Los autores desean agradecer Genoma Canadá y Genoma de Columbia Británica para la financiación de plataforma y apoyo. También agradecemos a la Dra. Carol E. Parker para la revisión crítica de la asistencia manuscrito y edición. CHL también agradece a la Columbia Británica Proteómica red de apoyo.

1. Seccionar los tejidos <ol><li> Flash congelar las muestras temáticas, una vez cosechados, con nitrógeno líquido, enviarlos en hielo seco (si se requiere el envío), y almacenar a -80 ° C hasta seccionar los tejidos. (Si se utilizan muestras comerciales, asegúrese de que las muestras se prepararon de esta manera.) </li><li> Cortar los órganos a un tamaño manejable para adaptarse a la diana MALDI. Recorte los partes no deseadas del órgano. Para este estudio se describe aquí, las lentes de ternera fueron decapsulated usando un procedimiento descrito previamente-35 antes de seccionar los tejidos. </li><li> Retire órganos enteros desde -80 ° C congelador y fijarlos a un escenario de corte de tejido criogénico. Para corregir una lente de ternera, coloque una o dos gotas de agua en la etapa de corte de tejido de un criostato. Coloque rápidamente la lente en el agua antes de que se solidifique. Alternativamente, la temperatura óptima de corte (OCT) compuestos también se pueden usar para fijar un tejido en la etapa de corte. Si se usan compuestos octubre, un miniMal cantidad de la OCT se debe aplicar y se debe tener cuidado para asegurar que las secciones de tejido cortada no estar contaminados con compuestos PTU que pueden interferir con la ionización y la detección de los analitos 5,36,37. </li><li> Deje que la temperatura en el interior del criostato se equilibre a -18 ° C. Las temperaturas más frías o más calientes se pueden utilizar para los tejidos más blandos o más duros, respectivamente. A continuación, cortar el tejido ecuatorial en 20 micras rodajas gruesas. Utilice 10-15 micras rodajas gruesas para la mayoría de los tejidos, sin embargo, debido a la naturaleza frágil del tejido del cristalino bovino, se utilizaron 20 micras rodajas gruesas. Para el tejido cristalino bovino, deseche los primeros cortes de tejido y sólo usar sectores que están cerca o en el plano ecuatorial. </li><li> Si se forma la imagen de un tejido de la lente ocular, utilizar 1,5 l de ácido fórmico (98% en pureza, CL-EM grado) a prehumedecido la superficie de un óxido de indio y estaño (ITO) recubiertos con portaobjetos de vidrio. </li><li> Transferir cuidadosamente las secciones de tejido de la superficie de la ITO-coportaobjetos de vidrio ATED dentro del criostato. La sección de tejido se descongelará rápidamente y se convertirá firmemente fijado a la superficie de deslizamiento. Por lo general, múltiples secciones de tejido se pueden montar en un mismo portaobjetos recubiertos de ITO de esta manera. </li><li> Liofilizar la corredera durante 15 min antes de la aplicación de la matriz de MALDI. </li><li> Para la prueba de matriz, disolver las matrices individuales en disolventes apropiados. Detectar manualmente 1 l de cada solución de matriz en la sección de tejido. Además, detectar un patrón de calibración de molécula pequeña sobre el tejido para la verificación de la sensibilidad de MALDI. </li><li> Añadir tres marcas de enseñanza para el portaobjetos de vidrio recubierto de ITO por la escritura en la superficie no conductora de la placa de vidrio recubierto de ITO con un lápiz corrector-fluido. Tome una imagen óptica de la diapositiva tejido utilizando un escáner de superficie plana y guardarlo en un formato adecuado, como tiff o jpg. </li></ol> 2. Revestimiento de matriz 2.1. Automatizado matriz de revestimiento <ol><li> Apsoluciones de matriz de capas, que contienen acetonitrilo o acetonitrilo / agua mezclada como disolventes, automáticamente a las superficies de las secciones de tejido utilizando un ImagePrep Bruker o un pulverizador de matriz electrónico similar. </li><li> Cubrir los bordes de la superficie frontal de la corredera de vidrio recubierta con ITO con cinta de modo que la matriz no hace recubrir los bordes de la diapositiva. Esto asegura que las marcas de enseñanza sobre la superficie opuesta se pueden utilizar para la alineación de diapositivas tejido. No cubra los bordes de la corredera con la matriz a medida que se utilizan como puntos de contacto para mantener la conductividad eléctrica de la corredera recubierto con ITO. </li><li> Cubra el portaobjetos de vidrio utilizando veinte ciclos de revestimiento de matriz (spray de 2 segundos, la incubación de 30 segundos y 60 segundos el tiempo de secado para cada ciclo). </li></ol> 2.2. Revestimiento de matriz Manual <ol><li> Si disolventes orgánicos (por ejemplo, cloroformo y acetato de etilo) que son incompatibles con los materiales de fabricación de la matriz de pulverizador electrónica necesarias para evirojo, utilice un pulverizador aerógrafo neumáticamente asistida para aplicar la matriz. Añadir la solución de matriz preparados para el depósito de disolvente de la pistola de aerógrafo y aplicar un ligero flujo de gas nitrógeno presurizado para cebar el pulverizador. </li><li> Cubrir los bordes de la superficie frontal de los portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO con cinta de modo que la matriz no hace recubrir los bordes de la diapositiva. Esto asegura que las marcas de enseñanza sobre la superficie opuesta se pueden utilizar para la alineación de diapositivas tejido. No cubra los bordes de la corredera con la matriz a medida que se utilizan como puntos de contacto para mantener la conductividad eléctrica de la corredera recubierto con ITO. </li><li> Después de que se han observado los aerosoles estables y finos, rocíe manualmente la matriz de manera que haya finalizado la fase cubre la sección de tejido. Aplicar la cantidad mínima de solución de matriz requerido para mojar apenas la superficie durante cada ciclo para evitar la posible deslocalización analito. En general, utilizar aproximadamente 10 ciclos de pulverización de matriz para revestir una sección de tejido; el número de ciclos esdepende del tipo de tejido y la composición de la matriz. </li></ol> 3. MALDI MS <ol><li> Preparar una solución de calibración de masas por dilución de la solución &quot;ES ajuste Mix&quot; estándar por un factor de 1:200 en 60:40 de isopropanol: agua (que contiene ácido fórmico al 0,1% en la mezcla final). </li><li> Introducir 2 l / min de la solución diluida &quot;ES ajuste Mix&quot; en el modo dual de ionización por electrospray (ESI) / fuente de iones MALDI en el espectrómetro de masas FTICR, desde el lado de ESI. </li><li> Utilice el instrumento FTICR en el modo ESI-iones positivos, con detección de banda ancha y un tamaño de adquisición de datos de 1.024 kb / s. ESI parámetros típicos son la tensión de electrospray capilar, 3900 V; rociar tensión escudo, 3600 V; de gas nebulizador (2 N) de flujo, 2 L / min; gas seco (N 2) de flujo y la temperatura, 4 L / min y 200 º C; skimmer 1 tensión, 15 V, el tiempo de vuelo (TOF), 0,009 segundos; gas de colisión (Ar) de flujo, 0,4 l / s; fuente de iones tiempo de acumulación, 0,1 seg;y celda de colisión de iones tiempo de acumulación, 0,2 seg. Ajustar los parámetros de operación FTICR con el fin de maximizar la sensibilidad analítica sobre el rango de masas de m / z 200 a 1400, mientras se mantiene buena de dominio de tiempo-libre de la inducción de la caries señales (FID). Por lo general, los parámetros de funcionamiento de ICR son tensión sidekick, 8 V; Sidekick tensión de offset, 8 V; amplificación de excitación de 10; excitación tiempo de impulso, 0,01 hasta 0,015 seg; tensión trampa placa frontal, 1.5 V, trampa de nuevo la tensión de placa, 1,6 V y tensión de entrada del analizador, -4 V. Después de que se ha determinado un conjunto de parámetros de funcionamiento FTICR, adquirir los espectros de masas ESI y calibrar el instrumento usando las masas de referencia de los compuestos estándar en la solución &quot;ES ajuste Mix&quot;. </li><li> Para afinar el instrumento para el funcionamiento de MALDI, disolver varias alícuotas de 1 l de una mezcla de terfenadina y solución estándar reserpina en la solución de matriz a una concentración de 1 M cada uno, y en el clavo estas soluciones directamente sobre uno de los tissusecciones E (es decir, una sección de tejido de prueba) que ha sido montado en una corredera recubierto con ITO. Colocar el portaobjetos recubierto con ITO en un adaptador de diapositivas de tejido (es decir, una diana de MALDI especial) y cargar el adaptador desde el lado de MALDI en la fuente de iones ESI / MALDI doble. Optimizar los parámetros de funcionamiento de MALDI adecuados para la potencia del láser y el número de disparos de láser para la acumulación de señales MALDI para cada exploración de masas, etc parámetros de operación MALDI típicos son: disparos láser, 50, y una tensión de la placa de MALDI de 300 V. </li><li> Después de la sintonización, la calibración, y optimizando el instrumento para experimentos de MALDI-MSI, alinear la ubicación física de una sección de tejido a ser fotografiado con su óptica de la imagen registrada en el software de imágenes. Utilice las tres marcas de &quot;corrección&quot;-de fluido, que se habían puesto previamente en el lado opuesto de la superficie de deslizamiento recubierto con ITO (paso 1.9), para esta alineación utilizando un método de triangulación de tres puntos. </li><li> Realice una ESI y MAL simultáneaOperación DI para que cada espectro de masas contiene los picos de masa de referencia de la solución &quot;ES Sintonía Mix&quot; de post-adquisición calibración de masa interna. Esto dará como resultado en la medición de la masa más precisa durante MALDI MS. Para hacer esto, primero atenuar la señal ESI por la disminución de la tensión capilar hasta que las señales de MALDI dominan los espectros mientras que las señales calibrantes ESI son todavía lo suficientemente alta para la calibración de masa interno. </li><li> A continuación, configure un método rastering automatizado para la irradiación láser. Definir las regiones de tejido para formar imágenes y establecer el tamaño adecuado paso raster láser. Tenga en cuenta que los tamaños de paso más pequeña trama proporcionan imágenes de tejidos de mayor resolución, sino que requieren un tiempo significativamente mayor masa espectral adquisición y más espacio de almacenamiento de datos. El número de los píxeles de la imagen depende del tamaño de paso de trama láser para configurar y el tamaño del tejido. Para una lente bovina típica que tiene un tamaño de 1 cm 2 de tejido, una imagen de tejido se compone típicamente de CA. </em&gt; 5000 píxeles si un tamaño de paso de trama láser de 200 micras se utiliza en un instrumento FTICR. Utilizar un análisis &quot;in situ al azar&quot;, ya que esto evita el sesgo basado en la ubicación debido a la atenuación de la señal progresiva durante el experimento. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Calibrar los espectros de masas MALDI usando calibración interna para la comparación inicial y para seleccionar picos de MS / MS. De-isótopo y seleccione los picos monoisotopic como se describió anteriormente, utilizando una secuencia de comandos de VBA personalizado 38. </li><li> Exportar el resultado pico listas monoisotopic y introducir los valores de m / z medido en el METLIN 39 y / o las bases de datos HMDB 40 metabolome para la coincidencia de masa con las entradas de biblioteca. Considere la (M + H) +, (M + Na) +, y (M + K) + iones durante las búsquedas de bases de datos, con un error de masa permisible de ± 1 ppm. </li><li> Generar imágenes MALDI para todas las entidades de lípidos detectados a través de toda la sección de tejido usando imagsoftware de e-análisis, con una anchura filtro de masa de 1 ppm en el vértice del pico. </li><li> Una vez que las imágenes han sido generados para todos los valores de m / z que coinciden con las entradas de la base de datos, generación de imágenes para todos los demás picos y buscar patrones de distribución únicas que pueden ser investigados más tarde. </li></ol> 5. La confirmación de la identidad de los Lípidos Imaged <ol><li> Confirmar las identidades de los lípidos de alta abundancia, que tienen iones fragmentados característicos que se pueden detectar usando el instrumento FTICR (por ejemplo, 184.073 para fosfolípidos), por MALDI-MS/MS. Realizar MALDI-MS/MS usando disociación inducida por colisión (CID) directamente sobre el tejido. </li><li> Para las especies de lípidos que no pueden ser confirmadas directamente por MALDI-MS/MS, utilizar un sistema de UPLC acoplado a un espectrómetro de masas Q-TOF 34. <ol><li> Diseccionar manualmente alícuotas que contienen ~ 10 mg de tejido de la zona donde se localizan las especies de interés. Coloque estas alícuotas de tejidos en 2tubos de centrífuga ml. </li><li> Homogeneizar cada alícuota de tejido en 250 l de agua, utilizando un molino mezclador con dos bolas de metal de acero inoxidable de 5 mm. </li><li> Añadir 1 ml de solución de cloroformo-metanol (1:3, v / v), y agitar los tubos. A continuación, centrifugar los tubos utilizando una microcentrífuga a 12.000 xg durante 10 min. </li><li> Reunir los sobrenadantes y secarlos en un concentrador de velocidad rotatorio al vacío. </li><li> Disolver el residuo en 100 l de isopropanol: agua 30:70. Inyectar una alícuota de 10 l en la columna de la UPLC para la separación usando un gradiente de elución. </li><li> Utilice las condiciones cromatográficas para LC-MS/MS lípidos en línea, que han sido previamente publicados 34. </li><li> Generar corriente de iones extraídos (XIC) los cromatogramas con los valores teóricos m / z, con una ventana de ± 50 ppm alrededor de las masas teóricas. </li><li> Si están disponibles compuestos auténticos para los lípidos, que coincida con los tiempos de retención de los compuestos auténticos con los de la correspondiente picos XIC de las muestras de tejido. Si los compuestos son los mismos, los tiempos de retención y los espectros de MS / MS deben coincidir. </li></ol></li><li> Si un compuesto auténtico no está disponible, utilice el patrón de fragmentación de los lípidos detectado para que coincida con un espectro estándar de MS / MS de una base de datos metabolome como METLIN o HMDB. Utilice la interpretación de espectros de masas de novo para determinar una posible estructura de los lípidos. </li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Las consideraciones más importantes para el éxito de MALDI MSI son: 1) la preparación del tejido, 2) la elección de la matriz, y 3) la aplicación de la matriz, y 4) la interpretación de datos y análisis. Cuando la muestra y la matriz se preparan adecuadamente, la adquisición de datos de MS está automatizado. El análisis de los datos de este tipo de experimento es bastante mano de obra intensiva. La preparación del tejido adecuado es crucial para el éxito de los experimentos de MA...

De formación de imágenes Espectrometría de masas (MSI) es una técnica analítica para la determinación de los patrones de localización y la distribución espacial de los compuestos sobre la superficie de una sección de tejido 1,2. Matrix asistida por láser de desorción / ionización (MALDI) MSI para el análisis de péptidos y proteínas se ha utilizado durante más de una década y ha habido grandes mejoras en los métodos de preparación de muestras, la sensibilidad de detección, resolución espacial, la reproducibilidad y procesamiento de datos 3,4. Mediante la combinación de información de las secciones teñidas histológicamente y experimentos MSI, patólogos son capaces de correlacionar las distribuciones de compuestos específicos con características interesantes patofisiológicamente 5. Los patrones de distribución de pequeñas moléculas, incluyendo fármacos exógenos 6,7 y sus metabolitos 8-10 también han sido interrogados por MALDI-MS de formación de imágenes de tejido 11. Los lípidos son quizás el más estudiado cla-ampliamentess de compuestos con imágenes MALDI, tanto en los MS 12-17 y MS / MS de 18 modos. El uso de MALDI MSI para la imagen pequeña molécula ha sido limitada por varios factores: 1) matrices de MALDI son ellos mismos moléculas pequeñas (típicamente m / z &lt;500), que generan señales de iones abundantes. Estas señales abundantes pueden suprimir la ionización de analitos de moléculas pequeñas e interferir con su 19,20 detección. Recubrimiento libre de disolventes matriz 21, la sublimación de la matriz 22, y la matriz de MALDI MS prerrecubierto 23, entre otros, se han desarrollado para mejorar la MSI de pequeñas moléculas. Las nuevas matrices que pueden mejorar el análisis de compuestos de bajo MW son de gran interés en la pequeña molécula de MSI. Estas matrices deberán ofrecer mayores señales de analitos con las señales de la matriz disminuido. En el modo de ion positivo, 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) y-4-hidroxicinámico α-ciano ácido (CHCA) son las dos matrices MALDI MS comúnmente utilizados para MSI 24 </sup&gt;. La matriz ideal sería formar cristales pequeños, a fin de preservar la localización espacial de los analitos. DHB tiende a formar cristales más grandes, por lo tanto, la aplicación de la matriz usando la sublimación se ha desarrollado para superar parcialmente este problema, y ha permitido el uso de esta matriz para formación de imágenes sensibles de los fosfolípidos de 22,25. 9-amino-acridina se ha usado para MSI de analitos próticos en el modo de ion positivo 26 y para los nucleótidos y fosfolípidos en el modo de 26-29-ion negativo. 2-mercaptobenzotiazol se ha encontrado para dar la detección de MALDI eficiente de lípidos 30, y se ha utilizado para la formación de imágenes de cerebro de ratón gangliósidos 31. La resolución ultra alta de iones de transformada de Fourier de resonancia ciclotrón (FTICR) espectrómetros de masas algo pueden aliviar este problema mediante la resolución de las señales de analito a partir de señales de la matriz 32. Otra ventaja de la utilización de FTICR-MS es que las intensidades de los grupos de matriz son metaestables reduccióned 33, lo que también reduce estas interferencias 27. El uso de ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) como una matriz de MALDI para obtener imágenes de tejido ha sido previamente reportado 34. En este trabajo actual, se proporciona un protocolo detallado para el uso de DT para el MSI de los lípidos endógenos en las superficies de las secciones de tejido de la lente de la especie bovina, en el modo de ion positivo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Liver</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>56023-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Lens</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>57114-2</td>
			<td>Sample should be decapsulated29 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithranol (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10608</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70990</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85707</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terfenadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td></td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Tuning Mix</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2431A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO Coated Glass Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI1207000</td>
			<td>Ensure that samples are placed on the electrically conductive side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen</td>
			<td>Bic</td>
			<td>WOSQP11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush Sprayer</td>
			<td>Iwata</td>
			<td>Eclipse HP-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagePrep</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>249500-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI adapter</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>235380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dithranol as a matrix for matrix assisted laser desorption/ionization imaging on a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer

De formación de imágenes Espectrometría de masas (MSI) determina los patrones de localización y la distribución espacial de los compuestos sobre la superficie de una sección de tejido, usando principalmente de MALDI (matriz asistida por láser de desorción / ionización) basado en técnicas analíticas. Se necesitan nuevas matrices de molécula pequeña MSI, que pueden mejorar el análisis de bajo peso molecular (MW) los compuestos. Estas matrices deberán ofrecer mayores señales de analitos mientras que disminuye las señales de fondo MALDI. Además, el uso de instrumentos de ultra-alta resolución, tales como iones de transformada de Fourier de resonancia ciclotrón (FTICR) espectrómetros de masas, tiene la capacidad de resolver señales de analito a partir de señales de la matriz, y esto puede superar parcialmente muchos problemas asociados con el fondo procedente de la MALDI matriz. La reducción de las intensidades de los grupos de matriz metaestables por FTICR MS también puede ayudar a superar algunas de las interferencias de la matriz asociados con picos de otros instrumentos. De alta resolucióninstrumentos tales como los espectrómetros de masas FTICR son ventajosas, ya que pueden producir patrones de distribución de muchos compuestos simultáneamente mientras que todavía proporciona confianza en las identificaciones químicos. Ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) ha sido reportado anteriormente como una matriz MALDI para obtener imágenes de los tejidos. En este trabajo, un protocolo para el uso de DT para MALDI imágenes de lípidos endógenos de las superficies de las secciones de tejidos de mamíferos, por-ion positivo MALDI-MS, en un cuadrupolo híbrido ultra alta resolución ha sido proporcionada instrumento FTICR.

<html> Las muestras de tejido que se seccionan y se montaron deshielo en los portaobjetos de vidrio recubiertos de ITO deben estar intactos, sin rotura visible. Para muchos tejidos, montaje sobre un portaobjetos de vidrio recubierto de ITO deshielo tisular directa es aceptable. Para algunos tejidos específicos, tales como lente bovina, extensa desgarro del tejido se ve a menudo cuando se usa un montaje deshielo directa (Figura 1a). Prerrecubrimiento del portaobjetos de vidrio de ITO con etanol o ácido ...

Watch this Scientific Journal Video about Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer at JoVE.com

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

El ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) ha sido reportado anteriormente como una matriz de MALDI para obtener imágenes de tejido de pequeñas moléculas; protocolos para el uso de DT para la formación de imágenes de MALDI de los lípidos endógenos en la superficie de secciones de tejido por-ion positivo MALDI-MS en un instrumento cuadrupolar-FTICR ultra alta resolución se proporcionan aquí.

El ditranol como una matriz para láser asistida por matriz de desorción / ionización de imágenes en una transformada de Fourier de iones de resonancia de ciclotrón Espectrómetro de Masas

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

dithranol-as-matrix-for-matrix-assisted-laser-desorptionionization

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K vistas.  University of Victoria.  El ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) ha sido reportado anteriormente como una matriz de MALDI para obtener imágenes de tejido de pequeñas moléculas; protocolos para el uso de DT para la formación de imágenes de MALDI de los lípidos endógenos en la superficie de secciones de tejido por-ion positivo MALDI-MS en un instrumento cuadrupolar-FTICR ultra alta resolución se proporcionan aquí. 

Video: Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Investigación

Biología

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Cuantificación de mezcla utilizando imágenes por resonancia magnética

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

La mejora de la tasa de éxito de cristalización de proteínas por Random Matrix Microseed Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Enriquecimiento de la Matriz Extracelular Las proteínas de los tejidos y la digestión en péptidos para el análisis de espectrometría de masas

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Carga criogénica de muestras en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de ángulo mágico que preserva la viabilidad celular

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired from&#160;lipidomics is valuable in studying the pathways involved in development, disease, and cellular metabolism. Many tools and instrumentations have aided lipidomics projects, most notably various combinations of mass spectrometry and liquid chromatography techniques. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has recently emerged as a powerful imaging technique that complements conventional approaches. This novel technique provides unique information on the spatial distribution of lipids within tissue compartments, which was previously unattainable without the use of excessive modifications. The sample preparation of the MALDI MSI approach is critical and, therefore, is the focus of this paper. This paper presents a rapid lipid analysis of a large number of Drosophila brains embedded in optimal cutting temperature compound (OCT) to provide a detailed protocol for the preparation of small tissues for lipid analysis or metabolite and small molecule analysis through MALDI MSI.

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

The aim of this protocol is to provide detailed guidance on the proper sample preparation for lipid and metabolite analysis in small tissues, such as the Drosophila brain, using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging.

Preparación de muestras para el análisis rápido de lípidos en el cerebro de Drosophila utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción / ionización láser asistidas por matriz