Los autores desean agradecer a Malinda Spry para la asistencia técnica. También reconocemos las fuentes de financiación actuales y pasados: el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), el Fondo de Investigación Wendy Will Caso del Cáncer, la Fundación de Cáncer de Markey, Red del Milagro de los Niños y la Jennifer y David Melanoma Research Foundation Dickens.

1. Preparación de forskolina para la administración tópica de un extracto de la raíz cruda de la planta Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) <ol><li> Los protocolos para experimentos murinos siguen las pautas de conducta ética en el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad de Kentucky (Protocolo # 00768M2004). El extracto de raíz se compone en peso 40% / volumen en una base dermatológica estándar de etanol al 70%, 30% de glicol de propileno. </li><li> Pesar 200 g de extracto de raíz de forskolina crudo y transferirla a un vaso de precipitados. Para hacer 500 ml de un 40% (w / v) de solución, volver a suspender 200 g de extracto de raíz de forskolina crudo mediante la adición de la mayoría, pero no todo el volumen del vehículo (etanol 70%, 30% de glicol de propileno) y llevar la solución a aproximadamente 450 ml. </li><li> Se agita durante una hora a temperatura ambiente. La solución será algo viscoso y puede requerir agitación manual para &quot;levantar&quot; el extracto en solución antes dela barra de agitación es capaz de tomar el relevo. </li><li> Después de una hora de agitación, se vierte la mezcla en un cilindro graduado y llevar el volumen a 500 ml utilizando vehículo que ha sido utilizado para &quot;enjuagar&quot; el vaso de precipitados que se usó para agitar la suspensión (para maximizar la recuperación de forskolina del vaso de precipitados) . </li><li> Transferir la suspensión a 50 ml de tubos de centrífuga de polipropileno. Se centrifuga (1.500 xg, la temperatura ambiente, 15 min), utilizando una centrífuga de mesa. En este punto, el material insoluble será bastante compactado, permitiendo que el sobrenadante sea fácilmente por vertido. </li><li> Filtrar la solución a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micras para eliminar cualquier material insoluble residual a partir del extracto. Nosotros utilizamos un sistema de botella de la parte superior diseñada para el cultivo celular, junto con el uso de pre-filtros que vienen con la unidad para evitar la obstrucción prematura de la membrana a partir de componentes insolubles del extracto de la raíz. Al hacer grandes volúmenes de extracto, aproximadamente 100 ml de filtrado a la vez, el cambio de la apuesta pre-filtroween cada volumen añadido. </li><li> Cuando se almacena a temperatura ambiente, el extracto mantiene la actividad biológica hasta para un máximo de un año. </li></ol> 2. Preparación de C57Bl / 6 K14-Scf Ratones para Tratamientos tópicos <ol><li> Retire la piel dorsal de los animales por cizallamiento eléctrica. Brevemente anestesiar a los animales con isoflurano inhalado para facilitar la esquila de la piel dorsal con cizallas eléctricas equipadas con un cabezal de preparación quirúrgica de 0,25 mm (Fisher Scientific). Preferentemente utilice sólo un tipo de anestesia (por ejemplo, la ketamina / xilazina) para minimizar el riesgo de una sobredosis de anestesia. La cámara de inhalación saturada lleva riesgos laborales cuando se utiliza fuera una campana de extracción y entrega cantidades desconocidas de anestesia a los animales. Lo ideal sería que un vaporizador de precisión se debe utilizar. </li><li> Para quitar el rastrojo de pelo residual, tratar a los animales con un depilatorio químico. Administrar anestesia al animal con una inyección ip de ketamina 40 mg / kg de xilazina y 4 mg / kg </li&gt; <li> Una vez que los animales son anestesiados adecuadamente (a juzgar por la pizca dedo del pie), aplique una cantidad del tamaño de la yema del dedo de la crema depilatoria a la piel dorsal cortado usando un dedo enguantado. Frote la crema sobre la piel durante 30 a 60 segundos o hasta que los pelos se pueden ver claramente en la crema, ya que se mueve alrededor. Deje la crema en sólo por la cantidad mínima de tiempo que se requiere para la depilación como la exposición prolongada conduce a quemaduras químicas en la piel, la ruptura de la epidermis y la muerte por la pérdida de la integridad de la epidermis. </li><li> Limpie la piel dorsal con gasas empapadas de agua varias veces hasta que toda la crema se ha eliminado. Animales secos utilizando toallas de papel suave, y permitir que se recuperen en un lugar aislado en caliente (por ejemplo, jaulas limpias colocan en una almohadilla de calentamiento). Depilar los animales de uno en uno y vigilar de cerca durante todo el procedimiento. </li></ol> 3. La administración tópica de forskolina o de control del vehículo <ol><li> Los animales deben ser tratados uno a la vez. Brevemente anestesiar con inhalard isoflurano colocando el ratón encima de un nylon filtro permeable al aire en formularios provistos bajo el cual se ha colocado una toalla de papel isoflurano-saturada en un frasco de vidrio con tapa transparente isoflurano-saturada en una campana de humos. Exponer el ratón para isoflurano durante un tiempo suficiente como para suprimir los movimientos musculares voluntarios pero para preservar la respiración espontánea (típicamente 10-20 seg). Saliendo del animal en el isoflurano demasiado tiempo dará lugar a la supresión respiratoria y muerte. Es mejor errar en el lado de &quot;ir la luz&quot; y tener que volver a exponer el ratón brevemente para más isoflurano en lugar de a la sobre-exponer al animal a la muerte de drogas y el riesgo. </li><li> Retire el animal de la cámara de isoflurano y colocar en un bloc banco absorbente limpio. </li><li> Utilizando una micropipeta 1000 l equipado con una punta desechable de polipropileno, elaborar 400 l de extracto crudo forskolina 40% (animales de control de vehículos recibirán etanol al 70%, el 30% de propilenglicol solo). </li><li> Transferir el extracto sobre lalomo del animal por goteo que sobre la piel y, a continuación, usando el lado de la punta de pipeta, manchar el extracto sobre la piel dorsal hasta que toda la piel ha sido cubierto. No hay necesidad de secar la piel después de la aplicación. </li><li> Devuelva el ratón a su jaula, y observar con cuidado hasta que se recupere de la anestesia. </li><li> Con el fin de que los efectos de cAMP no pigmentos no deben confundir a experimentos de sensibilidad UV, deje todos los tratamientos tópicos 2 días antes de la exposición UV (pigmento de efecto dura varios días más allá del último tratamiento tópico). </li></ol> 4. Piel de medición del color por Reflective Colorimetría <ol><li> Brevemente anestesiar al ratón con isoflurano inhalado (véase más arriba). </li><li> Calibrar un colorímetro Minolta colocando la cabeza portátil en la superficie blanca estandarizada proporcionada con el colorímetro. </li><li> Coloque el cabezal de medición portátil de la descarga colorímetro con la piel dorsal del animal asegurando que la apertur ronda 1 cm2e está completamente presionado sobre la piel. Tome al menos tres mediciones separadas en diferentes áreas de la piel dorsal. </li><li> Calcula media L * Partitura ± SD por animal y por grupo de tratamiento. Colorimetría reflectante se puede hacer en cualquier punto en el experimento. </li></ol> 5. Determinación de la sensibilidad UV mediante el cálculo de &quot;Mínimo eritematosa Dose&quot; (MED) <ol><li> Utilice los animales que han sido pre-tratadas con vehículo o forskolina como se describió anteriormente. Anestesie animales con inyección intraperitoneal de una mezcla estándar de ketamina y xilazina (véase más arriba). </li><li> Prepare un trozo de cinta-UV oclusiva para las pruebas de MED. Para generar agujeros en la cinta, utilice una perforadora de alta resistencia con un recorte circular de 1 cm 2 (Figuras 2A y B). Tener orificios de un tamaño definido y la disposición simétrica de la cinta facilita el reconocimiento de los cambios en la piel después de la irradiación. Sobre cada agujero en la cinta, aplique una pequeña pero fácilmente desmontable pieza<html> de cinta que se puede quitar en momentos definidos durante la exposición UV para permitir la administración de diferentes dosis de UV. </li><li> Una vez que el animal está sedado adecuadamente, coloque la cinta en la superficie dorsal. Lubricante de ojos siempre se debe utilizar bajo anestesia. </li><li> Encienda la fuente de UV consiste en dos Westinghouse F15T8UV-B lámparas con una potencia máxima de 313 nm y un rango de 280-370 nm. Deje que la lámpara se equilibre a una salida de UV constante, medida por un fotómetro UV con un sensor de UVB (generalmente toma unos pocos minutos para las lámparas para calentar). </li><li> Sobre la base de la tasa de transmisión de luz UV tal como se mide por el fotómetro UV, calcular el tiempo de exposición UV para cada dosis deseada. Por ejemplo, las medidas de producción de UVB de nuestra lámpara de 2,4 mW / cm 2. Por lo tanto, para administrar 5 kJ / m 2, tendría que ser expuesto a 208 seg (que es 3 min y 28 seg) de la radiación UVB, tal como se calcula por debajo de la piel: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Coloca los animales sedados (cada uno con cinta oclusiva en su lugar) ventral superficie hacia abajo para asegurar una visibilidad aún UV. Para administrar las dosis escogidas de la radiación UV, eliminar secuencialmente las pequeñas cintas oclusivos que cubren los agujeros para exponer 1 cm 2 zonas de la piel a las dosis correctas de la radiación. Por lo tanto, usando el ejemplo anterior, si 40 kJ / m 2 es la dosis más grande en el experimento, entonces el animal estaría bajo la lámpara durante 27 min y 47 seg total y la piel en la condición de 40 kJ / m 2 no tendría ningún cinta que recubre todo el tiempo. Sin embargo, la cinta que recubre la condición 5 kJ / m 2 sería eliminado cuando hay 208 seg restante en la exposición. Momento de la eliminación de la cinta se debe hacer de manera que cada condición termina simultáneamente. </li><li> Después de la exposición UV, despegue la cinta adhesiva de la piel dorsal con cuidado, con cuidado de no rasgar la piel con movimientos bruscos o excesivamente contundentes. Coloque los animales en un lugar cálido tranquilo para permitirrecuperación de la anestesia. </li><li> Monitorear ratones durante 24-48 h para buscar áreas discretas de eritema (enrojecimiento) o edema (hinchazón) que corresponde a los sitios anatómicos expuestos a la dosis específica de radiación UV. Documentar los hallazgos cutáneos fotográficamente. </li><li> Valor MED corresponde a la dosis mínima de rayos UV que causa la inflamación tal como se define por eritema y / o edema de todo el círculo de la piel expuesta. Tenga en cuenta que la pigmentación de la piel puede impugnar la determinación del MED, sin embargo, eritema y edema todavía pueden generalmente ser evaluados con precisión, gracias en parte a la forma definida de las aberturas en la cinta durante la exposición UV. </li></ol> 6. Análisis estadístico Analizar los datos entre las cohortes de ratones mediante ANOVA de una vía con post test de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Valores de p &lt;0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Usando un modelo animal de la humana de piel clara, nos encontramos con que la aplicación tópica de un extracto de la raíz cruda forskolina ricos oscurece robustamente la epidermis estimulando la producción de melanina en la piel. Melanización epidérmico es dependiente de la expresión de factor de células madre en la epidermis basal, como ocurre en la piel humana pero no en la piel sin modificar genéticamente-ratón. La piel dorsal de los ratones genéticamente-no modificada carece de un número suficiente de m...

La incidencia de melanoma, la forma más mortal de cáncer de piel, se ha incrementado dramáticamente en las últimas décadas en Estados Unidos, sobre todo entre las personas de piel clara. Evidencia molecular y epidemiológico fuerte implica la radiación UV como un importante factor ambiental causante 2-5. Aumento de la exposición UV en forma de exposición al sol y el uso de camas de bronceado es probable que sea responsable de gran parte de los aumentos en la incidencia de melanoma 6-7. Riesgo del melanoma parece especialmente vinculado con las quemaduras de sol 8, sobre todo los primeros años de vida 9-10. Riesgo de quemaduras de sol no sólo está ligada a la dosis y la intensidad de los rayos UV, sino también por factores hereditarios que influyen en la respuesta cutánea a la radiación UV. Pigmentación de la piel es uno de los determinantes más importantes de la sensibilidad UV, el riesgo de quemaduras solares y el riesgo de cáncer. El melanoma se presenta aproximadamente veinte veces más frecuente en personas de piel clara en comparación con la individualización de piel oscurals 11-13. La melanina, un pigmento producido por los melanocitos en la epidermis, es el principal determinante de la tez de la piel. La melanina se presenta en dos variedades principales: (1) eumelanina, un pigmento de color marrón oscuro / negro eficaz en la absorción de la energía de la radiación UV, y (2) feomelanina, un color rojizo / pigmento rubia menos eficaz en la prevención de la penetración de los fotones UV en la piel. Color de la piel, sensibilidad UV y el riesgo de melanoma están determinados en gran medida por el contenido de eumelanina epidérmica 14-15. El más eumelanina en la epidermis, los menos fotones UV puede penetrar en la piel. Debido a los bajos niveles de la eumelanina innatas, las personas de piel clara son mucho más propensos a los efectos agudos y crónicos de la radiación UV 16-18. Pigmentación de la piel, el riesgo de melanoma y la capacidad de &quot;tan&quot; después de la exposición UV todo se correlacionan con la capacidad de señalización de la melanocortina 1 del receptor (Mc1r), un G s acoplado y siete transmembrana sreceptor urface en melanocitos 19-22. Cuando Mc1r se une a su ligando cognado de alta afinidad, la hormona estimulante de melanocitos α-(α-MSH), hay una activación de la adenilato ciclasa y la producción del segundo mensajero AMPc 23. La respuesta fisiológica normal de la piel después de la exposición UV incluye la producción epidérmica de α-MSH por los queratinocitos 24-29. Nosotros y otros la hipótesis de que los queratinocitos derivados de α-MSH se une a Mc1r en melanocitos epidérmicos, iniciando la producción aguas abajo del segundo mensajero AMPc a través de la activación de la adenilato ciclasa 30. niveles de cAMP controlan muchos aspectos de la diferenciación de los melanocitos, incluidas las vías de supervivencia, la reparación del ADN y la síntesis del pigmento. De señalización Mc1r y AMPc inducen claramente los niveles de enzimas y la producción de pigmento eumelanina. Cuando la señalización Mc1r está intacto y los niveles de cAMP melanocíticos son robustos, la eumelanina se produce y la piel se oscurece. Sin embargo, si la señalización Mc1r es defectuoso yniveles de cAMP citoplasmáticos siguen siendo bajos, la feomelanina se produce en lugar de 1. Síntesis de eumelanina se puede estimular farmacológicamente por los agentes que elevan los niveles de cAMP 1,14,31-35. Dado que la proteína Mc1r es un importante regulador de riesgo de melanoma en humanos 36-46, estamos interesados ​​en los mecanismos por los cuales Mc1r protege melanocitos contra la carcinogénesis inducida por UV. Como base para nuestros estudios, hemos generado un modelo murino Mc1r variante transgénica en una pura C57BL / 6 antecedentes genéticos 1. En este modelo, factor de células madre (SCF) se expresa constitutivamente en la epidermis basal y epidérmicas melanocitos interfollicular se retienen en la piel durante toda la vida 47, en contraste con los ratones no transgénicos en los que los melanocitos se localizan en la dermis en los folículos pilosos. Con el transgén K14-Scf incorporada, la epidermis se vuelve pigmenta con la característica de pigmentos de melanina en particular del pigmentocepa del animal 1. ratones K14-Scf en el fondo genético C57BL / 6 con el tipo salvaje señalización Mc1r tiene la piel de color negro azabache que se caracteriza por niveles muy altos de pigmento eumelanina. No es sorprendente que estos animales son altamente resistente a rayos UV. En contraste, genéticamente compatibles K14-Scf C57BL / 6 animales que albergan un mutante inactivo Mc1r casi no tienen eumelanina en la epidermis. En cambio, estos animales &quot;extensión&quot; (Mc1r e / e) tienen una tez de piel blanca causada por el depósito de pigmento feomelanina (Figura 1A) y son mucho más sensibles a la radiación UV-48-49. Compuestos farmacológicos con propiedades químicas que permiten la penetración en la piel han demostrado inducir potentemente eumelanina en la extensión (Mc1r E / E) modelo animal K14 SCF por la manipulación directa de los niveles de cAMP en los melanocitos epidérmicos en la piel. La regulación positiva de melanina en este modelo ha sido reported por la activación de la adenilato ciclasa 1, así como la inhibición de la fosfodiesterasa 4 35. En este artículo, se demuestra la preparación y aplicación tópica de forskolina en extensión (Mc1r e / e) animales K14-Scf qué modelo de lo humano-UV sensible de piel clara. Se demuestra que la aplicación dos veces al día del medicamento promueve melanización acelerado, este oscurecimiento de la piel es debido a la deposición epidérmica de pigmento de melanina y que la melanina epidérmica inducida protege contra las quemaduras solares inducidas por UV a través de la medición de la &quot;dosis mínima eritematosa&quot; (MED) 48.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coleus Forskoli extract 20%</td>
			<td>Buckton Scott USA Inc. </td>
			<td>n/a</td>
			<td>Princeton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isothesia, Isoflurane , USP</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>NCD 11695-6776-1</td>
			<td>Dublin, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased Injection</td>
			<td>LA04612</td>
			<td>Shenandoah, Iowa, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl, USP</td>
			<td>Putney</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>St. Joseph, MO, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs.</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Adesco</td>
			<td>05751L</td>
			<td>Solon, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Depilatory cream, Nair</td>
			<td>Church &amp; Dwight</td>
			<td>JF-11 4381322</td>
			<td>Priceton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Germicidal Hg Lamp UV-B</td>
			<td>Westinghouse</td>
			<td>F15T8UV-B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Radiometer photometer</td>
			<td>International light</td>
			<td>1LT400A</td>
			<td>Peabody, MA,USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chromameter</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>CR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data Processor for 	Chromameter CR-400</td>
			<td>Konica Monilta</td>
			<td>DR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

pharmacologic induction of epidermal melanin and protection against sunburn in a humanized mouse model

La equidad de la piel, sensibilidad UV y riesgo de cáncer de piel en todo correlaciona con la función fisiológica del receptor de melanocortina 1, una proteína de señalización T s acoplado encuentra en la superficie de los melanocitos. Mc1r estimula la adenilciclasa y la producción de cAMP que, a su vez, hasta regula la producción melanocíticos de melanina en la piel. Con el fin de estudiar los mecanismos por los que la señalización Mc1r protege la piel frente a la lesión UV, este estudio se basa en un modelo de ratón con &quot;piel humanizado&quot;, basada en la expresión epidérmica de factor de células madre (SCF). Ratones transgénicos K14-Scf conservan melanocitos en la epidermis y por lo tanto tienen la capacidad de depositar la melanina en la epidermis. En este modelo animal, de tipo salvaje resultados del estado Mc1r en la deposición sólida de pigmento eumelanina negro y un fenotipo con protección UV. En cambio, los animales K14-SCF defectuosa señalización Mc1r capacidad presentan una pigmentación rojo / rubio, muy poca eumelanina en la piel yun fenotipo sensible a UV. Razonando que la deposición de eumelanina que se podría mejorar por agentes tópicos que imitan la señalización Mc1r, encontramos que la aplicación directa de extracto de forscolina para la piel de ratones de piel clara Mc1r defectuosa como resultado robusto inducción eumelanina y la protección UV 1. A continuación se describe el método para la preparación y la aplicación de un extracto de la raíz natural que contiene forskolina a K14-Scf ratones de piel clara, y presentarán un método para medir la sensibilidad UV mediante la determinación de la dosis eritematosa mínima (MED). El uso de este modelo animal, es posible estudiar la forma en la inducción de AMPc epidérmica y melanización de la piel afectan a las respuestas fisiológicas a la exposición UV.

C57BL / 6 ratones fueron generados sobre fondos eumelanotic, pheomelanotic o amelanóticos que incorporan el transgén K14 SCF tal como se describe (Figura 1A). Cohortes de extensión de piel clara (Mc1r E / E, + / + Tyr) los ratones se trataron tópicamente con dosis dos veces al día de vehículo (etanol 70%, 30% de glicol de propileno) o 40% de extracto de raíz de Coleus forskohlii crudo (80 micras por dosis) durante 5 días (Figura 2 B). Efectos de los ...

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Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Melanina epidérmica es inducida por la aplicación tópica de forskolina en un modelo murino de lo humano-UV sensible de piel clara. La manipulación terapéutica de los niveles de AMPc en la piel y el oscurecimiento de la epidermis a proteger firmemente contra la inflamación mediado por UV (quemadura solar) según lo medido por la dosis eritematosa mínima (MED) de ensayo.

La inducción farmacológica de la melanina epidérmica y Protección contra las quemaduras solares en un modelo de ratón humanizado

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K vistas.  University of Kentucky College of Medicine.  Melanina epidérmica es inducida por la aplicación tópica de forskolina en un modelo murino de lo humano-UV sensible de piel clara. La manipulación terapéutica de los niveles de AMPc en la piel y el oscurecimiento de la epidermis a proteger firmemente contra la inflamación mediado por UV (quemadura solar) según lo medido por la dosis eritematosa mínima (MED) de ensayo. 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modelo de ratón En el útero Trasplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Investigación

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

La inmunoterapia sublingual como alternativa para inducir protección contra las infecciones respiratorias agudas

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Establecimiento y caracterización de IU y ITUAC en un modelo de ratón

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic differentiation and immune function of the genetically modified cells. The humanized Bone-marrow/Liver/Thymus (BLT) mouse model allows for full reconstitution of a human immune system in the periphery, which includes T cells, B cells, NK cells and monocytes. The human thymic implant also allows for thymic selection of T cells in autologous thymic tissue. In addition to the study of HIV infection, the model stands as a powerful tool to study differentiation, development and functionality of cells derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Here we outline the construction of humanized non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient (SCID)-common gamma chain knockout (c&#947;-/-)-Bone-marrow/Liver/Thymus (NSG-BLT) mice with HSCs transduced with CD4 chimeric antigen receptor (CD4CAR) lentivirus vector. We show that the CD4CAR HSCs can successfully differentiate into multiple lineages and have anti-HIV activity. The goal of the study is to demonstrate the use of NSG-BLT mouse model as an in vivo model for engineered immunity against HIV. It is worth noting that, because lentivirus and human tissue is used, experiments and surgeries should be performed in a Class II biosafety cabinet in a Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+) facility.

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Generación de un ratón humanizado hígado uso de células madre hepáticas humanas

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Inducción de la Aterosclerosis Acelerada en Ratones: El Modelo de "Lesiones por Alambre"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Microscopia intravital y trombos de inducción en el lóbulo de la oreja de un ratón sin pelo

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Inducción y Micro-CT en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...