Se ha reportado reprogramación directa para generar melanocitos. Sin embargo, varios factores de transcripción se utilizan en diferentes estudios. En este protocolo, validamos y redujimos el número de factores de transcripción aún con una mayor eficiencia de reprogramación.
Establecimos un sistema de reprogramación directa para generar melanocitos utilizando solo tres factores de transcripción, Mitf, Sox10 y PAX3, y modificamos el sistema de cultivo para hacerlo más estable y robusto. Cómo regenerar los melanocitos funcionales es una pregunta importante que puede ayudar a abordar las limitaciones de la terapia para las enfermedades de despigmentación como el vitiligo. La reprogramación correcta proporciona una perspectiva Nuestra técnica tiene las características de conveniencia, fuerte operatividad y estabilidad, que es más fácil de promover y repetir.
Para comenzar la producción del lentivirus concentrado, coloque la placa 1.5 veces 10 a las 6 células HEK-293T en un plato de 60 milímetros, y cultive las células con medio normal a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas de la incubación, cuando las células HEK-293T hayan alcanzado una confluencia del 80 al 90%, reemplace el medio con 3.5 mL de DMEM, luego incube las células a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono durante dos horas. Después de retirar las células de la incubadora, reemplace el medio con DMEM que contenga 2% FBS y agregue la mezcla compleja de transfección recién preparada a las células de manera aleatoria.
Mezcle la mezcla líquida suavemente. Al finalizar ocho horas, cambie el medio celular con 3,5 ml de medio normal. Recoger el sobrenadante del virus a las 24 y 48 horas.
A continuación, mezcle los sobrenadantes del virus recolectados en dos puntos de tiempo diferentes y centrífuga la mezcla a 200 xg durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego pase el sobrenadante recolectado a través de filtros de 0.45 micras para recolectar el filtrado en un tubo cónico estéril de 50 ml. Concentre el sobrenadante del virus filtrado por centrifugación a 6.000 xg a cuatro grados centígrados durante la noche.
Una vez hecho esto, asegúrese de que el gránulo del virus sea visible en la parte inferior del tubo cónico. Vierta el sobrenadante lentamente. Para disolver el gránulo del virus en el medio normal con uno por 100 * volumen del sobrenadante del virus.
Use una micropipeta P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente hasta obtener una mezcla homogénea de virus concentrado 100x. Divida el virus concentrado en los tubos de la microcentrífuga para almacenarlo a 80 grados centígrados. Placa 1 veces 10 a la 5ª célula HEK-293T en un pozo de una placa de seis pocillos.
Cultive estas células con el medio normal a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, agregue de 0.1 a 0.2 microlitros del virus concentrado fluorescente 100x a cada pocillo. Seguido de la adición de cuatro nanogramos por microlitros del reactivo de transfección polimérica catiónica a cada pozo.
Alrededor de ocho a doce horas después de la infección con el virus, reemplace el medio con el medio normal. A las cuarenta y ocho horas después de la infección, lave el plato con 1 ml de PBS estéril para eliminar las células muertas. Luego tripsinizar las células usando 250 microlitros de solución de tripsina-EDTA al 0.05% por pocillo de una placa de seis pocillos a temperatura ambiente.
Centrifugar la placa a 200 xg durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en un ml de PBS y agregue la suspensión celular a un tubo de fondo redondo de poliestireno de cinco ml. Luego coloque el tubo en el citómetro de flujo para analizar la muestra.
Para la reprogramación directa de fibroblastos, cubra un pocillo de una placa de cultivo celular de seis pocillos con 1 ml de solución de gelatina al 0,1% a temperatura ambiente. Después de 15 a 30 minutos, cuando el pozo esté completamente cubierto con la gelatina, aspire la solución de gelatina al 0,1%. A continuación, coloque 5 veces 10 a los 4º fibroblastos embrionarios de ratón, o MEF, en un pozo de una placa de seis pocillos recubierta con gelatina al 0,1%, y cultive las células durante la noche con el medio normal a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono.
Después de 24 horas, cuando los MEF hayan alcanzado una confluencia del 40 al 50%, reemplace el medio por el medio normal. A continuación, derrita el virus congelado y concentrado en el hielo. Calcule el volumen del virus que se agregará utilizando la ecuación y luego agregue el virus concentrado para los seis factores de transcripción a cada pozo, de acuerdo con el volumen calculado.
Agregue cuatro microgramos por ml del agente de transfección polimérica catiónica al pozo. Considéralo como el día cero de la infección por lentivirus. El primer día, después de 8 a 12 horas de infección, reemplace el medio que contiene el virus con el medio normal fresco, mientras agrega 0.5 microgramos por ml de puromicina para detectar líneas celulares infectadas estables.
En el segundo día, 48 horas después de la infección, reemplace el medio sobrenadante gradualmente con el medio de reprogramación. Cambie una cuarta parte del volumen medio total antes de agregar tres micromolares CHIR99021. Desde el tercer día hasta el día siete, dependiendo de la condición de las células, cambie el medio reemplazándolo gradualmente con una mayor proporción de medio de reprogramación para cambiar al medio de reprogramación completo dentro de los cinco días.
A continuación, separe las células con 500 microlitros de enzima digestiva tripsina-EDTA al 0,05% durante tres minutos a temperatura ambiente. Cuando aproximadamente el sesenta por ciento de las células han flotado, detenga la digestión agregando el medio normal, dos veces el volumen de la enzima digestiva. Recoja la suspensión celular en un tubo cónico estéril de 15 ml para centrifugar a 200 xg durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet celular con el medio de reprogramación. Cuando haya terminado, coloque las células resuspendidas en un plato estéril de 60 milímetros. Cultive las células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%.
Después de cuarenta y ocho horas de infección por lentivirus en células HEK-293T, el éxito de la producción concentrada de lentivirus se evaluó observando la intensidad de fluorescencia de GFP o mediante citometría de flujo. Se encontró que el título del virus concentrado era alto en 10 a 8º TU/ml. Durante la reprogramación directa de los fibroblastos, la morfología celular cambió gradualmente a sinapsis celular alargada y núcleos celulares agrandados.
Sin embargo, las células envejecieron progresivamente después del día veinte. La eliminación de los factores de transcripción, Mitf, Pax3 o Sox10, resultó en el silenciamiento de la expresión de los genes melanocíticos, Tyr, Tyrp1 y Mlana, lo que indica el mayor impacto en la conversión de fibroblastos a melanocitos. Por lo tanto, la expresión de genes melanocíticos inducida por la programación directa con tres factores de transcripción fue mayor en comparación con seis factores de transcripción.
Para identificar melanocitos inducidos por MEF, o iMels, se detectó la expresión de marcadores melanocíticos, TYRP1 y DCT mediante tinción inmunofluorescente. Además, los métodos de tinción específicos de melanina como DOPA y tinción de Masson-Fontana mostraron resultados positivos. Las células 293T deben distribuirse uniformemente.
Además, la adición de mezcla de transfección a las células debe hacerse suavemente para evitar que las células floten. El protocolo es estable y práctico y se puede utilizar para reprogramar otros tipos de células. Se espera proporcionar una referencia y una estrategia para la reprogramación directa in vivo en la regeneración de melanocitos en la medicina futura.
