El protocolo describe cómo registrar un perfil de movilidad iónica para los fragmentos producidos tras la activación de una molécula en el espectrómetro de masas, y discriminar entre estructuras isoméricas. El protocolo permite clasificar los glicanos en 11 grupos con respecto a algunas de sus características estructurales clave, y así proporcionar una información que de otro modo sería difícil de obtener. Puede servir para construir redes moleculares extremadamente genéricas y adecuadas para muchas familias moleculares, como metabolitos o fármacos de interés en muchas áreas de investigación.
El enfoque aprovecha al máximo un nuevo concepto en espectrometría de movilidad iónica, y será útil cuando la espectrometría de masas por sí sola no discrimine entre dos estructuras. El experimento requiere un buen dominio de la espectrometría de masas y la movilidad iónica. Sin embargo, el experimentador debe tener éxito en la implementación del método si uno sigue cuidadosamente cada uno de los pasos.
Demostrando el procedimiento estará Simon Ollivier, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, configure una secuencia IMS de una sola pasada desde la página Sintonizar, coloque el instrumento en modo Movilidad y abra la ventana Control de secuencia cíclica. Seleccione Modo avanzado en la pestaña Funciones cíclicas de esta nueva ventana, seleccione Agregar paquete y, a continuación, Single/Multipass.
Espere a que aparezca una secuencia de eventos de movilidad en la pestaña Secuencia de la misma ventana. Adapte la secuencia para que todos los iones calibrantes hagan una sola pasada alrededor de la pista de carreras cíclica IMS. No cambie el tiempo de inyección o el tiempo de expulsión y adquisición, sin embargo, reduzca el tiempo de separación a un milisegundo.
Si algunos iones de la mezcla de calibración no caben en la ventana de tiempo de llegada mostrada, cambie la sincronización del IMS con el pulsador del analizador TOF de aceleración ortogonal aumentando el número de pulsaciones por contenedor en la pestaña Configuración de ADC. Para grabar una adquisición de dos minutos en la ventana Control de secuencia cíclica, haga clic en Adquirir para abrir la ventana emergente Configuración de adquisición, introduzca el nombre de archivo, la descripción y la duración de la adquisición, minutos y haga clic en Guardar. Cambie el instrumento al modo TOF desde la página MS Tune para comprobar la estabilidad de la señal.
Registre una adquisición completa de la muestra de EM durante un minuto, lo que será útil para verificar el patrón isotópico y la presencia de contaminantes potenciales. Coloque el instrumento en modo MSMS desde la pestaña perfil Quad/MS de la página principal de Tune. Seleccione la masa del hierro objetivo en el campo de masa MSMS para el aislamiento en el cuadrupolo.
Registre una adquisición de un minuto para comprobar el aislamiento del precursor al procesar los datos. Para realizar una selección basada en la movilidad del isómero de interés, cambie el instrumento al modo Movilidad en la ventana Control de secuencia cíclica, en la ficha Funciones cíclicas, seleccione Agregar paquete y, a continuación, Segmentación. Espere a que aparezca una secuencia compleja de eventos de movilidad en la ficha Secuencia.
Coloque el evento Expulsar y adquirir justo después del primer evento Independiente y, a continuación, haga clic en Ejecutar. Busque los resultados de la separación inicial para que se muestren en tiempo real. Aumente la duración del primer evento Separado para una separación multipaso cambiando el valor de tiempo para este evento en la secuencia hasta que la resolución de los picos IMS sea satisfactoria.
Registre una adquisición de un minuto como referencia. Haga clic en Pausar, coloque el evento Expulsar y adquirir debajo de los eventos Expulsar, Expulsar a pretienda y Mantener y expulsar. Ajuste la duración de los eventos para que el pico objetivo esté en la región Expulsar a Pre-Almacenar, y cualquier otro ion esté en la región Expulsar o Mantener y expulsar.
Coloque el evento Expulsar y Adquirir al final de la secuencia debajo de los eventos Reinyect from Pre-Store y el segundo Eventos separados. Haga clic en Ejecutar para mostrar la población seleccionada. Compruebe la calidad del aislamiento.
Registre una adquisición de un minuto como referencia. En la pestaña Secuencia, en la columna situada junto a los tiempos de eventos definidos por el usuario, busque los tiempos resumidos de todos los eventos. Tome nota de los Abdominales de tiempo que se encuentran en la línea del evento Reinject from Pre-Store para realizar la calibración CCS.
Establezca la duración del evento Separado que procede directamente a expulsar y adquirir en un milisegundo. En la línea Reinyectar desde Pre-Store, marque la casilla Habilitar activación y optimice la fragmentación con el control integrado. Si la fragmentación no es satisfactoria con el control incorporado, desmarque la casilla Habilitar activación y proceda a optimizar manualmente los voltajes de reinyección, aumente el gradiente previo a la matriz y reduzca el voltaje de desplazamiento de la matriz hasta que los resultados sean satisfactorios.
Para registrar una adquisición de dos minutos en la ventana emergente Adquisición, marque la opción Retener tiempo de deriva para generar un archivo que contenga solo los tiempos de llegada, en lugar de M sobre Z etiquetado como _dt.raw. Después de realizar el análisis de EM de la mezcla de pentasacáridos arabinoxilano, el espectro mostró un patrón isotópico con un solo pico en M sobre Z 685.24, lo que sugiere que los dos compuestos son de naturaleza isomérica. Los aductos de los pentasacáridos se separaron a través de la célula cíclica IMS, y tres picos se separaron con diferentes tiempos de llegada.
El XA3XX puro muestra los picos en 83 y 90 milisegundos, mientras que el XA2XX exhibe un pico en 94 milisegundos. Después de la primera etapa de separación de IMS, se expulsaron iones pertenecientes a XA3XX, y se seleccionó el pico a 94 milisegundos para el análisis IMS-IMS. Se realizó una separación de tres pasadas después de volver a inyectar el ion sin activación, y se obtuvo un pico para XA2XX a 199 milisegundos.
Los datos IMS-IMS MS generados se descontorlicaron utilizando la hora de llegada y las dimensiones M sobre Z, generando los espectros IMS-IMS. Los picos por encima del 0,2% de intensidad relativa se exportaron para la calibración de CCS, lo que resultó en un espectro IMS-IMS calibrado por CCS-IMS centrado. Siempre es importante verificar el aislamiento del ion precursor, de lo contrario, el espectro puede provenir de una mezcla del compuesto de interés y los contaminantes.
Anteriormente utilizamos espectros IMS-IMS para construir redes y clasificar compuestos, pero también podrían usarse para buscar en bases de datos identificaciones de compuestos. Esta técnica es muy reciente, pero esperamos que sea extremadamente útil en glucómica, así como en cualquier contexto donde los analistas se enfrenten a moléculas isoméricas.
