Los autores agradecen el apoyo financiero de este trabajo por los EE.UU. National Science Foundation con la subvención No. 0719232, por el Departamento de Energía de EE.UU. (DEFG02-01ER15129), y por Protea Biosciences, Inc. (Morgantown, Virginia Occidental). Los autores también desean agradecer a Jessica A. Stolee por su ayuda durante la grabación en vídeo del protocolo.

El siguiente protocolo describe los pasos principales de la ionización electrospray láser de ablación (LAESI) experimento y proporciona ejemplos representativos de lateral y en tres dimensiones (3D) de imágenes de animales y muestras de tejidos vegetales. Otros detalles experimentales y técnicas se pueden obtener de otros lugares. 6.1 1. Preparación y montaje del tejido <ol><li> Si el corte es necesario, utilice un criomicrotomo a la sección de tejido en rodajas gruesas 10-100 micras de -10 a -20 ° C a menos que se recomienda para un tipo de tejido en particular. </li><li> Monte secciones sobre una superficie plana (por ejemplo, químico previo limpiar portaobjetos de vidrio) directamente sin modificadores químicos. Para cortes de tejidos, deshielo de montaje en los sectores y asegurar el soporte de la muestra a una etapa de enfriamiento Peltier-inmediatamente después de la descongelación de montaje para mantener el tejido congelado en todo momento durante el análisis. Este paso es necesario para minimizar / evitar la migración molecular en la sección. </li><li> Si es necesario, utilice un disipador de calor equipadas con un ventilador de baja potencia-para facilitar la extracción de calor de la etapa de Peltier para mantener el tejido congelado. </li><li> En un ambiente húmedo durante un período prolongado de tiempo (1-2 horas), para inspeccionar la condensación de agua o hielo en la superficie del tejido. Condensación de agua en el tejido negativamente afecta al rendimiento de imagen en los experimentos LAESI 1. </li><li> Si es necesario, utilice un deshumidificador habitación o lugar de la muestra enfriada en una cámara llena de un gas inerte (por ejemplo, gas, nitrógeno seco) para evitar la condensación. 1 </li></ol> 2. Optimización de la fuente de iones LAESI La fuente de iones LAESI consta de un láser en el infrarrojo medio, una serie de elementos ópticos para dirigir la luz y el enfoque, así como los titulares adicionales de la muestra, los componentes de enfriamiento, las etapas de traducción, y un sistema de distribución del disolvente. La Figura 1 muestra la disposición típica de estos elementos con respecto a la entrada de la fuente de iones de presión atmosférica de un espectrómetro de masas. <ol><li> Como se ilustra en la Figura 1, la posición de la muestra de 15 a 20 mm por debajo del orificio del cono de masa de muestreo espectrómetro (d O FP-). </li><li> Operar un láser infrarrojo medio en longitud de onda de 2.94 micras y 10 Hz frecuencia de repetición. Atenuar la salida del láser de ~ 100 μJ / pulso de energía. </li><li> Use una combinación de espejos de oro y una lente de enfoque transparente a la longitud de onda de láser (por ejemplo, una cafetería plano-convexo 2 o lentes de ZnSe) para acoplar la energía del pulso láser en la muestra en incidencia normal (ver el ángulo de incidencia con respecto al derecho de superficie de la muestra en la Figura 1). </li><li> La posición del infrarrojo medio eje del haz 8.5 mm por delante del orificio del cono de masa de muestreo del espectrómetro. </li><li> Ajustar la posición de la lente de enfoque y la energía del pulso del haz de láser para lograr la eliminación de tejido en el punto focal. Las dimensiones del volumen de ablación determinar el píxel (o voxel en imágenes tridimensionales) de tamaño de la aplicación de imágenes. </li><li> La posición de un emisor nanospray en línea con el eje de entrada del espectrómetro de masas y en una distancia boquilla con orificio-emisor de ~ 10 mm (ver Figura 1). </li><li> Para el electrospray, prepare solución al 50% de metanol con 0,1% de ácido acético o el 0,1% de aditivo de acetato de amonio para el modo de iones positivos o negativos, respectivamente. Dependiendo de la muestra, otros disolventes orgánicos, tales como acetonitrilo, isopropanol, etc, pueden sustituir el metanol en concentraciones apropiadas para la tarea analítica. La estabilidad de la electrospray es crucial para el éxito de imagen. Dependiendo de la selección del disolvente, el caudal y la tensión de fumigación deben ser ajustados para lograr spray estable. </li><li> De reactivos LAESI 6 en aplicaciones de imagen, la solución electrosprayed puede contener reactivos. </li><li> Use una bomba de una jeringa para aplicar la solución de electrospray a través del emisor de electrospray con un caudal de alrededor de 300 nL / min. </li><li> Si el orificio espectrómetro de masas se mantiene a baja tensión (&lt;500 V medido contra el suelo), generar electrospray mediante la aplicación de alta tensión directamente al emisor electrospray (por ejemplo, 3000 V) oa través de una unión de metal. De lo contrario, baja directamente del emisor electrospray o mediante la unión de metal para establecer electrospray. </li><li> Operar la fuente de electrospray en el cono de chorro de pulverización para la generación de iones de modo más eficiente por LAESI. Para el efecto de las variables que operan en los modos de fumigación y su efecto en los espectros de masas, ver las discusiones en otros lugares. 5,7,8 </li><li> Ajuste cuidadosamente las distancias relativas de la configuración LAESI para optimizar el rendimiento de iones LAESI mientras se mantiene el rayo láser, el emisor, y los ejes de orificios en el mismo plano. Por favor, encontrará las instrucciones detalladas en otros lugares. 5 </li><li> Con un microscopio óptico, determinar las dimensiones laterales del cráter de ablación en la muestra. </li><li> Durante tres dimensiones los experimentos de imagen LAESI, realizar la ablación con pulsos individuales y determinar la profundidad de un voxel utilizando, por ejemplo, el modo de z-stack en microscopía óptica. 3 </li></ol> 3. Imagen Molecular y Análisis de Datos En el experimento de imágenes, la muestra de tejido se mueve en el plano focal del láser en las direcciones X e Y, con tamaños de paso mayor o igual a las dimensiones de la mancha de ablación. La resolución espacial es limitada por el enfoque del rayo láser incidente. <ol><li> Seleccione el área de interés en la superficie de la muestra y obtener el (X, Y) las coordenadas de los límites correspondientes. </li><li> Elija un algoritmo de grillado (por ejemplo, la red de adaptación, las imágenes seleccionadas región, rejilla rectangular, espiral, Z escaneo, etc) con el que trama la superficie de la muestra con una selección de tiempo de permanencia en cada píxel en el área a explorar. </li><li> Utilice una etapa de traducción de tres ejes y un software que es capaz de barrido de la muestra de acuerdo a la red predeterminado. </li><li> Calcular el tiempo total requerido para obtener imágenes. </li><li> Desactivar la adquisición de datos de plazo del espectrómetro de masas. Si esto no es posible, establecer el límite de tiempo de adquisición de datos para el valor de imágenes en tiempo calculado. </li><li> Iniciar la fuente de láser en el infrarrojo medio a una tasa de repetición adecuada para producir suficiente relación señal-ruido en el espectro de masas en el tiempo de permanencia en cada píxel para llevar a cabo un experimento LAESI imagen lateral. De imagen molecular en 3D, utilice una velocidad de adquisición de espectro más alta que la tasa de repetición fuente láser de éxito masivo analizar los iones generados en un pulso de láser. Espere a que la señal de arranque para iniciar la secuencia de la ablación. </li><li> Encienda la fuente de electrospray. Asegúrese de que no es solución suficiente para el tiempo total requerido para obtener imágenes. </li><li> Al mismo tiempo iniciar la adquisición de espectros de masa, la ablación por láser infrarrojo medio, y la exploración de la superficie. </li><li> Cuando la carrera de imagen ha terminado, ¡ALTO a la exploración de la superficie, el láser infrarrojo medio, y la adquisición de datos. </li><li> Desactivar la fuente de láser. </li><li> Apague el alto voltaje. </li><li> Apague la bomba de jeringa. </li><li> Ajuste el espectrómetro de masas para el modo STANDBY. </li><li> Apague el sistema electrónico de refrigeración Peltier. </li><li> Cerrar el flujo de gas inerte, si se utiliza. </li><li> Utilice un software para correlacionar las coordenadas absolutas de los píxeles en las imágenes laterales o en el análisis de los voxels en 3D con los espectros correspondientes. </li><li> Trace la intensidad de la señal de iones seleccionados para un m / z valor frente a las coordenadas absolutas de análisis para la obtención de imágenes moleculares lateral y 3D. </li></ol> 4. Resultados representante La figura 2 muestra resultados representativos para algunos tipos de tejidos principales y las modalidades de imagen. El panel A muestra un caso de una sección de tejido animal que ha sido congelado durante el experimento, para evitar la deshidratación. 1 Además, la muestra se encuentra en un entorno de gas nitrógeno seco para evitar los vapores de agua ambiental se condense en la superficie de la muestra. Una sección de la corona de 100 micras de espesor de un cerebro de rata (Rattus norvegicus) fue fotografiada lateralmente con LAESI. Las regiones anatómicas del cerebro (véase la imagen óptica en el panel A) muestra una buena correlación con la imagen molecular obtenido para la PC plasmalógenos (O-33: 3) y / o PE (O-36: 3) con m / z 728,559. El panel B muestra la imagen en 3D LAESI de una planta de Zebra (Aphelandra squarrosa) tejido de la hoja. Debido a que las hojas poseen un mecanismo de defensa natural contra la deshidratación, la muestra podría ser interrogado en el medio ambiente. 3 El obtuvieron imágenes en 3D molecular reveló una variedad de patrones de distribución de metabolitos primarios y secundarios. Entre otros, acacetin con m / z 285,076 se detectó a cuenta de iones mayores en los sectores de color amarillo de la segunda y tercera capa de la parte superior con una distribución homogénea en los demás. Esta distribución de acuerdo con el patrón de la variegación se ve en la imagen óptica. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema del sistema LAESI (ES, punta de electrospray emisor, o bien que los orificios de la masa del cono de muestreo espectrómetro, FL, lentes de enfoque, FP, punto focal, P, Peltier etapa de enfriamiento, SA, el disipador de calor). Una porción de las partículas expulsadas durante la mitad de la ablación IR (puntos rojos) se funde con el electrospray para producir gotitas cargadas sembrados con moléculas e iones de la muestra (puntos verdes). Los iones liberados de estas gotas son analizados y registrados por el espectrómetro de masas. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Los resultados representativos para el lateral y la imaginación en 3D. ng LAESI con espectrometría de masa (A) El panel superior muestra la óptica de la imagen de un cerebro de rata (Rattus norvegicus) sección coronal y la imagen molecular obtenido para la PC plasmalógenos (O-33: 3) y / o PE (O-36 : 3) con m / z 728,559. La barra de escala blanco corresponde a 1 mm. Adaptado con permiso de (Referencia 1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) La imagen inferior muestra las imágenes en 3D de una hoja de una planta abigarrada Zebra (Aphelandra squarrosa). Acacetin con m / z 285,076 se detectó a cuenta de iones de alta en el sector amarillo de la segunda y tercera capa de la parte superior con una distribución homogénea en los demás. Reproducido con permiso del (Referencia 3). Copyright 2009 Sociedad Americana de Química.

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	<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure,+in+vivo,+and+imaging+mass+spectrometry.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Vertes, A., Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure+molecular+imaging+mass+spectrometry.+Mass+Spectrometry+Imaging.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li><li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays.">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li><li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization.">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li><li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry.">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+mass+spectrometry.">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li></ol>

Diferentes tipos de tejidos presentan un contenido variable de agua y resistencia a la tracción, lo que, a su vez, puede afectar las características de ablación de las muestras. 9 Para mitigar estos efectos, se desea que los protocolos de la fluencia del láser, el manejo de muestras y análisis se revisará cuando se cambia entre principales tipos de tejidos. De celda o de mayor resolución de las investigaciones, a la luz del infrarrojo medio puede ser acoplado a una fibra óptica afilada en lugar de una lente de enfoque. 10 Mediante la colocación de la punta de la fibra en las proximidades de las celdas seleccionadas en un tejido, el análisis LAESI se puede realizar en un nivel de una sola célula. Como una etiqueta sin fuente de iones para la espectrometría de masas de ionización del ambiente, 11 LAESI ha mostrado un gran potencial para la investigación de los procesos bioquímicos en los tejidos. Con los beneficios añadidos de un análisis directo, las imágenes laterales y 3D, LAESI es un nuevo instrumento para la creación de perfiles de bioanálisis, así como aplicaciones de imágenes.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mass spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters Co. (Milford, MA)</td>
<td>Q-TOF Premier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mid-IR laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td>
<td>Vibrant IR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

atmospheric-pressure molecular imaging of biological tissues and biofilms by laesi mass spectrometry

Métodos de ionización del ambiente en la espectrometría de masas permiten a las investigaciones de análisis que se realiza directamente en un tejido o biofilm bajo nativos-como condiciones experimentales. La ablación con láser de ionización electrospray (LAESI) es un desarrollo, y es especialmente adecuado para la investigación de las muestras que contienen agua. LAESI utiliza un rayo láser en el infrarrojo medio (2,94 m de longitud de onda) para excitar las moléculas de agua de la muestra. Cuando el umbral de fluencia de la ablación es excedido, el material de la muestra es expulsado en forma de partículas y los proyectiles de viajar a decenas de milímetros por encima de la superficie de la muestra. En LAESI, esta pluma de ablación es interceptada por las gotas de gran carga para capturar una fracción de la muestra de material expulsado y convertir sus componentes químicos en iones en fase gaseosa. Un espectrómetro de masas equipados con una interfaz de iones de presión atmosférica de origen se emplea para analizar y registrar la composición de los iones liberados procedentes de la zona sondeado (píxel) de la muestra. Un interrogatorio sistemático a través de una matriz de píxeles abre un camino para la imagen molecular en el modo de análisis de microsonda. Un aspecto único de la imagen de masas LAESI espectrométrica perfiles de profundidad que, en combinación con la imagen lateral, permite en tres dimensiones (3D) de imágenes moleculares. Con las actuales resoluciones de la lateral y la profundidad de ~ 100 ~ micras y 40 micras, respectivamente, imágenes LAESI de espectrometría de masas ayuda a explorar la estructura molecular de los tejidos biológicos. En este documento, se revisan los principales elementos de un sistema de LAESI y proporcionar directrices para un experimento de imágenes exitosa.

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Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

La ablación con láser de ionización electrospray (LAESI) es una fuente de iones a presión atmosférica para la espectrometría de masas. En el modo de imagen, una sonda láser en el infrarrojo medio de la distribución de moléculas a través de una sección de tejido o biofilm uno. Esta técnica presenta un nuevo enfoque para los diversos estudios bioanalíticos realizado bajo condiciones experimentales nativos.

Presión atmosférica de Imagen Molecular de los tejidos biológicos y biopelículas por LAESI Espectrometría de Masas

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K vistas.  George Washington University. La ablación con láser de ionización electrospray (LAESI) es una fuente de iones a presión atmosférica para la espectrometría de masas. En el modo de imagen, una sonda láser en el infrarrojo medio de la distribución de moléculas a través de una sección de tejido o biofilm uno. Esta técnica presenta un nuevo enfoque para los diversos estudios bioanalíticos realizado bajo condiciones experimentales nativos.

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Investigación

Biología

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

De la onda T de movilidad de iones-espectrometría de masas: Basic Procedimientos experimentales para el análisis de proteínas complejas

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

El análisis directo de las células individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Enriquecimiento de la Matriz Extracelular Las proteínas de los tejidos y la digestión en péptidos para el análisis de espectrometría de masas

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Aplicaciones de la sonda: Single-Imaging espectrometría de masas y análisis de celda única bajo condiciones ambientales

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi and trans-Golgi network. Cellular functions of the Golgi are determined by the characteristic distribution of its resident proteins. The spatial resolution of conventional light microscopy is too low to resolve sub-Golgi structure or cisternae. Thus, the immuno-gold electron microscopy is a method of choice to localize a protein at the sub-Golgi level. However, the technique and instrument are beyond the capability of most cell biology labs. We describe here our recently developed super-resolution method called Golgi protein localization by imaging centers of mass (GLIM) to systematically and quantitatively localize a Golgi protein. GLIM is based on standard fluorescence labeling protocols and conventional wide-field or confocal microscopes. It involves the calibration of chromatic-shift aberration of the microscopic system, the image acquisition and the post-acquisition analysis. The sub-Golgi localization of a test protein is quantitatively expressed as the localization quotient. There are four main advantages of GLIM; it is rapid, based on conventional methods and tools, the localization result is quantitative, and it affords ~ 30 nm practical resolution along the Golgi axis. Here we describe the detailed protocol of GLIM to localize a test Golgi protein.

The precise localization of Golgi residents is essential for understanding the cellular functions of the Golgi. However, conventional optical microscopy is unable to resolve the sub-Golgi structure. Here we describe the protocol for a conventional microscopy based super-resolution method to quantitatively determine the sub-Golgi localization of a protein.

Localización cuantitativa de una proteína de Golgi por su masa centro de fluorescencia de imagen

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...