospray Ionization.</a> Anal. Chem. 85, 2-9 (2012).</li><li>Kebarle, P., Verkerk, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray:+From+ions+in+solution+to+ions+in+the+gas+phase,+what+we+know+now.">Electrospray: From ions in solution to ions in the gas phase, what we know now.</a> Mass Spectrom. Rev. 28, 898-917 (2009).</li><li>Green, F. M., Salter, T. L., Gilmore, I. S., Stokes, P., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+electrospray+solvent+composition+on+desorption+electrospray+ionisation+(DESI)+efficiency+and+spatial+resolution.">The effect of electrospray solvent composition on desorption electrospray ionisation (DESI) efficiency and spatial resolution.</a> Analyst. 135, 731-737 (2010).</li><li>Van Berkel, G. J., Kertesz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Sampling+and+Imaging+of+Analytes+Separated+on+Thin-Layer+Chromatography+Plates+Using+Desorption+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Automated Sampling and Imaging of Analytes Separated on Thin-Layer Chromatography Plates Using Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 4938-4944 (2006).</li><li>Ifa, D. R., Wu, C., Ouyang, Z., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+and+other+ambient+ionization+methods:+current+progress+and+preview.">Desorption electrospray ionization and other ambient ionization methods: current progress and preview.</a> Analyst. 135, 669-681 (2010).</li><li>Eberlin, L. S., Ferreira, C. R., Dill, A. L., Ifa, D. R., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+for+lipid+characterization+and+biological+tissue+imaging.">Desorption electrospray ionization mass spectrometry for lipid characterization and biological tissue imaging.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1811, 946-960 (2011).</li><li>Wu, C., Ifa, D. R., Manicke, N. E., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+adrenal+gland+by+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 28-32 (2010).</li><li>Wiseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry:+Imaging+drugs+and+metabolites+in+tissues.">Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 18120-18125 (2008).</li><li>Eberlin, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classifying+Human+Brain+Tumors+by+Lipid+Imaging+with+Mass+Spectrometry.">Classifying Human Brain Tumors by Lipid Imaging with Mass Spectrometry.</a> Cancer Res. 72, 645-654 (2012).</li><li>Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Venter, A., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+molecular+imaging+by+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Ambient molecular imaging by desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat. Protocols. 3, 517-524 (2008).</li><li>Van Berkel, G. J., Ford, M. J., Deibel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-Layer+Chromatography+and+Mass+Spectrometry+Coupled+Using+Desorption+Electrospray+Ionization.">Thin-Layer Chromatography and Mass Spectrometry Coupled Using Desorption Electrospray Ionization.</a> Anal. Chem. 77, 1207-1215 (2005).</li><li>Lane, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+reveals+surface-mediated+antifungal+chemical+defense+of+a+tropical+seaweed.">Desorption electrospray ionization mass spectrometry reveals surface-mediated antifungal chemical defense of a tropical seaweed.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 7314-7319 (2009).</li><li>Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+and+Surface+Alignment+Considerations+in+Chemical+Imaging+with+Desorption+Electrospray+Mass+Spectrometry.">Scanning and Surface Alignment Considerations in Chemical Imaging with Desorption Electrospray Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 80, 1027-1032 (2008).</li><li>Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+imaging+resolution+in+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Improved imaging resolution in desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2639-2644 (2008).</li><li>Campbell, D., Ferreira, C., Eberlin, L., Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+spatial+resolution+in+the+imaging+of+biological+tissue+using+desorption+electrospray+ionization.">Improved spatial resolution in the imaging of biological tissue using desorption electrospray ionization.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404, 389-398 (2012).</li><li>Chaurand, P., Cornett, D. S., Angel, P. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Whole-body+Sections+Down+to+Cellular+Level,+Multiscale+Imaging+of+Phospholipids+by+MALDI+Mass+Spectrometry.">From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, (2011).</li><li>Dill, A., Eberlin, L., Costa, A., Ifa, D., Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+quality+in+tissue+analysis+using+desorption+electrospray+ionization.">Data quality in tissue analysis using desorption electrospray ionization.</a> Anal. Bioanal. Chem. 401, 1949-1961 (2011).</li><li>Jackson, S. N., Wang, H. -. Y. J., Woods, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Profiling+of+Lipid+Distribution+in+Brain+Tissue+Using+MALDI-TOFMS.">Direct Profiling of Lipid Distribution in Brain Tissue Using MALDI-TOFMS.</a> Anal. Chem. 77, 4523-4527 (2005).</li><li>Jackson, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-ion+mobility-TOFMS+imaging+of+lipids+in+rat+brain+tissue.">MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue.</a> J. Mass Spectrom. 42, 1093-1098 (2007).</li><li>Wang, H. -. Y. J., Post, S. N. J. J., Woods, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimalist+approach+to+MALDI+imaging+of+glycerophospholipids+and+sphingolipids+in+rat+brain+sections.">A minimalist approach to MALDI imaging of glycerophospholipids and sphingolipids in rat brain sections.</a> Int. J. Mass Spectrom. 278, 143-149 (2008).</li><li>Wu, B., Becker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+elements+and+molecules+in+biological+tissues+and+cells+in+the+low-micrometer+and+nanometer+range.">Imaging of elements and molecules in biological tissues and cells in the low-micrometer and nanometer range.</a> Int. J. Mass Spectrom. 307, 112-122 (2011).</li><li>Eberlin, L. S., Ifa, D. R., Wu, C., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Vizualization+of+Mouse+Brain+by+Lipid+Analysis+Using+Ambient+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Vizualization of Mouse Brain by Lipid Analysis Using Ambient Ionization Mass Spectrometry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 873-876 (2010).</li><li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Imaging+by+Mass+Spectrometry:+A+New+Frontier.">3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier.</a> Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Pulfer, M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+mass+spectrometry+of+phospholipids.">Electrospray mass spectrometry of phospholipids.</a> Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).</li><li>Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalogen+deficiency+in+early+Alzheimer's+disease+subjects+and+in+animal+models:+molecular+characterization+using+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).</li><li>Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+levels+are+altered+in+down+syndrome+brain.">Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain.</a> Brain Res. 867, 9-18 (2000).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+Myocardial+Cardiolipin+Content+and+Composition+Occur+at+the+Very+Earliest+Stages+of+Diabetes:+A+Shotgun+Lipidomics+Study.">Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study.</a> Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La optimización de la geometría de la fuente de DESI es crítico para experimentos exitosos MSI. Las múltiples variables que contribuyen a la alineación del sistema afectan directamente a la sensibilidad y la resolución de la imagen. Si durante la optimización, el experimentador tiene dificultades para obtener la señal, le recomendamos que utilice punto Sharpie rojo dibujado en la diapositiva como punto de referencia, el tinte, la rodamina 6G, m / z 443, produce una fuerte señal en el modo de iones positivos y s...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50575" target="_parent">Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry</a>. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:
Rachel V. Bennett
instead of:
Rachel V. Bennet

Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Formación de imágenes de Untargeted por espectrometría de masas facilita la adquisición de información química para aplicaciones de descubrimiento y de generación de hipótesis. Formación de imágenes dirigida de una sustancia química conocida de interés, por otro lado, puede facilitar el aumento de la sensibilidad y la selectividad a través del desarrollo método específico. La espectrometría de masas de imagen (MSI) se realiza con mayor frecuencia en los tejidos mediante MALDI, 1 de iones secundarios espectrometría de masas (SIMS), 2 y técnicas de ionización ambiental, incluyendo desorción ionización electrospray (DESI), 3 ablación láser de ionización electrospray (LAESI), 4, 5 y líquidos micro-ensambladura de la superficie Sonda de muestreo (LMJ-SSP). 6 En MALDI y SIMS, las muestras tienen que ser eliminados físicamente de la muestra, y tienen que ser plana y delgada, ya que se analizan a alto vacío. MALDI requiere recubrimiento de la muestra con una matriz de absorción de radiación, la adición de un paso adicional y engorroso para la preparación de la muestra. SIMStiene la mayor resolución lateral, pero el bombardeo con partículas altamente energéticas provoca graves fragmentación molecular. Por lo tanto, MSI mediante métodos ambientales llenar un nicho que es deseable un análisis suave con una preparación mínima de la muestra. Sin embargo, hasta la fecha, todos los métodos son todavía limitados por el requisito de las superficies planas de muestra. DESI utiliza un neumáticamente asistida por disolvente de pulverización cargada dirigida a la superficie de la muestra para desorber e ionizar analitos. 7 El modelo de trabajo para la desorción y la posterior ionización por DESI se conoce como la &quot;gota modelo de pick-up&quot;. 8-10 Las gotitas cargadas primarios producida por la sonda DESI chocan con la superficie, mojando y formando una película delgada en el que el analito se disuelve por un mecanismo de microextracción sólido-líquido 8 subsiguiente gota colisiones resultado en la transferencia de impulso y el despegue de gotas secundarias que contienen el material extraído de la superficie 9,10. En última instancia, el gasSe cree que los iones de fase que se produce a través de procesos ESI-como después de la evaporación de iones, los modelos de residuos de carga u otros modelos, 11 sin embargo, el proceso de formación de iones precisa en DESI aún tiene que ser probada experimentalmente. 12 DESI sensibilidad depende en gran medida de la solubilidad de los el analito en el disolvente de pulverización, como desorción se basa en la microextracción localizada. 13 Cuando se utiliza con una etapa de la muestra controlada por software, la muestra se escanea unidireccionalmente con el carril de paso a paso por debajo de la sonda de ionización DESI, y a través del dominio del tiempo, m / z información se correlaciona con la distribución espacial de la especie química &#39;(Figura 1). Desde la primera prueba de principio experimento DESI-MSI reportado por Van Berkel y Kertesz en 2006, 14 la técnica ha madurado considerablemente, con 15 solicitudes reportadas en el análisis de los lípidos, 3,16 metabolitos de drogas, enferme 17,18biomarcadores se, 19 tejido cerebral, 3,18,20 tejido pulmonar, 18 de tejido de riñón, 18 de tejido testicular, 18 glándulas suprarrenales, 17 placas de cromatografía de capa fina, 21 y las superficies de las algas. 22 La resolución rutinaria de imágenes obtenidas por DESI-MSI es 100-200 micras, que se determina en última instancia, por el área de superficie efectiva extraído por la pulverización, pero se han reportado resoluciones tan bajo como 40 micras. 23-25 ​​Tal resolución y facilidad de análisis hace DESI-MSI apropiado para el análisis rápido y sencillo de muestras de tejidos biológicos con áreas de superficie en el rango de 0,5-5 cm 2, lo que permite la adquisición de información espacial valiosa para comprender mejor los procesos biológicos 26. Aquí, como un ejemplo de una aplicación típica DESI-MSI, se revisan los detalles de procedimiento de la realización de un experimento exitoso que implica formación de imágenes de lípidos en los tejidos de cerebro de rata. Los dos pasos más críticos en el protocolo son losPreparación del tejido 27 y optimización de la fuente de iones DESI, tal como se describe a continuación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura-Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td><a href="http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&amp;subcat=48" target="_blank">http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&amp;subcat=48</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0156-6</td>
			<td>OmniSolv, LC-MS Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092-500 ml</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CryoStar* NX70</td>
			<td>Any available microtome can be used for tissue sectioning <a href=" http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&amp;groupType=PRODUCT&amp;searchType=0&amp;storeId=11152&amp;from=search&amp;ca=cryostar" target="_blank"> http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&amp;groupType=PRODUCT&amp;searchType=0&amp;storeId=11152&amp;from=search&amp;ca=cryostar</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Omni Spray;DESI Spray Head</td>
			<td>Prosolia Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment <a href=" http://www.prosolia.com/sources.php" target="_blank"> http://www.prosolia.com/sources.php</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>High Voltage Power Supply</td>
			<td>Stanford Research Systems, Inc.</td>
			<td>PS350/5000V-25W</td>
			<td><a href="http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm" target="_blank">http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rope heater, RTD, controller</td>
			<td>Omega</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&amp;book=Heaters" target="_blank">http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&amp;book=Heaters</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Version 7.1 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Translational stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Optiscan II</td>
			<td><a href="http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html" target="_blank">http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AccuTOF Mass Spectrometer</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JMS-T100LC</td>
			<td>Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

imaging of biological tissues by desorption electrospray ionization mass spectrometry

La espectrometría de masas de imagen (MSI) proporciona información molecular no selectiva con la mayor especificidad y la resolución espacial para la investigación de los tejidos biológicos a los cientos a decenas de escala de micras. Cuando se lleva a cabo bajo condiciones ambiente, la muestra de pre-tratamiento se hace innecesaria, simplificando de este modo el protocolo mientras se mantiene la alta calidad de la información obtenida. La desorción de ionización por electrospray (DESI) es una técnica de MSI ambiente aerosol-basado que permite el muestreo directo de las superficies al aire libre, incluso in vivo. Cuando se utiliza con una etapa de la muestra controlada por software, la muestra se tramado por debajo de la sonda de ionización DESI, y a través del dominio del tiempo, m / z información se correlaciona con la distribución espacial de la especie química &#39;. La fidelidad de la salida DESI-MSI depende de la orientación de la fuente y el posicionamiento con respecto a la superficie de la muestra y de entrada de espectrómetro de masas. Aquí, revisamos cómo preparar las secciones de tejido de DESI imaging y condiciones experimentales adicionales que afectan directamente a la calidad de imagen. Específicamente, se describe el protocolo para la formación de imágenes de secciones de tejido de cerebro de rata por DESI-MSI.

La Figura 3 muestra un espectro representativo obtenido a partir de una sección de cerebro de rata no tratada. En el modo positivo, el espectro de masas está dominada por fosfatidilcolinas, debido a sus altas eficiencias de ionización (atribuido al grupo amonio cuaternario cargado positivamente). La imagen de iones total de la sección de tejido también se muestra en la Figura 3, que muestra abundante señal a través de toda la sección del cerebro. Lípidos clave detectados se ide...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

La desorción de ionización por electrospray espectrometría de masas (DESI-MS) es un método por el cual las muestras ambiente, incluidos los tejidos biológicos, se pueden obtener imágenes con la preparación mínima de la muestra. Por rastering la muestra por debajo de la sonda de ionización, esta técnica de aerosol a base proporciona una resolución espacial suficiente para discernir las características moleculares de interés dentro de las secciones de tejido.

Obtención de imágenes de tejidos biológicos por desorción ionización electrospray espectrometría de masas

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

imaging-biological-tissues-desorption-electrospray-ionization-mass

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.4K vistas.  Georgia Institute of Technology. La desorción de ionización por electrospray espectrometría de masas (DESI-MS) es un método por el cual las muestras ambiente, incluidos los tejidos biológicos, se pueden obtener imágenes con la preparación mínima de la muestra. Por rastering la muestra por debajo de la sonda de ionización, esta técnica de aerosol a base proporciona una resolución espacial suficiente para discernir las características moleculares de interés dentro de las secciones de tejido.

Video: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for sample pretreatment. The method was first described by Fenn and colleagues1 and has been applied to the detection of illicit drugs2 and explosives3-4, the characterization of skin volatiles5, and the analysis of breath6-7.
SESI ionization occurs by proton transfer reactions between the electrospray solution and the volatile analyte, and is therefore suitable for the analysis of hetero-organic molecules, just as in traditional electrospray ionization (ESI). However, unlike standard ESI, the proton transfer process of SESI occurs in the vapor phase rather than in solution (Fig. 1), and therefore SESI is best suited for detecting organic volatiles and aerosols.
We are expanding the use of SESI-MS to the detection of bacterial volatiles as a method for bacterial identification and characterization8. We have demonstrated that SESI-MS volatile fingerprinting, combined with a statistical analysis method, can be used to differentiate bacterial genera, species, and mixed cultures in a variety of growth media.8 Here we provide the steps for obtaining bacterial volatile fingerprints using SESI-MS, including the instrumental parameters that should be optimized to ensure robust bacterial identification and characterization.

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) enables the detection of volatile organic compounds (VOCs) without the need for any sample pretreatment. This protocol provides instructions for the rapid (within minutes) characterization of bacterial VOCs using SESI-MS.

La caracterización de compuestos volátiles bacteriana secundaria con ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Investigación

Bioingeniería

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Preparación de la muestra Estrategias para Espectrometría de Masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3D

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Caracterización cualitativa de la fracción acuosa de hidrotérmico Licuefacción de algas mediante 2D cromatografía de gases con espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Todo el cuerpo de Espectrometría de Masas de imágenes por infrarrojos asistida por matriz de desorción láser de ionización electrospray (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingeniería 'Oro' de la fluorescencia por presión selectiva incorporación de aminoácidos no canónica y análisis de proteínas por espectrometría de masas y la fluorescencia