Este trabajo se apoya fundamentalmente en un 5-UO1-ES016045 con apoyo parcial de 1-R21-R44-ES019498 y ES021116. DMW fue apoyado por el subsidio de estudios del NIEHS en Toxicología Ambiental T32-ES007020. Equipo fue proporcionada por el Centro de Ciencias de la Salud Ambiental P30-ES002109.

1 Preparación de la viruta <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retire gel de chips del paquete y colóquela en un lado de la película una y placa rectangular, gel de abajo. </li><li> Lavar gel en 25 ml de 1x PBS durante 15 minutos, repetir dos veces. </li><li> Establecer gel en placa de vidrio y orientación de la etiqueta de gel en consecuencia. </li><li> Presione suavemente una placa de 96 pozos sin fondo invertida en el gel; asegurarse de que todos los pocillos de la placa de fondo se encuentran dentro de la zona del gel. </li><li> Utilice 1,5 &#39;&#39; clips de la carpeta en cada lado de la placa de sujeción para asegurar con el vidrio. </li><li> Aspirar el exceso de tampón PBS en cada pocillo. </li></ol> 2. Cargando células <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparar suspensiones de células: <ol><li> Para las líneas celulares en suspensión, se diluye la suspensión de células en un medio para obtener una concentración final de 10 5 -10 6 células / ml. </li><li> Para las líneas de células adherentes, siga / protocolos tripsinización desconexión de normales y dilute células desprendidas en los medios a una concentración final de 10 5 -10 6 células / ml. Si las células se agregan, pasar la suspensión de células en un filtro de células para obtener una suspensión de células individuales. </li></ol></li><li> Añadir 100 l de suspensión celular a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. </li><li> Cubra el plato con la película de gel para evitar la evaporación de los medios de comunicación. </li><li> Permiten a las células para cargar durante al menos 30 min en 37 ° C incubadora. </li><li> Retire el chip de los medios de comunicación de la incubadora y aspirado de cada pocillo. </li><li> Extraiga clips de la carpeta y placa de 96 pozos sin fondo; mantener el chip con la placa de cristal en un ángulo y enjuague suavemente con PBS 1x para eliminar el exceso de células en agarosa. </li><li> Compruebe la carga de células usando un microscopio de campo claro con un lente objetivo de 4X. Si se observa la carga insuficiente, repita desde el paso 2.1. </li><li> Coloque el chip cargado en una superficie plana (mesa de laboratorio). Chip de recubrimiento con un 1% de bajo punto de fusión (LMP) de agarosa que es pre-calentado a 37 ° C. Utilice aproximadamente 2̵Se necesita 3 ml de agarosa LMP para cada chip; 1. </li><li> Permitir superposición se solidifique primero a TA durante 3 min y luego pasar a 4 ° C refrigerador durante 5 min para la gelificación completa. </li></ol> 3. Dosificación y Reparación NOTA: Para el estudio de nivel de daño en el ADN de referencia, vaya al Paso 4. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Alinee con cuidado los pocillos del chip (creado a partir de sujeción anterior) con los pocillos de una nueva placa de 96 pozos sin fondo. Presione nuevamente la placa de 96 pozos sin fondo de sujeción superior y seguro con clips de la carpeta. </li><li> Añadir 100 l de química de dosis deseada a cada pocillo de la placa de 96 pocillos; realizar la dosificación / tratamiento en hielo o en 4 ° C refrigerador por cantidad de tiempo deseada. </li><li> Después de la dosificación, los productos químicos de aspirado de cada bien y enjuagar químico residual utilizando 1x PBS. Si se estudia el daño directo aquí, continúe con el Paso 4. </li><li> Para estudiar la cinética de reparación, permitir que las células en el chip para reparar enlos medios de comunicación a 37 ° C. Lyse (continúe en el paso 4) en puntos de tiempo específicos. NOTA: La reparación se puede realizar en el chip con una placa de 96 pocillos sin fondo adjunto, o el chip puede ser cortado en piezas separadas después de la eliminación de la placa de 96 pocillos sin fondo. </li></ol> 4. Lisis <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para realizar el ensayo cometa alcalino: <ol><li> Hacer trabajar tampón de lisis alcalina mediante la adición de 1% de Triton X-100 a alcalino solución de lisis de stock (2,5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, Tris 10 mM, pH 10). Preparar aproximadamente 25 ml de tampón de lisis de trabajo para cada chip. </li><li> Pre-enfriamiento trabajando tampón de lisis alcalina a 4 ° C. </li><li> Sumergir el chip en tampón de lisis alcalina de trabajo fresco y deje lisis para realizar O / N en 4 ° C refrigerador. </li></ol></li><li> Para realizar el ensayo cometa neutral: <ol><li> Hacer trabajar tampón de lisis neutro mediante la adición de 1% de Triton X-100 y 10% de DMSO a la solución de lisis de stock neutro (2,5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Preparar aproximadamente 25 ml de tampón de lisis de trabajo para cada chip. </li><li> Pre-caliente trabajando tampón de lisis neutral a los 43 ° C. </li><li> Sumergir el chip en tampón de lisis neutral trabajo cálido y permitir la lisis para realizar O / N en el 43 ° C incubadora. </li></ol></li></ol> 5. Electroforesis <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para realizar el ensayo cometa alcalino: <ol><li> Retire tampón de lisis y rápidamente enjuague chip con 1x PBS. </li><li> Seguro del chip en una cámara de electroforesis con el lado película de gel hacia abajo con cinta de doble cara. </li><li> Llevar la cámara a un 4 ° C habitación fría. </li><li> Llenar la cámara con tampón de electroforesis alcalina fría (0,3 M NaOH, 1 mM Na 2 EDTA) a un nivel que sólo cubre el gel. </li><li> Permitir la anulación alcalina durante 40 min. </li><li> Ejecutar electroforesis a 1 V / cm y 300 mA durante 30 minutos en la sala de frío. Ajuste el volumen de tampón de electroforesis en el chamber para lograr actual que se ejecuta deseado. </li></ol></li><li> Para realizar el ensayo cometa neutral: <ol><li> Retirar el tampón de lisis y enjuague chip con tampón de electroforesis neutro (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM de Tris, ácido bórico 90 mM, pH 8,5) durante 2 x 15 min a 4 ° C. </li><li> Seguro del chip en una cámara de electroforesis con el lado película de gel hacia abajo con cinta de doble cara. </li><li> Llevar la cámara a un 4 ° C habitación fría. </li><li> Llenar la cámara con tampón de electroforesis neutral fría (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM de Tris, 90 mM ácido bórico, pH 8,5) a un nivel que sólo cubre el gel. </li><li> Deje que el gel se sentara en la cámara fría durante 60 minutos. </li><li> Ejecutar la electroforesis a 0,6 V / cm y 6 mA durante 60 minutos en la sala de frío. Ajuste el volumen de tampón de electroforesis en la cámara para lograr la corriente de funcionamiento deseado. </li></ol></li></ol> 6. Imaging fluorescente <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retire el chip de la cámara de electroforesis de colsala d. </li><li> Neutralizar los geles en tampón de neutralización (Tris 0,4 M, pH 7,5) durante 2 x 15 min en 4 ° C refrigerador. </li><li> Teñir el chip con la tinción de ADN fluorescente de elección (es decir, Gold SYBR, bromuro de etidio) en fábrica procedimientos recomendados. Image usando microscopía fluorescente. </li></ol> Análisis 7. Datos Analizar cometa imágenes por software estándar de ensayo cometa como Komet 5.5.

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The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

Genotoxinas ubicuas en el medio ambiente y también dentro de las células humanas ejercen estrés inevitable y daños en el ADN celular. De hecho, se ha estimado que hay 1.000 s de lesiones de ADN presentes en las células humanas en estado estacionario 18. La comprensión de la susceptibilidad al deterioro y la cinética de reparación en los seres humanos no sólo aporta conocimientos para la investigación básica, sino que también beneficia el desarrollo de fármacos. Irónicamente, a pesar de la capacidad de daño en el ADN para promover el cáncer, agentes que dañan el ADN se utilizan en niveles muy altos para tratar el cáncer, por lo que el conocimiento sobre el daño y reparación del ADN relevante a la medicina personalizada. El CometChip es un dispositivo de investigación novedosa que utiliza prácticas de microfabricación para revolucionar un ensayo de daño en el ADN-existencia prolongada. Sobre la base de los mismos principios de la prueba del cometa tradicional, el chip ofrece significativamente un mayor rendimiento y una mejor reproducibilidad. Se describen aquí métodos para el uso de este chip. Para aclarar su utilidad y robustez, mostramos los resultados de aquí para allám varios experimentos en los que el chip se ha utilizado para evaluar el daño inducido por varios agentes que dañan el ADN diferente, y donde se ha utilizado para evaluar la reparación del ADN. En conjunto, los resultados presentados aquí proporcionan información útil para utilizar el chip y demuestran su amplia aplicabilidad a la investigación sobre el daño y reparación del ADN. Uno de los pasos más importantes en este protocolo es para llevar a cabo la carga de células eficaz. Muchas líneas celulares se han probado en este sistema, incluyendo tanto la suspensión y las células adherentes. Cargando la eficiencia depende de muchas variables tales como el tipo de células, el tamaño celular, la concentración de carga y el tiempo. Líneas celulares de suspensión como las células linfoblásticas son los más fáciles de trabajar. La concentración de la suspensión de células puede variar de 10 4 a 10 6 células por 96 pocillos y se carga generalmente se completa en 15-30 min. Mayor densidad celular facilita la carga y reduce la cantidad de tiempo necesario para que las células para resolver en los pocillos. Cargando parámetros para células adherentes pueden diferir de las células en suspensión. Se han encontrado líneas celulares tales como ovario de hámster chino (CHO), para tener la eficiencia de carga similar a las células en suspensión (tras tratamiento con tripsina) y así utilizar las condiciones de carga similares. Otros tipos de células, tales como células tumorales que forman fácilmente agregados de células en suspensión, requieren una manipulación adicional. Pasando suspensiones de células a través de un filtro de una sola célula y la adición de tripsina a los medios de suspensión se puede suprimir la formación de grupos de células durante la carga. Finalmente, en términos de tiempo de carga, el tiempo requerido para la captura de líneas de células adherentes en micropocillos puede variar de 20 min a 1 h. Como resultado, se recomienda que los usuarios realizan experimentos piloto para determinar las condiciones de carga óptimas antes de proceder a nuevas investigaciones. Cargando eficacia puede ser visualizado bajo un microscopio de campo brillante o revelado por tinción con más precisión las células encapsuladas con DAPI u otro ADNmanchas antes de la evaluación bajo el microscopio de fluorescencia. Una ventaja importante de este método y el chip es la versatilidad. En primer lugar, los investigadores no están restringidos a una concentración de células específicas de trabajo, porque el exceso de células se lavan, y el microarray asegura uniforme cometa densidad. En segundo lugar, los pocillos pueden hacerse con tamaños variables para adaptarse a los tipos de células de diferentes tamaños. En circunstancias que se capturan varias celdas en una sola microplaca, cometas de celdas multi-son resultados de auto-calibrado y rendimiento consistente en comparación con los cometas de una sola célula 6,7. Otro beneficio de las células modelando en una micromatriz es que todos los cometas son entonces en el mismo plano focal con posiciones fijas, lo que reduce el ruido debido a los cometas desenfocados y facilitar formación de imágenes y análisis automatizado. Las mejoras significativas en el rendimiento y la sensibilidad proporcionados por el CometChip permiten que la aplicación del ensayo para estudios a gran escala. Tomados en conjunto, el chip proporcionarsa herramienta valiosa para la evaluación de daños en el ADN para investigadores, toxicólogos, clínicos y epidemiólogos. Si bien el ensayo cometa es conocido por su excelente sensibilidad en la detección de una amplia gama de daños en el ADN, este ensayo también sufre de baja especificidad. Usando este protocolo mejora en gran medida la reproducibilidad y el rendimiento del ensayo, pero no demuestra avance en la especificidad. Sin embargo, la multiplexación el ensayo con otras metodologías ha sido reportado para ser eficaz en la consecución de una mayor especificidad. Un ejemplo es la inclusión de enzimas purificadas específica de la lesión. Estas enzimas pueden convertir base lesiones de otro modo no detectables en roturas de la cadena detectables y sitios abásicos 1,19-21. Un ejemplo muy utilizado es la endonucleasa de reparación de ADN formamidopirimidina glicosilasa (FPG), que revela modificaciones del ADN oxidativo 19,22. Debido a la etapa de digestión enzimática se aplica después de la lisis celular, el sistema puede ser tratado de la misma manera que unsa tradicional de diapositivas de agarosa y sin alteraciones en el protocolo. Aunque el protocolo detallado no se describe aquí, este enfoque ha sido adoptado por muchos usuarios de ensayo de cometas tradicionales en el pasado y los protocolos se pueden encontrar fácilmente. En una publicación anterior, se utilizó este método para identificar el daño inducido por la luz fluorescente 22. La principal ventaja de este método es el rendimiento que proporciona, que abre las puertas a los estudios que antes eran prácticamente imposible. La capacidad de procesar 96 muestras en la misma plataforma no sólo reduce la mano de obra y tiempo, sino que también reduce los ruidos experimentales y mejora en gran medida la reproducibilidad. Variación de la muestra Inter es significativamente menor que la tradicional variación de deslizamiento a la diapositiva, que puede ser 2 veces mayor que la variación observada con este chip 6,7. Reducción del ruido también conduce a la mejora de la sensibilidad, que permite la detección de las diferencias más sutiles entre las muestras. Debido a que el dispositivo emplea un staándar formato de 96 pocillos, es compatible con el equipo de investigación general y HTS tecnologías. Considere un estudio que requiere la evaluación de 100 muestras, suponiendo que un investigador promedio puede procesar ~ 30 portaobjetos de vidrio en el transcurso de varios días. Teniendo en cuenta que cada muestra debe realizarse por triplicado, se tardaría aproximadamente un mes para completar un estudio de este tipo, que también sufriría inevitablemente de una muestra a otra variación. En contraste, de procesamiento de 100 condiciones, cada uno por triplicado, con este chip requiere sólo unas pocas placas y se puede realizar en tres días. Esta importante mejora en el rendimiento se abre la puerta a los estudios que antes eran inalcanzables. El protocolo que aquí se presenta describe tanto los procedimientos básicos para realizar el ensayo cometa estándar y los pasos modificados necesarios para utilizar la plataforma CometChip. Con la capacidad de medir tanto los niveles de daño de ADN inherentes y la respuesta posterior reparación, el ensayo es altamente relevante parauna variedad de aplicaciones biológicas y clínicas. La información sobre el impacto de la exposición a productos químicos específicos en el genoma facilita la prevención y tratamiento de enfermedades. Además, también existe un interés significativo en la determinación de variaciones en la sensibilidad daño del ADN y la capacidad de reparación entre los individuos 23,24. Esta técnica proporciona el rendimiento requerido para tales estudios a gran escala. El conocimiento de las variaciones inter-individuales es fundamental para la identificación de personas susceptibles y para el diseño de terapias individualizadas o estrategias prevenciones. En conjunto, la tecnología que aquí se presenta ofrece un alto rendimiento, plataforma de análisis de daño en el ADN objetiva y cuantitativa que tiene el potencial para convertirse en una metodología estándar en un futuro próximo.

La electroforesis en gel de células individuales (SCGE) ensayo (también conocido como el ensayo cometa) es una técnica ampliamente utilizada para la cuantificación de un amplio espectro de lesiones del ADN, incluyendo lesiones de bases, sitios abásicos, roturas de cadena simple, doble filamento se rompe, entrecruzamientos y álcalis sensibles sitios. El principio subyacente del ensayo es que el ADN dañado migra más fácilmente que el ADN intacto debido a la fragmentación y pérdida de la estructura superhelical. El grado de migración es proporcional a la cantidad de daño en el ADN, y puede ser visualizado mediante microscopía de fluorescencia. -Captura de imágenes y análisis de perfil de intensidad de ADN en forma de cometa individuo luego entregar mediciones de parámetros tales como la longitud de la cola, momento de la cola, y el ADN% en cola para revelar el nivel de daño en el ADN dentro de una célula 1-4. Actualmente hay dos versiones de uso común de la prueba del cometa: a) ensayo cometa alcalino y b) prueba del cometa neutral. El ensayo cometa alcalino es el más ampliamenteVersión usada, que utiliza un tampón de pH alto para descansar antes de la electroforesis de ADN y por lo tanto detecta todos los tipos de roturas de cadena y sitios sensibles al álcali. El ensayo cometa neutral, por otro lado, es menos practicado porque utiliza un tampón neutro para mantener las dobles hélices y detectar roturas de cadena doble sólo 2,5. Para agentes químicos y físicos que inducen DSBs, SSBs se crean en concierto, y se forman en niveles mucho más altos (por ejemplo, SSBs inducidos γIR son un orden de magnitud más común que las DSB). Para la mayoría de las exposiciones que dañan el ADN, DSB son mucho menos frecuentes que otras clases de daño en el ADN, y por lo tanto son más difíciles de detectar. Hemos demostrado en publicaciones anteriores la ventana de detección de ambas versiones. 6,7 Aunque el ensayo del cometa se ha utilizado de forma rutinaria para la investigación básica en el daño y reparación del ADN y pruebas de genotoxicidad 1,2,8-15, el ensayo se ha informado de que tiene mala reproducibilidad debido a la muestra-to-muestra, de persona a persona y la variabilidad entre laboratorios. Además, el ensayo es de bajo rendimiento, en parte debido a la adquisición de imágenes y análisis de datos son laboriosos. En conjunto, estas limitaciones contribuyen a su relativamente baja aceptación en estudios a gran escala. A través de la integración de tecnologías y principios de la ingeniería, la CometChip aporta una solución a los problemas de rendimiento y las inconsistencias que se asocian con el ensayo cometa tradicional 6,7. Brevemente, para crear el chip, un molde se microfabricado usando fotolitografía para crear microposts con diámetros tan pequeños como el de una sola célula. El molde se utiliza entonces para estampar en agarosa fundida, lo que resulta en una matriz de pocillos después de las gel solidifica. Las virutas se están desarrollando para proporcionar a los investigadores con los pozos de tamaño variable a su compatibilidad con distintos tipos de células. Para cargar el chip, las células en los medios de comunicación se dejan sedimentar en los pocillos por gravedad; el exceso de células son lavados. Atrapado células son luego nos encapsuladosing una fina capa de agarosa de bajo punto de fusión, y una placa de fondo 96 se sujeta entonces a la superficie del gel para crear macrowells 96, cada uno con cientos de micropocillos en su superficie inferior. Este protocolo describe los procedimientos generales para los experimentos con este chip, que incluyen la preparación de gel, carga de las células, la dosificación y la reparación, la lisis celular, la electroforesis, y la imagen fluorescente. Demostramos dos ejemplos de experimentos de dosis-respuesta con células de linfoblastos expuestos agentes que dañan el ADN conocida, utilizando alcalina y versiones neutras del ensayo, respectivamente. Dos experimentos de reparación también se muestran para describir cómo respuesta de reparación después de la exposición puede ser evaluada utilizando el sistema.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

En este primer ejemplo, se describe el enfoque para la cuantificación de los niveles iniciales de daño del ADN en las células linfoblastoides humanas después de la exposición al daño oxidativo usando H 2 O 2. Con el fin de evaluar H 2 O 2 inducida base lesiones y roturas de cadena simple, se utilizan condiciones cometa alcalino. Después de la carga es completa y las células se han encapsulado con la superposición de agarosa, se presiona una placa de 96 pocillos sin fondo sobre la superficie para crear 96-compartimientos en el chip. Cada uno de los 96 pocillos se puede dosificar con un tipo o concentración de los productos químicos diferentes. Aquí se utilizaron cuatro dosis diferentes de H 2 O 2 y 1x PBS se utilizó como control negativo. Imágenes representativas de los cometas dispuestos se muestran en la Figura 1A, donde no tratada (parte superior), 50 M (medio) y 100 M (abajo) H 2 O 2-expuestos muestras demostraron diferentes niveles de colas de los cometas. El análisis de las imágenes del cometa puede PERFORmed usando software disponible comercialmente, que generalmente cuantifica los niveles de daño sobre la base de la distancia total de la intensidad de fluorescencia y la migración de cada cola de cometa. Las mediciones se realizan comúnmente en 50 a 100 cometas por condición y el valor de la mediana (ya sea ADN de la cola% o longitud de la cola) se calcula. Figura 1B ilustra la curva de respuesta de ADN porcentaje cola analizado desde los TK6 cometas de células linfoblastoides expuestos a cuatro concentraciones diferentes de H 2 O 2. La consistencia entre experimentos independientes demuestra la eficacia de este enfoque en la evaluación de respuesta al daño en el ADN de varios niveles de tratamientos químicos en las células. Para aprender acerca de la variación entre las muestras (por ejemplo, entre macrowells) y entre repeticiones del mismo experimento, entre la muestra y la variabilidad inter-experimental se representan en la Figura 2A y 2B respectivamente. Dentro de cada experimento, cada pocillo de la de 96 wchip de ell es equivalente a una muestra diferente y por lo tanto la variación acomodado bien revela la variación entre muestras del dispositivo. Aquí, las células TK6 cargados en 12 pocillos de la viruta de 96 pocillos se trataron con la misma dosis de H 2 O 2 y se lisaron inmediatamente después del tratamiento. Todas las demás etapas experimentales se realizaron en paralelo y las medianas de al menos 50 cometas de cada macrowell se representaron gráficamente en la Figura 2A. El promedio de las medianas de ADN es 77,53% en la cola, con una desviación estándar es de 3,99%. A partir de estos datos, se calcula que el coeficiente de variación entre las muestras es de 5,2%, que es varias veces menor que el ensayo tradicional, lo que demuestra la mejora de la robustez de este ensayo de 6,16. Para obtener información sobre la reproducibilidad del ensayo, expusimos TK6 en un chip con 75 mM H 2 O 2 y analizamos el nivel inmediato de daño en el ADN. Este experimento se repitió seis veces y los datos de cada experimento se representan gráficamente en la Figura 2B. Bajo condiciones experimentales idénticas, se obtuvieron resultados que van desde 41,76% a 57,87%, que se muestra como barras grises en la figura. El promedio de seis repeticiones es 49,57%, con un error estándar de la media de sólo el 2,04%. La baja variación entre repeticiones implica que el ensayo cometa realizado sobre este nuevo dispositivo es altamente reproducible. Para evaluar la cinética de reparación, las células se les permite reparar su ADN en medio fresco después del tratamiento. Lisis macrowells en diversos puntos temporales revela el cambio en el daño del ADN en el tiempo. Un ejemplo se muestra en la Figura 3. En este experimento, se encapsularon células TK6 primero en el chip, se trataron con 50 mM H 2 O 2, y se dejaron para reparar hasta 60 min después de la exposición. Se lisaron las células a los 0, 20, 45 y 60 min respectivamente. Imágenes representativas de cometas en diferentes puntos temporales se muestran en la Figura 3A, y el cambio en los niveles de daño del ADN en el tiempo se trazan en la Figura3B. Estos datos revelaron que casi la totalidad de los daños es reparada dentro de 45 minutos después de H 2 O 2 tratamiento. Muchas variables pueden afectar la tasa de reparación, incluyendo el tipo de línea celular y el agente químico usado. De ahí que los investigadores pueden realizar modificaciones en el protocolo (es decir, se extiende el tiempo de reparación) para dar cabida a las necesidades adicionales en sus investigaciones. Aquí nos proporcionan otro ejemplo de experimento reparación utilizando este chip, en donde TK6 son desafiados con un agente genotóxico diferente N-metil-N &#39;-Nitro- N nitrosoguanidina (MNNG) es un agente de alquilación se sabe que induce lesiones de base incluyendo 7-metilguanina y 3-metiladenina. Estas lesiones se convierten en sitios abásicos, ya sea por despurinación espontánea o por la eliminación enzimática de ADN glycosylases. El sitio abásico resultante se puede escindir en condiciones alcalinas y por lo tanto detecta en el chip. La exposición inicial provoca un aumento significativo en el daño, evidente a partir de la largacolas, y con el tiempo estas colas se reducen a medida que las células restauran ADN intacto durante la reparación. Aunque alquilación y el daño oxidativo son a la vez reparados principalmente por la vía de reparación por escisión de base, la cantidad de lesiones generadas y las proteínas implicadas en la reparación varían. Estas variaciones pueden dar lugar a diferentes tasas de conversión a sitios abásicos, así como diferentes tasas de reparación de los sitios abásicos resultantes. En la Figura 4, la cinética de reparación de las células TK6 expuestos a 0.1, 1, y se muestran 3 g / ml de MNNG. En este experimento, extendemos el tiempo experimento a 2 horas después de la exposición porque el daño inducido por MNNG parece persistir más tiempo y se borra a un ritmo más lento en comparación con el H 2 O 2 inducida por daños. Análisis de DSBs utilizando condiciones neutras es muy similar al protocolo para el análisis de las lesiones de una sola hebra usando las condiciones alcalinas. Para mostrar los niveles de daños iniciales, TK6 fueron expuestos a niveles variables de Gir,<html> y las células resultantes se lisaron y se sometieron a electroforesis a un pH neutro (Figura 5A). Es de destacar que la morfología de las colas de los cometas es diferente de las condiciones de ensayo alcalinas. Para lograr ADN fragmentado observable utilizando este ensayo, la dosis IR utilizado es significativamente mayor (0-100 Gy) que la dosis requerida para ver el daño usando las condiciones alcalinas. Además, encontramos que la longitud de la cola es el parámetro más sensible para reflejar la extensión del daño de ADN cuando se utiliza el ensayo de cometa neutro 7. La curva de respuesta a la dosis analizada se ilustra en la Figura 5B. Reparación del ADN doble filamento se rompe en las células también se puede evaluar, y se ha demostrado por Weingeist et. al. 7. En conjunto, la CometChip neutral ofrece una valiosa herramienta para análisis de alto rendimiento de ADN DSBs. 1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 1. H 2 O 2 dosis respuesta de las células TK6 utilizando ensayo cometa alcalino. (A) los cometas de pocillos en array de linfoblastos no tratados TK6 (parte superior) y TK6 expuestos a 50 M (medio) y 100 M (abajo) H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. La barra de escala es 100 m. (B) H 2 O 2 dosis-respuesta de las células TK6 expuestos a diversos niveles de H 2 O 2. Cada punto de datos es el promedio de tres experimentos independientes, donde se obtuvo la mediana de ADN porcentaje de cola de al menos 50 cometas individuales en cada experimento. Las barras de error representan el error estándar de la media de tres experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Inter-Muestra y el Inter-Experimental Variabilidad. (A) los cambios de muestra a muestra. TK6 de células de linfoblastos humanos se cargaron en 12 pocillos de la viruta 96 pocillos. Cada pocillo fue expuesto a 100 l de 50 mM H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. Las células se lisaron y se ensayó para el ADN% de la cola inmediatamente. Los datos de cada pocillo se muestra aquí. Cada caja representa la mediana al menos 50 cometas individuales de cada pocillo. La media de 12 pozos es 77,53%, la desviación estándar es de 3,99%, y el coeficiente de variación se calcula para ser 5,2%. (B) variación-Experimento-con el Experimento. TK6 células linfoblásticas humanas fueron cargados en el chip de 96 pocillos, se expone a 100 l de 75 mM H 2 O 2 durante 20 min a 4 ° C. Las células se lisaron y se ensayó para el ADN% de la cola inmediatamente.El mismo experimento se repitió 6 veces y los datos de cada repetición se muestra como una barra gris. Cada caja representa la mediana de ADN% de cola de al menos 100 cometas individuales de cada repetición. El promedio de 6 repeticiones es 49.57%, que se muestra como la barra de nuevo aquí. La desviación estándar de 6 repeticiones es 4,99%, y el error estándar de la media se calcula para ser 2,04%, representado como la barra de error en la figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Reparación de H 2 O 2 inducida por daño en linfoblastos TK6. (A) Esquema de estudio de reparación con los cometas representativas. TK6 se tratan con agentes que dañan y se dejan reparar en los medios de comunicación a 37 ° C antes de la lisis. (B) la cinética de reparación de las células TK6 después del tratamiento con 50 mM H 2 O 2 durante 20 min a 4 y #176; C. Cada punto de datos es el promedio de tres experimentos independientes, donde se obtuvo la mediana de ADN porcentaje de cola de al menos 50 cometas individuales en cada experimento. Las barras de error representan el error estándar de la media de los experimentos repetidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Reparación del daño inducido por MNNG en linfoblastos TK6. TK6 células se tratan con 0,1, 1 y 3 mg / ml MNNG durante 30 min a 4 ° C y se dejó para reparar en los medios a 37 ° C hasta 120 min después de la exposición. La mediana de ADN porcentaje de cola de al menos 50 cometas individuales se obtuvo para cada uno de tres experimentos independientes. Las barras de error representan el error estándarde la media de tres experimentos independientes. <img alt="Figura 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> Figura 5. Respuesta a la dosis de IR TK6 utilizando ensayo cometa neutral. (A) Vestida cometas micropocillos de linfoblastos no tratados TK6 (arriba) y TK6 expuestas a 40 Gy (mediana) y 80 Gy (abajo) la irradiación gamma. La barra de escala es 100 m. Respuesta a la dosis (B) IR de TK6 expuestos a diversos niveles de irradiación gamma. Cada punto de datos representa la longitud de la cola mediana (micras) de al menos 300 cometas agrupados de seis macrowells en el chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Se describe aquí una plataforma que permite la detección ensayo cometa de daño en el ADN con un rendimiento sin precedentes. Los patrones de dispositivos células de mamífero en un microarray y permite el procesamiento paralelo de 96 muestras. El enfoque facilita el análisis de daño en el DNA nivel de base, daño en el ADN inducido por la exposición-y de reparación del ADN cinética.

CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K vistas.  Massachusetts Institute of Technology.  Se describe aquí una plataforma que permite la detección ensayo cometa de daño en el ADN con un rendimiento sin precedentes. Los patrones de dispositivos células de mamífero en un microarray y permite el procesamiento paralelo de 96 muestras. El enfoque facilita el análisis de daño en el DNA nivel de base, daño en el ADN inducido por la exposición-y de reparación del ADN cinética. 

Video: CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Investigación

Bioingeniería

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Plataforma de microfluidos para la medición de quimiotaxis de neutrófilos a partir de sangre entera sin procesar

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: Un protocolo para la de alto rendimiento automatizado tomografía crioelectrónica

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Fenotipado de tensión de levadura de alto rendimiento con secuenciación de ARN basada en gotas

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...